多潘立酮及其与紫杉醇联用在制备治疗癌症的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域。具体地说，涉及一种多潘立酮及其与紫杉醇联用在制备治疗癌症的药物中的应用。

背景技术：

据统计，癌症已成为一项严重的公共健康问题，严重威胁着人类的生命健康以及生存质量，是全球发病率死亡率最高的疾病之一。治愈癌症一直是科研工作者奋斗的目标。为了攻克癌症，各国的科研工作者付出了巨大的努力，也不断出现很多的新发现和治疗方法，但至今我们对癌症发生发展机制的了解还仍然有限。目前市场上有效的抗肿瘤药物依然稀少。

多潘立酮，5-氯-1-[1-[3-(2-氧代-1-苯并咪唑)丙基]4-哌啶基]苯并咪唑-2-酮(分子式：c22h24cln5o)作为胃动力和止吐药是比利时janson公司研制开发的。该药于1978年首先在比利时上市后陆续在德、意、英、日、法等国上市，目前已在世界各国广泛使用。多潘立酮作为外周多巴胺受体阻滞药，能直接作用于胃肠壁，可增加食管下部括约肌张力，防止胃-食管反流，增强胃蠕动，促进胃排空，协调胃与十二指肠运动，抑制恶心、呕吐，并能有效地防止胆汁返流，不影响胃液分泌。而且不易通过血-脑脊液屏障，对脑内多巴胺受体无抑制作用，因此，无锥体外系等神经、精神不良反应。临床广泛用于各种原因引起的呕吐、恶心，并取得较满意的疗效。但目前还没有采用多潘立酮抗癌的文献报道。

临床上，人们期待使用具有协同作用的组合治疗，这是由于：首先，协同组合中的每种组分可以适当降低用量，进而减少药物副作用的风险，其次，协同作用还可以显著提高治疗的整体效果。除此之外，耐药性也是困扰人们的重要问题，药物组合被认为是目前预防或延迟耐药性的最好方法。所以寻找具有协同效应的药物组合，对治疗癌症具有非常重要的意义。

而药物组合的治疗效果是难于预期的。例如，一些药物之间相互作用会降低治疗效果或引起不期望的副作用，这些药物通常被归类为具有拮抗作用；其他药物组合显示出单个药物效力叠加总和的治疗效力，这些组合被归类为具有相加作用。仅有当药物组合在治疗指数上大于单个药物的总和，才归类为具有协同作用。

目前还没有采用多潘立酮联合化疗药抗癌的文献报道。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种多潘立酮在制备治疗癌症的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种多潘立酮与紫杉醇联用在制备治疗癌症的药物中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种多潘立酮在制备治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为非小细胞肺癌。

多潘立酮自问世以来被人们广泛用于抑制在治疗癌症中所产生的恶心、呕吐等副作用，但对于其对癌症细胞本身的作用效果，一直被人们所忽视。而本发明首创的发现了单独施用多潘立酮对癌症细胞，特别是非小细胞肺癌细胞有毒性作用，可以获得控制癌症细胞增殖、诱导其凋亡的作用。并且此作用在体外及小鼠体内实验中均得到了验证，具备临床应用前景。

本发明通过大量实验对多潘立酮剂量浓度对癌症细胞的效果进行了研究，发现随着多潘立酮施用浓度的增加，抑制癌症细胞增殖的效果逐渐增强。在体外实验时当其浓度大于4um时，抑制效果理想。

在本发明的应用中，所述药物的活性成分以游离形式或可药用盐的形式存在。

所说的活性成分或其可药用的盐还可以依据施用情况的需求，以水合物或其它溶剂的形式使用。

在本发明的应用中，所述药物含有至少一种可药用载体。

在本发明的应用中，所述药物的给药方式为静脉注射、口服或局部给药。

本发明的药物可以用现有常规的方法进行制备，例如通过常规的混合、制粒、包糖衣、溶解或冷冻干燥法来制备的。其可包含治疗有效量的药理学活性成分或者还可以同时包含一种或多种可药用的载体。本发明药物优选的给药途径是口服给药。剂型可以是糖衣片、片剂、胶囊或栓剂。各剂型中单个剂量所包含的活性成分的单位含量本身不一定需要构成有效量，因为可以通过施用多个剂量单位来达到所必需的有效量。

