动脉内皮细胞种植的血管移植物的生成的制作方法

动脉内皮细胞种植的血管移植物的生成
相关申请的交叉引用
1.本申请要求2018年8月31日提交的美国申请第62/725,469号的优先权，该申请通过引用纳入本文如同其全文记载于此。联邦资助研发声明
2.本发明得到国家卫生研究院第hl134655号政府资助。政府对本发明拥有一定的权利。


背景技术：

3.心血管手术中的一个常见步骤是替换血管或搭建血管旁路，由此为下游组织提供更充足的血流。在冠动脉旁路手术中，动脉移植物比静脉移植物有更好的长期通畅率。然而，如果手术需要多个移植物，通常会使用静脉，因为患者缺乏合适的更多动脉移植物。在外周动脉疾病的旁路手术中，要搭建旁路的动脉通常很大，以至于没有合适的动脉移植物。同样，尽管长期闭塞率相对较高，但仍经常使用静脉移植物。
4.许多明显的缺点与用移植患者自己的血管进行旁路手术相关。切取血管并准备移植所需的时间增加了患者的麻醉暴露，增加了术后感染的机会，增加了手术的成本。对于许多患者来说，由于血管疾病或先前的手术，根本没有合适的动脉或静脉可用来移植。
5.由于使用患者自身血管作为移植物的局限性，人们进行了许多尝试用合成材料制造血管移植物。虽然合成移植物通常适用于涉及最大直径血管(如主动脉)的治疗，但血管尺寸越小合成移植物的长期通畅率越低。对于腿部外周动脉疾病而言，当没有合适的静脉移植物时，合成移植物是最不得已的选择，因为这个位置的合成移植物比静脉移植物闭塞率更高。对于涉及更小的心脏动脉(直径约3
‑
5mm的血管)的旁路手术，合成移植物的失败率非常高，以至于目前不采用合成移植物。
6.一研究组发现，通过在合成eptfe材料上涂覆患者自身的静脉内皮细胞，他们可以提高外周动脉疾病中eptfe移植物的长期通畅率，使其与静脉移植物的长期通畅率大致相当(deutsch等，1999年)。然而，这一过程需要另外手术获取患者的静脉、培养扩增静脉内皮细胞、将静脉内皮细胞涂覆在eptfe管上，继续培养使eptfe上的细胞成熟，最后将eptfe/静脉内皮细胞移植物移植回患者。从静脉采集到移植的整个过程大约需要一个月(deutsch等，2009年)。因此，这个过程既昂贵又缓慢。约1/3的外周动脉疾病患者迫切需要介入治疗，不能等待30天—这是生产eptfe/自体静脉内皮细胞移植物所需的时间。而且，因为免疫排斥，这种方法只能进行患者个体治疗，不能扩大成多患者治疗。最后，尽管静脉内皮细胞涂覆eptfe移植物的通畅率比标准eptfe移植物的通畅率有显著提高，但这些通畅率仍然只是接近静脉移植物的长期通畅率，仍然不及动脉移植物。
7.动脉内皮细胞与静脉内皮细胞相比存在关键生物学特征上的差异，诸如白细胞粘附力更低而一氧化氮(no)生成更高，这对维持血管移植物的长期通畅至关重要。由患者获取原代动脉内皮细胞在医学上不可行，并且，原代动脉内皮细胞体外培养会发生去分化，因此，动脉内皮细胞涂覆的聚合物移植物从未用于临床。因此，本领域仍然需要改进的包含动
脉内皮细胞的聚合物血管移植物，此类改进的移植物是可规模化的、可作为按需产品取用的、并且适合多患者。


技术实现要素：

8.内容之一，在此提供一种血管移植物，包含或基本上由以下所述组成：(a)被内皮细胞附着剂至少部分涂覆的聚合物基材和(b)粘附在所述被涂覆聚合物基材上的人动脉内皮细胞。聚合物基材可选自膨化聚四氟乙烯(eptfe)、聚氯乙烯(pvc)、pga(聚乙醇酸)、pla(聚乳酸)、pcl(聚己内酯)、pgla(聚乳酸
‑
共乙醇酸)、聚氨酯、聚二氧杂环己酮、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯四氟乙烯(tfe)、聚四氟乙烯(ptfe)、丝、脱细胞支架、细胞外基质蛋白基支架、透明质酸、壳聚糖和聚羟基链烷酸酯。内皮细胞附着剂可包含多巴胺、纤维蛋白胶、rgd肽、玻连蛋白和层粘连蛋白中的一种或多种。与静脉内皮细胞种植的聚合物基材相比，所述血管移植物的白细胞粘附减少。相比没有人动脉内皮细胞包裹的聚合物基材，所述血管移植物可表现出以下一项或多项：(a)血栓形成减少，(b)长期通畅率提高，和(c)血小板粘附减少。人动脉内皮细胞可产自人多潜能干细胞。人多潜能干细胞可以是诱导多潜能干细胞。诱导多潜能干细胞可以是患者自体的。诱导多潜能干细胞可以与患者至少50％hla匹配。人动脉内皮细胞可以是对血管移植物受主无免疫原性的。人动脉内皮细胞可包含一个或多个基因修饰从而不表达β2微球蛋白基因。人动脉内皮细胞可包含一个或多个基因修饰从而不表达一种或多种i类或ii类主要组织相容性复合体(mhc)基因编码的蛋白质。人动脉内皮细胞可包含一个或多个基因修饰从而不表达cd58多肽。人动脉内皮细胞可包含一个或多个修饰从而过表达hla
‑
e(e二聚体)和cd47之一或两者。
9.另一方面，在此提供一种形成细胞种植血管移植物的方法，所述方法包括或基本上由以下所述组成：(a)用内皮细胞附着剂涂覆聚合物基材；(b)将人动脉内皮细胞种植在经涂覆的聚合物基材上；和(c)培养细胞种植的经涂覆的聚合物基材约2至约20天，由此获得细胞种植的血管移植物。所述方法还可包括在用一种或多种内皮细胞附着剂涂覆之前对所述聚合物基材进行脱气。脱气可包括在丙酮和乙醇中洗涤所述聚合物基材，在有机溶剂中洗涤所述聚合物基材，或施加真空。聚合物基材可选自膨化聚四氟乙烯(eptfe)、聚氯乙烯(pvc)、pga(聚乙醇酸)、pla(聚乳酸)、pcl(聚己内酯)、pgla(聚乳酸
‑
共乙醇酸)、聚氨酯、聚二氧杂环己酮、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯四氟乙烯(tfe)、聚四氟乙烯(ptfe)、丝、脱细胞支架、细胞外基质蛋白基支架、透明质酸、壳聚糖和聚羟基链烷酸酯。所述方法还可包括将所述细胞种植血管移植物与低温保存溶液接触并冷冻接触后的细胞种植血管移植物。冷冻可包括在1℃至约
‑
196℃的温度下储存。
10.另一方面，在此提供一种制造aec细胞种植的血管移植物的方法，所述方法包括或基本上由以下所述组成：用一种或多种内皮附着剂涂覆聚合物基材的至少一部分；以及使人动脉内皮细胞接触经涂覆的聚合物基材，从而形成基本上不粘附白细胞或其细胞碎片的aec种植的血管移植物。聚合物基材可选自膨化聚四氟乙烯(eptfe)、聚氯乙烯(pvc)、pga(聚乙醇酸)、pla(聚乳酸)、pcl(聚己内酯)、pgla(聚乳酸
‑
共乙醇酸)、聚氨酯、聚二氧杂环己酮、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯四氟乙烯(tfe)、聚四氟乙烯(ptfe)、丝、脱细胞支架、细胞外基质蛋白基支架、透明质酸、壳聚糖和聚羟基链烷酸酯。所述方法还可包括在用一种或多种内皮细胞附着剂涂覆之前对所述聚合物基材进行脱气。脱气可包括在丙
