一种酪氨酸酶抑制剂及其制备方法和用途与流程

本发明涉及化妆品和医药技术领域，具体涉及一种酪氨酸酶抑制剂及其制备方法和用途。

背景技术：

皮肤白皙是女性所追求的美的重要标准之一，因而美白型化妆品日益成为化妆品领域的研究热点，许多动植物提取物因具有良好的美白效果且对人体无不良反应成为药学和化妆品行业研究的重点，越来越多的科研工作者倾向于从天然植物中寻找安全高效的美白活性物质。

黑色素是一种生物色素，人类皮肤的颜色主要取决于黑色素的含量与分布，黑色素细胞的结构功能和数量通常能直接影响皮肤中黑色素的含量。当皮肤受到紫外线照射或体内激素发生变化时，局部皮肤黑色素细胞产生黑色素量增加，在皮肤上产生色素沉着，严重的时候甚至形成黄褐斑。黑色素的合成主要在黑色素细胞内进行，酪氨酸经酪氨酸酶催化羟化为多巴并进而形成多巴醌，经5,6-二羟基吲哚(dhi)氧化酶和5,6-二羟基吲哚羧酸(dhica)氧化酶的作用形成黑色素。酪氨酸酶作为黑色素合成中的主要限速酶，它的活性大小决定着黑色素合成的数量，目前化妆品中的美白成分主要为酪氨酸酶抑制剂，通过阻断黑色素合成过程抑制黑色素的产生。关于美白实验，通常采用国际通用的b16f10黑色素瘤细胞株作为受试细胞，观察活性物质对该细胞黑色素生成的抑制作用来判断活性物质的美白效果。

茵陈蒿是中国的一味临床上经常使用的中药，具有清热利湿；退黄疸的作用。药理学研究有利胆，保护肝功能，解热，抗炎，降血脂，降压，扩冠等作用。但茵陈蒿采摘的时候，并不采摘根部，因此茵陈蒿根不被作为药材使用。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种新的酪氨酸酶抑制剂，该酪氨酸酶抑制剂包括茵陈蒿根部提取物。

本发明还提供了如上所述的酪氨酸酶抑制剂的制备方法。

本发明的目的还在于提供了如上所述的酪氨酸酶抑制剂的用途。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种酪氨酸酶抑制剂，包括茵陈蒿根部提取物。

优选的，所述酪氨酸酶抑制剂的剂型为外用的膏剂、油剂、水剂、粘贴剂、喷雾剂或粉剂。

优选的，所述酪氨酸酶抑制剂的剂型为口服用的片剂、散剂、口服液、胶囊剂、颗粒剂或糖浆。所述酪氨酸酶抑制剂在有效的剂量下，可以单独或者合并使用，通过合适的剂型显著而有效的达到美白效果。关于使用的剂型，根据消费者的使用目的而采取可以接受的剂型，例如，外用，口服或者注射，皮下用药，我们这里优选外用和口服。所使用的剂型外用包括，膏剂，油剂，水剂，溶剂可以为甘油，羊脂，凡士林以及各种可以使用的脂类；口服可以采用胶囊，片剂，口服液，糖浆等，辅料可以国家规定可以使用的各种果糖，淀粉等。如果需要还可以加上一些增湿，促溶，调节ph值得添加剂。上面所说的剂型对于专业人员来说都是非常熟悉的，这些方法专业书籍上都是记载非常详细的。但不管何种方法，都必须达到有效剂量。所述有效的剂量可为：茵陈蒿根部提取物和药用/化妆品用辅料的质量比为1-99％，优选是10-40％。可以预测的，茵陈蒿根部提取物也可与其他具有美白功效的成分组合使用，以起到更好的美白作用。

如上所述的酪氨酸酶抑制剂的制备方法，包括下述步骤：取茵陈蒿根部置于容器中，加入溶剂提取，收集提取液。

优选的，所述溶剂为体积分数为10％-90％的乙醇。

优选的，还包括如下步骤：收集所述提取液后向所述提取液中加入活性炭脱色。

如上所述的酪氨酸酶抑制剂在抑制黑色素生成中的应用。

如上所述的酪氨酸酶抑制剂在制备用于抑制黑色素生成的药物中的应用。

如上所述的酪氨酸酶抑制剂在制备治疗黄褐斑药物中的应用。

如上所述的酪氨酸酶抑制剂在制备化妆品中的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的酪氨酸酶抑制剂，该酪氨酸酶抑制剂来源于茵陈蒿根部提取物，可有效抑制酪氨酸酶的活性，有助于提高茵陈蒿的利用率。

本发明的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率可达70％以上。

本发明的酪氨酸酶抑制剂使用后可使黑色素的含量减少40％以上。

本发明的酪氨酸酶抑制剂制备方法简单，用途广泛。

【附图说明】

图1为实施例一制备得到的3批酪氨酸酶抑制剂样品对酪氨酸酶活性的抑制率与所述样品稀释比例的关系图，其中，横坐标中的数字：1代表稀释10倍，2代表稀释20倍，3代表稀释30倍，4代表稀释40倍，5代表稀释50倍。

图2为实施例一制备得到的3批酪氨酸酶抑制剂样品稀释倍数与细胞内黑色素含量的关系图，其中，纵坐标是细胞内黑色素含量，横坐标代表样品的不同稀释度，横坐标中的数字：1代表稀释10倍，2代表稀释20倍，3代表稀释30倍，4代表稀释40倍，5代表稀释50倍。