在制备用于口服剂型的药物时，可以使用任何常规的药用介质，例如水、二醇类、油类或醇类；或在口服固体制剂例如粉剂、胶囊和片剂的情况中可使用载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等。本发明优选易于给药的片剂和胶囊，这时所使用的是固体药用载体。

本发明还提供一种多潘立酮与紫杉醇联用在制备治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为非小细胞肺癌。

现有治疗癌症时常规采用紫杉醇作为化疗剂控制癌症细胞，多潘立酮作为止吐剂缓解化疗剂所带来的副作用，其是分别利用多潘立酮与紫杉醇各自的原有效果设定的治疗方案。本发明突破性的发现了这两种常规药物可产生协同作用，打破了原有的用药思路，为治疗癌症，尤其是非小细胞肺癌提供了新的替代方案。此方案通过将即止吐又能发挥协同作用的多潘立酮与紫杉醇联用得到了一种新的药物，此药物可以在保证原有治疗效果的同时，通过控制对造血系统和免疫系统毒副作用较强的紫杉醇的用量，实现降低副作用的效果，也可通过整体较低的活性成分剂量和/或更低的施用频率来减少副作用的发生率，从而缓解患者的痛苦。

在本发明的应用中，所述药物的单位制剂中，所述多潘立酮与所述紫杉醇的质量比为100：(1-40)；优选为100：7。

本发明的组合中所用的各活性成分的有效剂量可以根据所用的特定化合物或药物组合物、给药方式、所治疗病症的严重程度而变化。优选的，在该联合制剂中被给药的两种活性成分的总量的比例可以进行变化，例如根据不同需求的单个患者的需要而进行变化。

在本发明的应用中，所述药物的活性成分以游离形式或可药用盐的形式存在，和/或，所述药物含有至少一种可药用载体。

在本发明的应用中，所述多潘立酮与所述紫杉醇可以联合、分开或相继给药。

本发明的活性成分多潘立酮与紫杉醇可以被独立给药，或者可以使用具有特定含量的各成分不同的固定组合给药，即可以将其同时给药或在不同的时间点、以任何次序相继进行给药。该各部分的试剂盒可以被同时给药或按时间顺序交错给药，即在不同的时间点以相等或不等的时间间隔将该各部分的试剂盒的任何部分进行给药。优选，采用能最大化发挥其协同作用的时间间隔。

在本发明的应用中，所述药物的给药方式为静脉注射、口服或局部给药中的一种或多种。

本发明优选将活性成分多潘立酮通过片剂或胶囊给药，活性成分紫杉醇通过静脉注射给药。

本发明的药物也可以用现有常规的方法(常规方法的描述同上)进行制备，其可包含治疗有效量的药理学活性成分或者还可以同时包含一种或多种可药用的载体。各剂型中单个剂量所包含的活性成分的单位含量本身不一定需要构成有效量，因为可以通过施用多个剂量单位来达到所必需的有效量。

本发明的有益效果至少在于：

基于多潘立酮常规作为止吐药物在临床上降低化疗副作用的使用，本发明还发现了多潘立酮具备抗癌的作用，拓展了多潘立酮的适应症，并为癌症患者带来了新的希望。

本发明涉及使用多潘立酮结合抗肿瘤常用的化疗药的协同组合在制备治疗癌症的药物中的应用，其中化疗药选自抗肿瘤的紫杉醇。

紫杉醇作为临床常用的广谱抗肿瘤药物，因其历史久远且抗癌效果明确，得到了广泛的认可。但同时由于其对造血系统和免疫系统的毒副作用较强使其临床应用受到一定的限制。本发明采用多潘立酮与其联用获得的药物，既实现了协同抗癌作用(显示协同治疗性细胞毒作用)，提升了抗癌的效果，又使得在保证原有抗癌效果的同时使降低其用量、减少副作用、预防或延迟其耐药性成为了可能。