酮和乙醇中洗涤所述聚合物基材，在有机溶剂中洗涤所述聚合物基材，或施加真空。
11.通过下面的描述，将更好地理解本发明的这些和其他特征、内容和优点。本说明书中，优选实施例不构成对本发明的限制。因此，本发明的范围仅由权利要求来解释。
附图说明
12.附图构成本说明书的一部分，并且包括在说明书中用于进一步展示本文所述组合物和方法的某些内容。。参照这些附图中的一幅或者多幅并结合具体实施方式的详细描述可更好地理解本发明。
13.图1a
‑
1b中的图像显示种植在涂有粘附剂的膨化聚四氟乙烯(eptfe)上的cd31
+
aec。(a)aec种植在eptfe上，细胞密度为1
×
106个细胞/ml至1.5
×
106个细胞/ml。染色检测活细胞(绿色；以细胞渗透染料钙黄绿素am染色)。细胞融合度的统计数据表示为平均值
±
sd，n＝3。(b)种植在涂有i型胶原、rgd(arg
‑
gly
‑
asp)肽、纤连蛋白(fn)、层粘连蛋白、基质胶和vtn(玻连蛋白)的eptfe上的cd31
+
(红色)aec。用dapi(4
′
,6
‑
联脒
‑2‑
苯基吲哚)荧光染色显示细胞核。细胞融合度的统计数据表示为平均值
±
sd，n＝3。
14.图2a
‑
2d显示多巴胺涂覆提高人动脉内皮细胞(aec)与膨化聚四氟乙烯(eptfe)基材的粘附性。(a)含或不含多巴胺涂层的eptfe。(b)aec种植在eptfe上，细胞密度为1
×
106个细胞/ml至1.5
×
106个细胞/ml。染色检测并计数活细胞(绿色；以细胞渗透染料钙黄绿素am染色)和死细胞(红色；用核酸染色剂乙锭均二聚物
‑
1染色)。(c)对照和多巴胺涂覆基材上活aec和死aec的统计。数据表示为平均值
±
sd。*:p<0.05，n＝3。(d)多巴胺涂覆和纤维蛋白胶涂覆eptfe上aec粘附的比较。
15.图3a
‑
3b显示白细胞粘附检测的结果。(a)将aec和人脐静脉内皮细胞(huvec)种植于多巴胺涂覆的eptfe上。将细胞种植后的eptfe基材培养3天，然后用10ng/ml tnfα或对照处理4
‑
5小时。通过暴露于2μm钙黄绿素am约15分钟进行白细胞染色。然后将钙黄绿素am标记的白细胞按约1
×
106个细胞/ml的细胞密度加入aec
‑
种植和huvec
‑
种植的eptfe中。将钙黄绿素am标记的白细胞悬浮液和eptfe都置于0.5ml管中，将管60rpm旋转1小时。1小时后，将细胞种植的eptfe用新鲜培养基温和洗3次，然后固定并用dapi染色成像。(b)白细胞粘附检测统计。通过免疫染色检测白细胞，并对每幅图像进行计数。数据表示为平均值
±
sd。*：p<0.05，n＝3。
16.图4a
‑
4c显示，eptfe脱气可避免细胞聚集体形成，并提高cd31表达和细胞密度。(a)将动脉内皮细胞种植在eptfe上，进行或不进行脱气处理。使用两种类型的eptfe，即1和2。细胞种植后2天和8天采集样本进行免疫染色。箭头指示细胞聚集体，在脱气处理后无法测到。(b)细胞密度统计。通过比较第8天脱气前和脱气后的细胞核数来确定细胞种植基材上的细胞密度。数据表示为平均值
±
sd。*：p<0.05，n＝4。(c)cd31相对平均荧光强度(mfi)的统计。数据表示为平均值
±
sd。*：p<0.05，n＝4。
17.图5a
‑
5c显示冷冻介质分析。(a)甘油不适合用于冷冻aec
‑
eptfe。(b)比较recovery
tm
细胞培养冷冻培养基(thermofisher公司)、10％dmso和血清对aec
‑
eptfe的冷冻效果。(c)dmso浓度优化。用无血清无异源物(xeno
‑
free)培养基冷冻aec
‑
eptfe，该培养基由添加100ng/ml fgf2、50ng/ml vegfa、10μm sb431542、5μm resv和20μg/ml胰岛素的e5培养基制成。
具体实施方式
18.说明书中所引用的所有出版物包括但不限于专利和专利申请均通过引用纳入本文，如同它们全文记载于此。
19.本发明至少部分地基于发明人对动脉内皮细胞种植的聚合物血管移植物的开发，其中，所述血管移植物和获得它们的方法是可规模化的、可作为按需产品取用的、并且适合各种患者。
20.i.组合物
21.内容之一，在此提供包含动脉内皮细胞的聚合物血管移植物。所述移植物可包含或基本上由至少部分涂覆了内皮细胞附着剂的聚合物基材和粘附在经涂覆聚合物基材上的动脉内皮细胞(aec)构成。如本文所述，本文所述aec种植的聚合物移植物相对于传统聚合物血管移植物表现出通畅度提高。一些情形中，与本文所述聚合物血管移植物联用的人动脉内皮细胞经修饰从而可作为通用供体细胞用于移植给需要移植的对象，不论移植物受主的hla
‑
型和血型如何。例如，一些实施方式中，对细胞的天然基因组进行工程化改造，从而使得工程化细胞不表达某些细胞表面标志物，例如ii类或i类和ii类主组织相容性复合体基因两者编码的蛋白质。这样，基因工程化细胞更有可能逃避移植物受主t细胞的攻击，因此对受主没有免疫原性。
22.术语“移植物”和“血管移植物”在本文中可互换使用，并指旨在用作输送流体(例如血液)并因此具有流体接触(即“管腔”)表面的修复装置的任何导管或其部分。虽然移植物主要为管状形式，但移植物也可以是用于修补活血管周壁各部分的部分管材或片材(这些材料通常被称为心血管补片)。同样地，术语血管移植物包括用于活血管内的腔内移植物。例如，本文提供的血管移植物可用作植入式血管支架的外表面、管腔表面或管腔表面和外表面上的鞘层或其它覆盖物。
23.本文中，术语“aec种植(的)”及其语法变体指基材上提供有动脉内皮细胞。优选地，该术语指承载动脉内皮细胞(例如人aec)和内皮细胞粘附剂的聚合物血管移植物，由此使得所述细胞种植的聚合物血管移植物适合植入对象。
1.本文中，术语“通畅率(patency)”指诸如血管或血管移植物等管路的开放程度。畅通率100％的血管移植物即没有任何阻塞或堵塞。阻塞或堵塞程度增加则血管或移植物的通畅率降低。以这种方式，血管或血管移植物的通畅率可代表移植成功或失败。一些情形中，在特定的时间点评估通畅率，包括但不限于血管移植物植入后数天、数周、数月或数年的通畅率。优选地，本文所述的聚合物血管移植物相比传统聚合物血管移植物表现出长期通畅率提高。本文中，“长期通畅”指血管或移植物植入后在生理环境中保持通畅超过1年、优选超过3年、更优选超过5年、最优选10年或更长时间。一些情形中，本文所述aec细胞种植的聚合物血管移植物表现出与自体移植物相当的通畅率，更好地是优于自体移植物的通畅率。
24.a.组合物的材料