【具体实施方式】

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细描述：

实施例一、制备酪氨酸酶抑制剂。

第一批：

1)取茵陈蒿根部50克，粉碎；

2)加入10倍体积的蒸馏水，浸渍2h后进行渗漉，收集渗漉液，滤过；然后在加入6倍体积比80％的乙醇，浸泡1h，收集渗漉液，滤过。

3)二次滤液混合，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15g/ml(60～65℃)的清膏；

4)向步骤3)所得到的清膏中加6倍量水，冷藏，静置，滤过；

5)将经步骤4)处理得到的滤液120℃加热1h，冷藏，静置，加入0.2％活性炭，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15～1.20g/ml(60～65℃)的清膏，80℃真空干燥，即得。

三批样品都是以上述的工艺提取。

实施例二：验证实施例一制备得到的酪氨酸酶抑制剂在体外对酪氨酸酶活性的影响。

1.实验材料：小鼠皮肤黑色素瘤细胞(b16f10)，购买自中国科学院细胞库；实施例一制备得到的三个批次茵陈蒿根部提取物用dmem高糖培养基配成原始浓度为30％的样品，然后10倍比稀释。

2.小鼠皮肤黑色素瘤细胞(b16f10)培养：用dmem高糖培养基(含体积分数为10％的胎牛血清，含体积分数为1％的青-链霉素溶液)在37℃，5％co2饱和湿度环境进行培养，当细胞生长至近融合状态时可进行细胞传代，一般培养3d后可用0.25％的胰蛋白酶传代一次。当细胞生长至对数期，用pbs清洗后，用0.25％的胰蛋白酶消化，制备成细胞悬液，经过细胞计数板计数后，用培养基将细胞调整至适当浓度，接种于细胞板放入培养箱培养，每一次实验应采用同一传代细胞。

3.b16f10细胞内酪氨酸酶活性的测定：

处理组：在96孔板中加入细胞浓度为(7～8)×10⁴个/ml的细胞悬液100μl，待贴壁24h后，添加10μl不同浓度的样品，每一浓度设5个复孔。

空白组：以dmem高糖培养基代替样品溶液，其他操作与处理组相同。

将处理处和空白组分别置于37℃，5％co2条件下孵育24h后，弃去上清液。用ph7.4的pbs洗涤2次，每孔加质量分数为1％的辛基酚聚氧乙烯醚(tritonx-100)溶液50μl，迅速置于－80℃冻存30min，随后室温融化使细胞完全破裂，37℃预温5min后加入质量分数为1％的l-dopa溶液10μl，37℃反应2h，在酶标仪490nm处测其吸光度(实验数据详见说明书附图图1)。

图1中的纵坐标酪氨酸酶活性抑制率按以下公式计算：

抑制率＝(1－样品组平均吸光度/空白组平均吸光)×100％。

4.b16f10细胞内黑色素含量的测定：

处理组：在96孔板中加入细胞浓度为4.5×10⁴个/ml的细胞悬液，每孔100μl细胞悬液。在37℃，5％co2培养箱中培养24h后，加入10μl不同浓度的样品，每一浓度设5个复孔。

空白组：以dmem高糖培养基代替样品溶液，其他操作与处理组相同。

将处理组和空白组继续培养72h后，弃上清液，用pbs液洗2遍，加入100μl1mol/lnaoh液体，37℃水浴1h，充分裂解细胞后用酶标仪测定450nm波长的吸光度a(实验数据详见说明书附图图2)。

按以下公式计算黑色素含量(图2纵坐标)：

黑色素含量＝处理组吸光度/空白组吸光度

5.统计学方法分析：

5.1分析方法：使用spss17中文版软件，多组间比较采用单因素方差分析，p＜0.05为统计学差异。

5.2结果与分析：

5.2.1样品对b16f10细胞酪氨酸酶活性的影响：

茵陈蒿根部提取物对b16f10细胞酪氨酸酶活性的影响如图1所示，3个批次不同的提取物在浓度最高时能够明显抑制细胞内酪氨酸酶的活性，对酪氨酸酶的抑制能力呈现浓度依赖。在样品添加量为100％时，第一批次、第二批次、第三批次样品的抑制率分别为(47.38±0.08)％，(58.50±0.02)％，(74.21±0.01)％。在一定浓度范围内，抑制率随着样品添加量的降低而显著降低(p＜0.01)。

5.2.2样品对b16f10细胞内黑色素含量的影响：

茵陈蒿根部提取物对b16f10细胞内黑色素含量的影响如图2所示，不同浓度提取物作用下的b16f10细胞黑色素含量值均小于1，说明在每个添加量均能降低黑色素含量，且这种抑制效果较为明显。高浓度时，例如在不对实施例一制备得到的茵陈蒿根部提取物进行稀释时，其对黑色素生成的抑制效果最为显著，三个批次的提取物黑色素含量的值分别为：

第一批次黑色素含量＝0.59±0.02；

第二批次黑色素含量＝0.70±0.03；

第三批次黑色素含量＝0.56±0.08；

此时抑制酪氨酸酶活性最强，可见黑色素含量的下降与酪氨酸酶的有效抑制有关。

5.3结论：皮肤黑色素细胞的量及其合成黑色素的能力主要决定了皮肤颜色的深浅。实验采用小鼠b16f10黑色素瘤细胞作为细胞模型，研究了3个批次茵陈蒿根部提取物对细胞内酪氨酸酶活性和黑色素合成的影响。结果显示，茵陈蒿根部提取物，具有较高的安全性，能够在保证细胞安全生长的基础上抑制黑色素的生成。因此可以说，茵陈蒿根部提取物能抑制黑色素细胞生成黑色素，也能抑制细胞体内酪氨酸酶的活性，其具备较强的美白潜力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。