附图说明

图1-图3为本发明实施例1的细胞增殖抑制效果测试方案(含组分配比及所用剂量)及结果图，其中，纵坐标为增值率(proliferationrate)；

图4、图5为本发明实施例2中h460细胞凋亡测试结果图，其中图5的纵坐标为细胞凋亡百分比；

图6、图7为本发明实施例3中h460细胞体内测试结果图，其中图7的纵坐标为重量(weight)，单位为克；

图8为本发明实施例4的细胞增殖抑制效果测试结果图，纵坐标为增值率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法、市售产品。

本发明中所用主要实验材料及仪器为：

细胞株：人肺癌细胞系h460(中国医学科学院基础医学研究所)；多潘立酮(北京赛而生物药业有限公司)；dmem/f12、rpmi-1640培养基、胰蛋白酶、pbs(美国gibco公司)；紫杉醇(sigma-aldrich公司)；96孔细胞培养板、6孔细胞培养板(美国corning公司)；cellcountingkit-8试剂(同仁化学研究所)；annexinv/pi凋亡试剂盒(美国bd公司)

实施例1

将多潘立酮与紫杉醇分别用药及联合用药作用于非小细胞肺癌细胞系h460，并测试其细胞增殖抑制效果。

分别用不同浓度的多潘立酮和紫杉醇单独、联合作用于非小细胞肺癌细胞系h460，所用浓度及方式参见图1至图3，施用单位为μm(um)。通过cck-8检测细胞活力的方法检测其对h460的增殖抑制效果，结果见图1至图3。当单独采用多潘立酮时，其显示出了抑制非小细胞肺癌细胞系h460增殖的效果。且随着多潘立酮施用浓度的增加，抑制效果逐渐增强。

当多潘立酮用量不变(5μm、7μm)时，对应不同浓度的紫杉醇，都显示出了协同作用，大大优于单独采用紫杉醇的增殖抑制效果。

细胞增殖效果检测的具体步骤为：

i.取对数生长期的细胞，以3×104/ml细胞浓度将h460细胞接种于96孔板(96孔细胞培养板)，每孔100ul。

ii.细胞贴壁生长24小时后，加入不同浓度的多潘立酮以及紫杉醇，每组3-6个平行孔。

iii.48小时后，配制cck-8混合液，即cck-8试剂：培养基(无酚红培养基dmem/f12)＝1：9(体积比)，小心吸取96孔板中的液体，加入100ul的cck-8混合液。

iv.置于37℃培养箱中孵育1小时。

v.放入酶标仪中读数，在450nm处测其光密度值[od(450)值]。

vi.统计分析。

实施例2

检测多潘立酮和紫杉醇在单独用药和联合用药下诱导h460细胞凋亡的情况。

细胞接种后，加药，培养48小时后收集细胞，按照bd公司的annexinv/pi凋亡试剂盒说明书对细胞进行处理后通过流式分析对细胞凋亡进行检测，annexinv+/pi-细胞代表处于凋亡早期的细胞，annexinv+/pi+代表处于凋亡晚期的细胞，annexinv-/pi+代表坏死的细胞。结果见图4、图5，a：多潘立酮5μm、b：紫杉醇0.1um、c：多潘立酮5μm+紫杉醇0.1um，图5纵坐标为细胞凋亡百分比(凋亡早期的细胞百分比+凋亡晚期的细胞百分比)。可以看出单独用药和联合用药可引起不同程度的annexinv+细胞增加，单独采用多潘立酮显示出可使h460细胞凋亡的效果。