25.在此提供的聚合物血管移植物包含至少部分涂覆有内皮细胞附着剂的聚合物基材和粘附于所述涂覆聚合物基材的人动脉内皮细胞。适合本文所述血管移植物的聚合物材料包括但不限于：聚氯乙烯(pvc)、pga(聚乙醇酸)、pla(聚乳酸)、pcl(聚己内酯)、聚乳酸
‑
共乙醇酸(plga)、聚氨酯、聚二氧杂环己酮、聚对苯二甲酸乙二酯聚乙烯、以及
氟聚合物，例如四氟乙烯(tfe)、聚四氟乙烯(ptfe)和膨化聚四氟乙烯(eptfe)。ptfe是四氟乙烯(tfe)的均聚物。当ptfe延展并膨胀成eptfe时，聚合物材料特别适合血管应用，因为它表现出低血栓形成性，并且能够被挤塑成管、片或其他合适的移植物形状。一些情形中，聚合物基材是gore
‑
血管移植物。
26.一些情形中，生物材料适用于本发明的聚合物基材。例如，聚合物基材可包含生物材料，包括但不限于丝、脱细胞构建物(例如脱细胞动脉、静脉或小肠)、基于细胞外基质蛋白的支架(例如胶原、基质胶tm(matrigeltm)、纤维蛋白、弹性蛋白)、透明质酸、壳聚糖、聚羟基链烷酸酯。
27.一些情形中，用于本文所提供的血管移植物的聚合物基材是生物相容性的，这意味着基材材料在植入或置入从而与身体接触时不会引起不良反应。
28.一些情形中，聚合物基材是多孔基材。不受任何作用模式或理论的约束，据信，聚合物血管移植物中的孔隙能使宿主的细胞募集和整合到移植物中。例如，eptfe表现出高孔隙率并且包含结点(nodes)和原纤维构成的基质。原纤维是结点间的细连接，尺寸为亚微米级。细原纤维用来在膜中产生更多的曲折度和表面积，对过滤效率有影响。一些情形中，对膜中的原纤维和结点的几何形状进行修饰(例如增加或减小(少)孔径、孔分布)以定制材料的功能性。一些情形中，结点间(intermodal)距离优选约7μm至约20μm。一些情形中，聚合物基材是微孔的，这意味着多孔基质的孔隙具有微米级的尺寸。优选地，合适的聚合物基材的孔径在如下范围内并优选覆盖所述范围，2微米到80微米，优选3微米到40微米，最优选5微米到35微米，尤其30微米左右。
29.一些情形中，本文所述血管移植物基本上呈管状，具有圆形或基本上圆形的横截面。
30.本文所述血管移植物基本上呈管状，具有圆形或基本上圆形的横截面。一些情形中，管状结构的壁厚约200μm至约500μm(例如约200、250、300、350、400、450、500μm)。其他一些情形中，聚合物基材是聚合物材料的平片或“补片”。此类情形中，厚度可在约0.2mm至约1.0mm或更大范围内变化。
31.本文所述聚合物血管移植物的各类尺寸可根据所需用途而变化。原则上，尺寸与血管移植物所替代的宿主组织的尺寸相近。一般来说，管状移植物具有在整个移植物长度上延伸的管腔。本文提供的血管移植物的管腔可以具有适合移植物预期外科用途的任何适当直径。例如，文献中很好地描述了冠状动脉的平均管腔尺寸，包括闭塞发生率较高的那些(前室间动脉、右冠状动脉、回旋动脉)。一些情形中，聚合物基材具有约0.5mm至约10mm的内径(例如约0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mm)。血管移植物可以具有适合移植物预期外科用途的任何适宜长度。通常，移植物的长度应略长于要替换的动脉或静脉的长度。
32.一些情形中，用于本文提供的血管移植物的聚合物基材是疏水膜，这意味着它们抗流体(例如生物流体)润湿并且不被生物流体化学改变或降解。一些情形中，疏水膜对流体不渗透，但允许气体透过膜流通。
33.一些情形中，聚合物基材以内皮细胞粘附剂至少部分涂覆。可用于本发明血管移植物的内皮细胞粘附剂包括但不限于多巴胺、纤维蛋白、rgd(arg
‑
gly
‑
asp)
‑
肽和细胞外基质蛋白(例如玻连蛋白和层粘连蛋白)，或两种或两种以上粘附剂的混合物。传统上，用凝血蛋白纤维蛋白(fb)网络(有时被称为“纤维蛋白粘合剂”或“纤维蛋白胶”)来涂覆血管移植
物。例如，zilla等(1989)描述了采用纤维蛋白胶的eptfe上改良的静脉内皮细胞种植。然而，纤维蛋白胶方法涉及多个步骤，因此难以扩大到临床应用。参见图2a
‑
2b，发明人证明，其他细胞粘附剂可在聚合物基材上达到相当水平的aec粘附。有利的是，用这些物质涂覆聚合物基材只需一个步骤。另有报道称，与fb涂覆(p<0.001)或纤维蛋白与纤连蛋白混合物(p<0.05)涂覆的血管假体相比，层粘连蛋白涂覆的血管假体上静脉内皮附着性得到改善。见chlupac等，physiol.res.，63:167
‑
177，2014。
34.优选地，内皮细胞粘附剂是非免疫原性的。例如，内皮细胞粘附剂优选不含任何衍生自非人动物的成分，因此不含异源物质(“无异源物”(“xeno
‑
free”))。本文中，术语“不含异源物质”和“无异源物”可互换使用，指材料(例如细胞基质、培养基)或细胞培养条件不含除培养细胞或材料受主以外物种的任何细胞或细胞产物。
35.一些情形中，内皮细胞粘附剂包含多巴胺，其中多巴胺以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度溶解在缓冲溶液中(例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20mg/ml多巴胺)。内皮细胞粘附剂包含rgd肽的情况下，可将肽包含在缓冲溶液中提供，浓度可为约0.5mm至约10mm(例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mm rgd肽)。一些情形中，内皮细胞粘附剂包含玻连蛋白。一些情形中，玻连蛋白含于缓冲溶液中提供，浓度约1μg/ml至约50μg/ml(例如约1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/ml玻连蛋白)。本文中，术语“玻连蛋白”指玻连蛋白多肽或其片段或肽，且包含重组玻连蛋白多肽及肽(例如重组人玻连蛋白)及玻连蛋白多肽变体，例如美国专利第9,133,266号中所述，该专利通过引用纳入本文中如同其全文记载于此。一些情形中，内皮细胞粘附剂包含层粘连蛋白。一些情形中，层粘连蛋白含于缓冲溶液中提供，浓度约1μg/ml至约50μg/ml(例如约1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/ml层粘连蛋白)。本文中，术语“层粘连蛋白”指层粘连蛋白多肽或其片段或肽，且包含重组层粘连蛋白多肽和肽(例如重组人层粘连蛋白)。
36.一些情形中，聚合物基材可用包含内皮细胞粘附剂的溶液部分或全部涂覆或浸入其中约4至约24小时。在内皮细胞粘附剂溶液中浸涂可在任何适宜温度进行，包括但不限于4℃、25℃(室温)或37℃。优选地，经涂覆的聚合物基材使用前用蒸馏水或缓冲溶液淋洗。
37.一些情形中，在用内皮细胞粘附剂至少部分涂覆之前对聚合物基材物质进行脱气是有利的。如后文实施例中所述，发明人证明，聚合物基材用前脱气减少细胞聚集体形成，提高细胞密度并且改进内皮粘附剂的涂覆。脱气可用本领域熟知的方法进行。如实施例中所述，可在一系列丙酮和乙醇洗涤中对聚合物基材进行脱气。一些情形中，如前所述进行脱气，但用有机溶剂代替丙酮。另一些情形中，用前可对基材施加高能真空进行脱气。
38.一些情形中，动脉内皮细胞按约0.5
×
106个细胞/ml至约3
×
106个细胞/ml的细胞密度种植在经涂覆(例如部分或完全涂覆)并脱气的聚合物基材上。一些情形中，aec按约1
×
106个细胞/ml至约1.5
×
106个细胞/ml的密度种植在备好的聚合物基材上。
39.可将aec包含在任何合适的细胞培养基中用于种植在聚合物基材上。例如，可将aec包含在化学组成明确的无异源物质、无血清且无白蛋白的细胞培养基中提供。本文中，术语“化学组成明确的培养条件”、“完全明确的无生长因子培养条件”和“完全明确的条件”表示每种培养基成分属性及其含量都知道，并且支撑表面的属性及其数量都知道。本文中，“无血清”指培养基不含血清或基本上不含血清。例如，基本上无血清的培养基中的血清可
少于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％。本文中，术语“无白蛋白”表示所用培养基未添加任何形式的白蛋白(例如血清替代物)，包括但不限于牛血清白蛋白(bsa)或任何形式的重组白蛋白。优选地，在化学组成明确的细胞培养基中将人aec种植到聚合物基材上，所述细胞培养基不含任何异源物质，即不含任何衍生自非人动物的成分。
40.一些情形中，通过将aec悬浮液注入管状血管移植物的管腔并将移植物至于旋转装置中来进行种植。一些情形中，种植之后，在培养瓶中用新鲜培养基、不旋转、在适合细胞生长的任何温度下(例如室温下或优选37℃)使细胞种植的基材成熟。例如，一些情形中，种植后在含有新鲜培养基的培养瓶中在加湿培养箱中不旋转、37℃成熟2
‑
3天。一些情形中，aec种植的移植物在5％co2存在下培养。
41.一些情形中，在用于以aec种植聚合物基材的细胞培养基中加入rho激酶(rock)抑制剂可能是合适的。已知激酶抑制剂，如rock抑制剂，可提高单细胞和小细胞聚集体的接种效率和活度。参见例如，美国专利申请公开2008/0171385，该公开文本通过引用纳入本文如同其全文记载于此；watanabe k等，“a rock inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stemcells(rock抑制剂可保持分离人胚胎干细胞存活)”，nat.biotechnol.25:681
‑
686(2007)。适用于本发明的rock抑制剂包括但不限于：(s)
‑
(+)
‑2‑
甲基
‑1‑
[(4
‑
甲基
‑5‑
异喹啉基)磺酰基]高哌嗪二盐酸盐(非正式名称：h
‑
1152)，1
‑
(5
‑
异喹啉磺酰基)哌嗪盐酸盐(非正式名称：ha
‑
100)，1
‑
(5
‑
异喹啉磺酰基)
‑2‑
甲基哌嗪(非正式名称：h
‑
7)，1
‑
(5
‑
异喹啉磺酰基)
‑3‑
甲基哌嗪(非正式名称：异h
‑
7)，n
‑2‑
(甲基氨基)乙基
‑5‑
异喹啉
‑
磺酰胺二盐酸盐(非正式名称：h
‑
8)，n
‑
(2
‑
氨基乙基)
‑5‑
异喹啉磺酰胺二盐酸盐(非正式名称：h
‑
9)，n
‑
[2
‑
对
‑
溴
‑
肉桂基氨基)乙基]
‑5‑
异喹啉磺酰胺二盐酸盐(非正式名称：h
‑
89)，n
‑
(2
‑
胍基乙基)
‑5‑
异喹啉磺酰胺盐酸盐(非正式名称：ha
‑
1004)，1
‑
(5
‑
异喹啉磺酰基)高哌嗪二盐酸盐(非正式名称：ha
‑
1077)，(s)
‑
(+)
‑2‑
甲基
‑4‑
甘氨酰
‑1‑
(4
‑
甲基异喹啉基
‑5‑
磺酰基)高哌嗪二盐酸盐(非正式名称：甘氨酰h
‑
1152)和(+)
‑
(r)
‑
反式
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
n
‑
(4
‑
吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐(非正式名称：y
‑
27632)。可提供足够高浓度的激酶抑制剂使细胞存活并保持附着于表面。包含在aec培养基中时，rock抑制剂浓度可为约3μm至约10μm(例如约3、4、5、6、7、8、9、10μm y
‑
27632)。
[0042]
b.用于组合物的细胞
[0043]
由于从需要心血管介入治疗的患者获取原代动脉内皮细胞在医学上不可行，并且原代动脉内皮细胞在培养过程中会去分化，因此动脉内皮细胞涂覆的聚合物移植物从未用于临床。因此，在此提供aec细胞种植的聚合物移植物，它们优于先前记载的细胞种植血管假体。
[0044]
根据本文所述的细胞体外特征性表达谱和功能属性，aec不同于包括静脉内皮细胞和内皮祖细胞在内的其他细胞类型。尤其，动脉内皮细胞表现出独特的生理特征，能够适应动脉的高流量、高压环境，因而不同于静脉内皮细胞。与静脉内皮细胞相比，动脉内皮细胞产生更高水平的一氧化氮，剪切应力反应更强健，代谢率更高，白细胞粘附性差。参见例如美国专利公开第2016/0244719号，该专利通过引用完全纳入本文。白细胞粘附于动脉内皮细胞的能力与粘附于静脉内皮细胞的能力相比降低尤其重要，因为炎症和由此产生的肌内膜细胞增殖是导致移植物闭塞(即失去通畅)和失败的重要因素。动脉内皮细胞的这些以
及其他独特性能使其比静脉内皮细胞更适合用于细胞种植聚合物动脉移植物和提高长期通畅率，但由于缺乏可及性，迄今为止还没有人能够将其用于临床。动脉采集过程比静脉采集更具侵入性。此外，可用的动脉很少，而且很小。如果可得的少数小动脉中的一条被采集用于内皮细胞培养，那么该动脉就不能再用于将来的任何心脏旁路手术。
[0045]
一些情形中，与本文所述聚合物血管移植物联用的人动脉内皮细胞被修饰从而能够作为通用供体细胞。一些情形中，细胞被基因修饰。本文中，术语“修饰”指本文所述分子或细胞的状态或结构被改变。分子可以通过许多方式进行修饰，包括化学修饰、结构修饰和功能修饰。细胞可以通过引入核酸来修饰。某些实施方式中，经修饰的细胞可以是“(经)基因修饰的”或“(经)基因编辑的”，所述细胞中一个或多个核酸被改变。术语“基因工程(化)的”、“基因编辑的”和“基因修饰的”在本文中互换使用，指细胞(例如原核细胞或真核细胞)中一个或多个核酸被改变的细胞，或细胞经修饰而包含非天然核酸分子，所述非天然核酸分子是人造的或经人工修饰的(例如使用重组dna技术)或是由此类分子衍生的(例如转录、翻译等等)。