进一步联合紫杉醇给药，效果要远好于单独用药的结果，从单独采用紫杉醇的13.95％凋亡增长到39.47％凋亡，显示出多潘立酮与紫杉醇具有显著协同作用。

用annexinv/pi方法检测细胞凋亡的具体步骤为：

i.取对数生长期细胞接种于细胞培养皿(6孔细胞培养板)中，培养24小时待细胞贴壁后按照预设浓度(a：多潘立酮5μm；b：紫杉醇0.1um；c：多潘立酮5μm+紫杉醇0.1um)加入多潘立酮以及紫杉醇，处理48小时。

ii.根据实验所需用量用去离子水稀释凋亡试剂盒中的10×bindingbuffer，即bindingbuffer：去离子水＝1:9。

iii.细胞收集：用不含edta的质量浓度0.25％的胰酶消化细胞，室温1000转离心5分钟。

iv.细胞洗涤：用4℃预冷的pbs重悬细胞，1000转离心5分钟，清洗细胞，重复一遍，再用1x的bindingbuffer清洗一遍。

v.加300ul1x的bindingbuffer重悬细胞。

vi.annexinv-fitc标记：加入5ul的annexinv-fitc混匀后，避光。

vii.放入旋转仪中，室温避光孵育10到15分钟。

viii.pi标记：上机前5分钟加入5ul的pi染色。

ix.上机分析前补加200ul的1xbindingbuffer。

x.上机(流式细胞仪，bio-rad公司)分析。(样品准备好后4小时内上机分析，2-8度避光保存)。

实施例3

将h460肿瘤细胞接种至免疫缺陷型scid小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)体内观察其成瘤情况，以检测多潘立酮和紫杉醇单用及联用对肿瘤细胞的体内作用。

首先，将h460细胞在肿瘤细胞培养基dmem或rpmi-1640中培养2天，收集肿瘤细胞，消化(加入质量浓度0.25％的胰酶消化1分钟后马上加入两倍体积的培养基)，计数，根据预实验找到的最适的细胞接种量调整细胞密度并梯度稀释为5×105，将细胞悬液和人工细胞基底膜(matrialgel)按照1：1体积比例混合，接种总体积为100ul，接种至小鼠腋部皮下。多潘立酮组(6只)每天给药，给药剂量为0.25mg/g，紫杉醇组(6只)每三天给药一次，给药剂量为0.05mg/g。多潘立酮+紫杉醇组(6只)每天多潘立酮给药0.25mg/g，紫杉醇每三天给药0.05mg/g。给药20天后(多潘立酮共给药20次，紫杉醇共给药7次)处死小鼠，解剖并取出肿瘤、拍照、测量、称重。结果见图6、图7。

从图中肿瘤大小及重量(各组平均值)可以明显的看到多潘立酮单独及其联合紫杉醇给药组小鼠的肿瘤小于对照组(对照组肿瘤平均重量为0.9343g，单独给药多潘立酮的肿瘤平均重量为0.7915g，单独给药紫杉醇的肿瘤平均重量为0.6423g，采用多潘立酮联合紫杉醇给药的肿瘤平均重量为0.3225g，)，再次证实了多潘立酮单独施用的效果及联用紫杉醇时所产生的协同作用。

本发明以多潘立酮及其与紫杉醇联用为研究对象。通过检测增殖抑制效果、检测细胞凋亡情况、对scid小鼠进行腋下接种肿瘤细胞进行体内实验，验证了多潘立酮单独在治疗癌症药物上的应用效果及其联合紫杉醇在治疗癌症药物中具有协同效应。

实施例4

采用实施例1的测试方式，在相同实验条件下以不同浓度多潘立酮单独作用于非小细胞肺癌细胞系h460，测试其细胞增殖抑制效果。

由图8可知，随多潘立酮的施用浓度的增加，其抑制效果加强。当其浓度为大于4um时，可实现理想的抑制效果，优选4-10um。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。