[0046]
包含外源、重组、合成和/或其他方式修饰的多核苷酸的动脉内皮细胞被认为是基因修饰的细胞，因此相对于其任何天然存在的对应者来说是非天然存在的。某些情形中，基因修饰的细胞含有一种或多种重组核酸。另一些情形中，基因修饰的细胞含有一种或多种合成的或经基因工程化的核酸(例如相比其天然对应者的序列而言含有至少一处人工插入、缺失、倒置或取代的核酸)。产生基因工程化细胞的方法是本领域所知的，可见sambrook等人的《分子克隆，实验室手册》(molecular cloning,a laboratory manual)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)，在此援引作为参考。
[0047]
一些情形中，细胞的基因组被修饰(例如工程化)使得经修饰的细胞就治疗应用而言是“普遍可接受的”。本文中，术语“普遍可接受(的)”指细胞产物/产品在免疫学方面广泛的接受度，不需要患者和细胞的交叉匹配，也不需要免疫抑制。一些情形中，细胞被修饰从而使得细胞表面不出现ii类或i类和ii类主要组织相容性复合体基因编码的功能蛋白。这样，经修饰的细胞更能逃避移植物受主t细胞的攻击。一些情形中，如美国专利6,916,654中所述，人动脉内皮细胞经基因修饰(工程化)。另一些情形中，如美国专利公开2014/0134195中所述，通过破坏β
‑
2微球蛋白从ips细胞产生免疫无应答细胞可能是有利的。例如，可以对细胞进行修饰从而在细胞内源性β
‑
2微球蛋白(b2m)基因中包含基因工程破坏。如美国专利公开2014/0134195中所述，所述基因工程破坏可包括引入一个或多个多核苷酸序列，所述多核苷酸序列能够编码单链融合人白细胞抗原(hla)i类蛋白，所述单链融合人白细胞抗原(hla)i类蛋白包含直接或通过连接序列共价连接人白细胞抗原(hla)
‑
i链至少一部分的b2m蛋白的至少一部分。然而，可以理解的是，获得“通用”人aec的方法并不局限于hla蛋白修饰。一些情形中，aec来源于诱导多潜能干细胞，这些细胞与接受血管移植的患者至少50％hla匹配。
[0048]
也可以用其他的策略来对细胞进行基因修饰以尽可能降低免疫反应。例如，riolobos等(molecular therapy 2013，21(6):1232
‑
1241)描述了用重组腺相关病毒(raav)介导的基因编辑对β
‑
2微球蛋白(b2m)基因的两个等位基因进行靶向破坏来产生稳定的hla
‑
i阴性人多潜能干细胞。得到的b2m
‑
/
‑
多潜能干细胞可按照美国专利公开2016/0244719中所述化学组成明确的方法分化成人aec，由此生成非免疫原性“通用”人aec用于
本文所述聚合物血管移植物。另一个例子中，完全或部分破坏细胞表面cd58表达的基因修饰已被证明可增强对细胞免疫两条分支中免疫识别的逃逸。例如，见challa
‑
malladi等(cancer cell 2011；20(6):728
‑
740)。此外，表达hla
‑
e的多潜能干细胞(e二聚体细胞)逃避同种异体反应和nk细胞裂解(gornalusse等，nat biotechnol.2017；35(8):765
–
772)。
[0049]
一些情形中，用于本文提供的血管移植物的细胞被修饰但不在细胞基因组中引入转基因。例如，一些情形中，aec经基因编辑来调节内源性基因的表达(例如相对于作为对照的未修饰细胞增加表达或减少表达)。任何合适的基因编辑方法都可以使用。各种基因编辑技术是本领域技术人员所知道的。基因编辑技术包括但不限于归巢核酸内切酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应子(tale)核酸酶(talen)、成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)
‑
crispr相关蛋白(例如cas9)基因组编辑系统和crispr
‑
cpf1基因组编辑系统。归巢核酸内切酶通常以二聚体的形式切割其dna底物，并且没有明显区分的结合域和切割域。。zfn识别由两个锌指结合位点组成的靶点，所述靶点位于foki裂解域识别的5至7碱基对(bp)间隔序列之侧。talen识别由两个tale dna结合位点组成的靶点，所述靶点位于foki切割域识别的12
‑
20bp间隔序列之侧。cas9核酸酶靶向与单向导rna(grna)内靶序列互补的dna序列，所述靶序列紧邻可能存在于dna双螺旋任一链上的相容性前间隔序列邻近基序(pam)上游。因此，本领域技术人员能够为本发明选择适当的基因编辑技术。
[0050]
一些情形中，可用基因编辑技术(如crispr
‑
cas9基因编辑系统)修饰人多潜能干细胞，使其在功能上对免疫系统“隐形”。这种“普遍可接受的”多潜能干细胞可以分化成aec，用于本文所述血管移植物。一些情形中，aec经修饰诱导cd47过度表达作为逃避先天免疫系统检测的手段。已知cd47是一个重要的免疫检查点，在肿瘤细胞上高表达，使肿瘤细胞对宿主的免疫监视产生抗性。一些情形中，通过引入含cd47基因的病毒来诱导cd47过度表达，所述病毒将该基因的额外拷贝递送到细胞中。参见例如deuse等，nature biotechnology 37,252
–
258(2019)。本文中，术语“过度表达”和“过表达”指基因产物(例如mrna、蛋白质)的表达增加到大于细胞正常产生的水平。这些术语包括内源性和外源性的蛋白质过度表达。一些情形中，过表达相对参照标准来确定。
[0051]
一些情形中，aec经过基因修饰而表达选择标志。此类情形中，选择标志的表达用来将经修饰细胞与非修饰细胞识别和/或分离开来。以这种方式，选择标志的表达用于获得纯的或基本纯的经修饰细胞群以用于本文所述血管移植物。一些情形中，aec经过修饰而包含选择标志盒。选择标志盒可赋予对诸如抗生素之类药物的耐药性。本领域技术人员将理解，还可使用更多选择标志或选择标志的组合。可使用除抗生素抗性之外其它形式的选择标志，例如提供生长优势或比色选择的标志。优选地，选择标志盒包含编码选择标志的多核苷酸，该多核苷酸操作性地连接能够诱导、更优选特异性地在内皮细胞中诱导选择标志转录的启动子或调控区。使用内皮细胞特异性启动子将内皮细胞或动脉内皮细胞与不表达所述基因的污染细胞分离纯化。可用于实施本发明的启动子包括但不限于组成型启动子、诱导型启动子、时间调控启动子和化学调控启动子。优选地，启动子是诱导型的。
[0052]
修饰之后，可将aec施加于备好的聚合物基材来制备aec种植的血管移植物以供立即使用、稍后使用或储存。本文中，术语“备好的”指经过处理以备用于组装aec种植的血管移植物的聚合物基材。“备好的”包括经过预先涂覆(部分或全部)和/或脱气的聚合物基材。一些情形中，aec可以储存，例如储存于液氮罐中，直到需用于治疗特定患者。就短期储存
(例如约6
‑
12个月)而言，aec可储存于
‑
80℃或更低温度(例如
‑
80
°
、
‑
90
°
、
‑
100
°
、
‑
110
°
、
‑
120℃、
‑
130℃、
‑
140℃、
‑
150℃、
‑
160℃、
‑
170℃、
‑
180℃、
‑
190℃、
‑
196℃或更低)。一些情形中，种植到备好的聚合物基材上之前，将aec保持在0℃以上的温度，包括但不限于4℃、室温(约25℃)和约37℃。能够预先制备包含通用aec的聚合物血管移植物并将其储存到需要时的能力是一个重要的优势，特别是对于治疗有迫切需要的患者来说。此类情形中，aec细胞种植的聚合物血管移植物适合移植到对象身上或体内，在对象内引起的移植物排斥反应降低或不引起移植物排斥反应。
[0053]
一些情形中，用于本文所述血管移植物的aec是从细胞库获得的。通常，细胞库采集多种来源的细胞样本，根据至少一个预定的特征对它们进行分类，并在保持细胞存活的条件下存储细胞。因此，具有特定预定特征的存储或“库”细胞可按需提供。优选地，将代表多种hla型的来自健康个体的库细胞存储在细胞库中，以便为特定人群中的所有潜在受主提供单倍型配型。一些情形中，可用于本文提供的血管移植物和方法的库细胞是诱导多潜能干细胞(ipsc)，所述ipsc来自经筛选的已知hla型的供体。另一些情形中，库细胞是来源于已知hla型的ipsc的aec。例如，可如美国专利公开2016/0244719中所述的方法由已知hla型的ipsc获得aec。个体的hla型包括一对共表达的单倍型，各单倍型由hla
‑
a、hla
‑
b、hla
‑
c、hla
‑
dq、hia
‑
dp和hla
‑
dr构成。另一些情形中，采用hla匹配的人胚胎干细胞(hesc)。根据特定人群的种族构成，某些hla等位基因组合的频率会有所不同。使用算法，可以确定组织供体库中为100％潜在受主提供hla匹配所需的库内纯合和杂合hla型的数量以及每种hla等位基因组合的频率。有关综述可见例如de rham&villard,j.immunology res.2014。优选地，由o型血健康捐献者产生库细胞以降低抗abo凝集素介导同种免疫反应的潜在风险(zimmermann等，stem cells and development 2012；21(13):2364
‑
2373)。
[0054]
用于临床应用的含aec细胞制剂必须符合政府机构(如美国食药监局)的规定来获取。因此，在示例性实施方式中，本文提供的方法符合良好制造规范(gmp)、良好组织规范(gtp)和良好实验室规范(glp)来实施。不使用含有动物源性成分的试剂，所有试剂均从符合gmp的来源购买。就细胞治疗产品(如本文所提供的用于血管移植物的体外人动脉内皮细胞群)的临床制造而言，gtp主导供体同意、可追溯性和传染病筛查，gmp与设施、过程、测试和实践相关，从而生产一贯安全有效的人用产品。见lu等，stem cells 27:2126
‑
2135(2009)。在适当的情况下，由机构和机构委员会对患者方案进行监管，以确保知情同意；按阶段研究产品的安全性、生物活性、适当剂量和疗效；结果具有统计学意义；并符合伦理准则。
[0055]
一些情形中，可以根据美国专利公开2016/0244719所述获取人动脉内皮细胞。根据这些方法获得的aec其特征在于动脉内皮标志物如肝配蛋白b2(ephrinb2)、dll4、hey
‑
2、jagged
‑
1和jagged
‑
2的高水平表达。这些aec的特征还包括白细胞粘附力低、no生成量和耗氧量高、有剪切应力反应并且能够在体外和体内形成血管网络同时保留此类血管网络中动脉标志物的表达。所述方法包括或基本上由以下所述组成：在基本上不含胰岛素且包含成纤维细胞生长因子(fgf)、血管内皮生长因子(vegf)和notch激动剂、tgfβ抑制剂和肌醇单磷酸酶抑制剂三者中至少其一的无血清、无白蛋白、化学组成明确的培养基中培养中胚层细胞，培养时间长度足以使培养的中胚层细胞分化为动脉内皮细胞。用于将人中胚层细胞(包括多潜能干细胞衍生的中胚层细胞)分化成aec的fgf、vegf、notch激动剂、tgf
‑
β抑制剂
和肌醇单磷酸酶抑制剂的量如美国专利公开2016/0244719所述。一些实施方式中，用于本文所述aec分化方法的细胞培养基包含所有这些组分。另一些情形中，培养基基本上不含这些成分中的一种或多种。培养可以在任何合适的表面上进行(例如在二维或三维培养中)。
[0056]
aec具有以下特征性表达谱：cd31
+
/cd144
+
/cd41
‑
/cd45
‑
。优选地，aec表达一种或多种以下动脉内皮细胞标志物：肝配蛋白b2(efnb2)、神经纤毛蛋白
‑
1(nrp
‑
1)/cd304、delta(δ)
‑
样4(dll4)和cd184(分化簇184)。肝配蛋白b2(efnb2)基因编码结合ephb4和epha3受体的efnb类肝配蛋白。神经纤毛蛋白
‑
1(nrp
‑
1)，亦称血管内皮细胞生长因子165受体(vegf165r)，主要表达于动脉内皮细胞。dll4是动脉内皮细胞中表达的notch配体(shutter等，genes&dev.14:1313
‑
18(2000))。cd184亦称cxcr4(4型c
‑
x
‑
c趋化因子受体)或融合素。任何适当的方法都可用于检测本文所述细胞类型特征性生物标志物的表达。例如，可用例如rna测序(例如rna
‑
seq)、免疫组化、聚合酶链反应、定量实时pcr(qrt
‑
pcr)或检测或测量基因表达的其他技术来检测一个或多个生物标志物的存在或不存在。rna
‑
seq是一种高通量测序技术，提供对生物体、组织或细胞rna含量的全基因组评估。作为替代或者另外，可以使用例如通过荧光原位杂交(fish；参见1998年10月公开的wo98/45479)、southern杂交、northern杂交或聚合酶链反应(pcr)技术(例如qrt
‑
pcr)来检测一个或多个aec生物标志物的存在或不存在或测量其水平。用于评估细胞群中标志物的蛋白质水平表达的定量方法也是本领域所知的。例如，用流式细胞术来确定给定细胞群中表达或不表达目标生物标志物的细胞的比例。
[0057]
优选地，aec群包含至少80％动脉内皮细胞。一些情形中，所得细胞群中至少约80％(例如至少80％、85％、90％、95％、99％或更多)细胞是动脉内皮细胞。
[0058]
中胚层细胞可表达一个或多个中胚层标志物，所述标志物选自brachyury(t)、emos、foxa2、mixl1、msx1和msx2。就本文所述方法而言，中胚层细胞通常在不含、基本上不含或实质上不含胰岛素、白蛋白或任何衍生自非人动物的成分(即不含异源物质)的培养基中培养。本文中，术语“基本上不含”指基本上不含特定组分或试剂的细胞培养条件。基本上不含胰岛素是指培养基原有胰岛素浓度低于1％，或低于2
×
10
‑5重量％的胰岛素，优选包含少于1
×
10
‑5％、少于0.5
×
10
‑5％、少于0.2
×
10
‑5％或少于0.1
×
10
‑5％的胰岛素。
[0059]
适用于本发明方法的tgfβ受体抑制剂包括但不限于sb
‑
431542、sb
‑
525334、a83
‑
01、ly2157299、ly210976、repsox、sb
‑
505124、d4476、gw788388、sd208和ew
‑
7197。优选地，tgf
‑
β信号传导抑制剂是sb
‑
431542，一种内源性活化素的小分子抑制剂和i型受体(tgf
‑
β受体i)(inman等，mol pharmacol.62(1):65
‑
74(2002))。
[0060]
notch是一种单次跨膜细胞表面受体，结合包括delta样和jagged家族在内的细胞表面配体家族。本文中，术语“notch激动剂”和“notch激活剂”指结合notch受体并启动或介导与notch激活相关的信号传导事件的分子(例如生物分子、小分子、化学品)。白藜芦醇(3,4’,5
‑
三羟基二苯乙烯)属于称为二苯乙烯类的多酚化合物，是notch信号传导的激活剂(激动剂)。适用于本文提供的促进动脉分化的方法的其他notch激动剂包括丙戊酸和辛二酰双羟肟酸(suberoyl bishydroxamic acid)。此外，固定化或多聚化的可溶性notch配体，如固定化dll4和固定化jagged
‑
1肽也可用作notch激活剂。
[0061]
肌醇单磷酸酶(imp酶(impase))催化肌醇单磷酸酯水解为肌醇，肌醇是磷酸肌醇细胞信号传导通路所必需的。一些情形中，imp酶抑制剂是双膦酸l
‑
690330([1
‑
(4
‑
羟基苯
氧基)亚乙基]双膦酸)。锂也抑制imp酶，从而减弱磷酸肌醇信号传导(berridge等，cell 59:411
‑
419(1989))。磷酸肌醇信号传导通路的其他抑制剂包括但不限于：磷酸肌醇3
‑
激酶(pi3k)抑制剂ly294002、匹替利司(pictilisib)、hs
‑
173、gsk2636771、杜唯利司(duvelisib)、tg100
‑
115、gsk1059615、pf
‑
04691502、pik
‑
93、bgt226、azd6482、sar245409、byl719、cudc
‑
907、ic
‑
87114、tg100713、吉达妥利司(gedatolisib)、ch5132799、pki
‑
402、bay 80
‑
6946、xl147、pik
‑
90、pik
‑
293、pik
‑
294、槲皮素(quercetin)、渥曼青霉素(wortmannin)、zstk474、as
‑
252424、as
‑
604850、和艾匹妥利司(apitolisib)。
[0062]
本文所述imp酶、tgfβ受体等的化学抑制剂的合适工作浓度范围为约0.1μm至约100μm，例如约2μm、5μm、7μm、10μm、12μm、15μm、18μm，或一种或多种前述化学抑制剂约0.1μm至约100μm的另一工作浓度。
[0063]
优选地，在aec分化培养基中培养中胚层细胞直到所得细胞群中至少约80％(例如至少80％、85％、90％、95％、98％或更多)的细胞为动脉内皮细胞。
[0064]
本文所述生物标志物中有几种的表达水平是低或中等水平。虽然常将细胞称为某特定标志物“阳性”或“阴性”，实际表达水平是一个定量性状。细胞表面分子的数量可以相差好几个对数而仍然定性为“阳性”。因此，染色水平的表征能够区分细胞群之间的细微差别。表达水平可通过流式细胞术检测或监测，其中，激光检测荧光团的定量水平(与抗体结合的细胞表面抗原的量成正比)。流式细胞术或荧光活化细胞分选(facs)可用于根据抗体染色强度以及细胞大小和光散射等其他参数来分离细胞群。尽管染色的绝对水平可能因具体的荧光团和抗体制剂而不同，但可将数据相对于对照进行归一化。
[0065]
一些情形中，动脉内皮细胞来源于人多潜能干细胞。如美国专利公开2016/0244719中所述，人多潜能干细胞在无血清、无白蛋白、化学组成明确的细胞培养基中培养约两天，该培养基包含骨形态发生蛋白(bmp)、活化素a和wnt/β
‑
连环蛋白信号传导激活剂，由此获得包含中胚层细胞的细胞群。中胚层细胞可表达一种或多种中胚层标志物，所述标志物选自brachyury(t)、emos、foxa2、mixl1、msx1和msx2。
[0066]
人多潜能干细胞(hpsc)，无论是胚胎干细胞还是诱导干细胞，提供通往人类发育早期阶段的途径，为细胞治疗和组织工程提供了一个衍生大量细胞的平台。因此，在示例性实施方式中，本文提供的方法还包括在促进中胚层干细胞分化为动脉内皮细胞的条件下分化人多潜能干细胞。一些情形中，产生动脉内皮细胞的方法包括在促进中胚层分化的无血清、无白蛋白、化学组成明确的培养基中培养人多潜能干细胞。然后，多潜能干细胞衍生的中胚层细胞按照aec分化方法进行分化(例如，美国专利公开2016/0244719中所述的那些)，由此生成多潜能干细胞衍生的aec。示例性实施方式中，促进中胚层分化的无血清、无白蛋白、化学组成明确的培养基包含活化素a、骨形态发生蛋白4(bmp4)、fgf2和wnt/β
‑
连环蛋白信号激活剂。多潜能干细胞可以是人胚胎干细胞或人诱导多潜能干细胞。本文中，适用于本发明方法的“多潜能干细胞”是具有分化为所有三个胚层细胞能力的细胞。适用于本文的合适的多潜能干细胞包括人胚胎干细胞(hesc)和人诱导多潜能干细胞(ips)。本文中，“胚胎干细胞”或“esc”指衍生自囊胚内细胞团的多潜能干细胞或多潜能干细胞群。参见例如thomson等，science 282:1145
‑
1147(1998)。这些细胞表达oct
‑
4、ssea
‑
3、ssea
‑
4、tra
‑1‑
60和tra
‑1‑
81。多潜能干细胞表现为致密的集落，包含具有高核质比和核仁明显的细胞。esc可从wicell研究所(wicell研究所(wicell research institute)，威斯康星州麦迪逊)
等渠道购买。
[0067]
一些情形中，动脉内皮细胞来源于人诱导多潜能干细胞。例如，对于没有紧急需要的患者，可获取衍生自患者的诱导多潜能干细胞，从而生成患者特异性的动脉内皮细胞。本文中，术语“诱导多潜能干细胞”(“ips细胞”)指如下所述的多潜能干细胞或多潜能干细胞群：它们可能分化自不同的体细胞来源、就一组特定的潜能(potency)决定因子而言可能不同、用于分离它们的培养条件可能不同，但与它们各自的分化来源体细胞基本上遗传相同，并表现出与高潜能细胞(如esc)相似的特征，如本文所述。参见例如yu等，science318:1917
‑
1920(2007)。
[0068]
诱导多潜能干细胞表现出与esc相似的形态特征(如圆形、大核仁和少细胞质)和生长特征(如倍增时间约17到18小时)。此外，ips细胞表达多潜能细胞特异性标志物(例如oct
‑
4、ssea
‑
3、ssea
‑
4、tra
‑1‑
60或tra
‑1‑
81，但不表达ssea
‑
1)。然而，诱导多潜能干细胞并非直接衍生自胚胎。本文中，“非直接衍生自胚胎”表示用于产生ips细胞的起始细胞类型是非多潜能(non
‑
pluripotent)细胞，例如多能(multipotent)细胞或终末分化细胞，例如从出生后个体获得的体细胞。
[0069]
人ips细胞可根据本文所述的方法用于获得与特定人对象遗传互补(genetic complement)的aec。例如，获得表现出特定哺乳动物对象特定疾病或紊乱相关或由其所致的一个或多个特定表型的aec可能是有利的。此类情形中，根据本领域所知的方法，通过对特定人对象的体细胞重新编程获得ips细胞。例如参见yu等，science 324(5928):797
‑
801(2009)；chen等，nat.methods8(5):424
‑
9(2011)；ebert等，nature 457(7227):277
‑
80(2009)；howden等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.108(16):6537
‑
42(2011)。可通过组织活检或其他组织取样方法从目标组织获得或分离用于重编程为ips细胞的对象特异性体细胞。一些情形中，对象特异性细胞在使用前经过体外处理或修饰。例如，对象特异性细胞可在重编程之前扩增、分化、化学处理、基因修饰、接触多肽、核酸或其它因子、低温保存或以其它方式修饰，然后对重编程细胞进行定向分化，由此产生对象特异性aec。
[0070]
由特定个体的ips细胞产生的动脉内皮细胞与从该个体分离的原代动脉内皮细胞之间的一个重要区别是，ips细胞衍生的细胞具有无限的可规模性，且能够超过hayflick极限(一定数量的细胞分裂)。本文中，术语“hayflick极限”指细胞不能再增殖并进入衰老期之前有限的体外群体倍增数(hayflick l.exp cell res 37:614
‑
36,1965)。虽然原代培养动脉内皮细胞的固有自我更新能力有限，但是根据本文提供的方法，可以从单一来源(例如个体的体细胞)获得几乎取之不尽的动脉内皮细胞供给。因此，本发明实施方式之一中，aec能够在组织培养实验室中扩增，由此获得的细胞数量足以治疗一个以上的患者，并且，在优选实施方式中，适于建细胞库。
[0071]
用于培养多潜能干细胞的明确培养基和基材条件(如本文所述方法中所用的)是本领域周知的。优选地，本文使用的培养基是化学组成明确的、无白蛋白且无异源物质。一些情形中，将待用本文所述方法分化的多潜能干细胞培养在化学组成明确的无血清、无白蛋白培养基中。
[0072]
一些实施方式中，使用细胞分离、细胞分选或其他富集方法富集细胞群中的动脉内皮细胞部分，例如荧光活化细胞分选(facs)、酶联免疫吸附试验(elisa)、磁珠、磁活化细胞分选(macs)、激光靶向消融非内皮细胞，及其组合。优选地，用facs基于细胞表面抗原表
达来识别和分离细胞。一些情形中，在根据本文所述方法获得包含人aec的细胞群后，人aec群可在适于增殖人aec的培养基中扩增，所述培养基包括但不限于人内皮无血清培养基(life technologies公司，目录号11111
‑
044)，egm
‑
2(lonza公司，目录编号cc
‑
3162)和内皮细胞培养基(bd biosciences公司，目录号355054)。
[0073]
c.其他血管移植物组件
[0074]
根据本文所述聚合物血管移植物的特定用途，一些情形中，移植物进一步包含一种或多种生物活性剂将是有利的。本文中，术语“生物活性剂”或“活性剂”指治疗、预防和/或诊断用物质，包括但不限于在人体或动物体内局部或全身起作用的生物、生理或药理活性物质。例如但不限于小分子药物、肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、核苷酸、寡核苷酸、适体、sirna、核酸，及其组合。“生物活性剂”包括单种试剂或多种生物活性剂，后者包括例如两种或更多种生物活性剂的组合。
[0075]
适合与本文所述聚合物移植物联用的生物活性剂包括但不限于药物组合物、多肽(例如趋化因子、细胞因子)和/或其他治疗剂或药物，包括但不限于抗血栓形成剂、抗增殖剂、预防、抑制或减少再狭窄或动脉瘤形成的药物，抗肿瘤/抗增殖/抗有丝分裂药物，血管细胞生长促进剂，血管细胞生长抑制剂和血管扩张剂。细胞因子和趋化因子包括但不限于白细胞介素(il)1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
10、il
‑
12(p40)、il
‑
12(p70)、il
‑
13、il
‑
15、il
‑
17、ip
‑
10、嗜酸性粒细胞激活趋化因子、干扰素γ(ifnγ)、粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)，巨噬细胞炎性蛋白1α(mip
‑
1α)、rantes、肿瘤坏死因子α(tnf
‑
α)、血小板衍生生长因子(pdgf)
‑
aa、pdgf
‑
ab/bb、tgf
‑
β、vegf，及其组合。一些情形中，将生物活性剂含于血管移植物中或施加于血管移植物。
[0076]
一些情形中，聚合物血管移植物包含一种或多种其他细胞类型。例如，在aec之外，可将平滑肌细胞(smc)种植在聚合物血管移植物上。smc可以是原代平滑肌细胞或人多潜能干细胞衍生的smc。smc可以是野生型、经基因修饰或经基因编辑的。
[0077]
方法
[0078]
本文所述的聚合物血管移植物可用作任何血管或心血管外科应用的动脉或动静脉分流件。示范性应用包括但不限于先天性心脏病心脏手术、冠状动脉旁路术和周围血管手术。因此，在另一方面，在此提供制备和使用本文提供的聚合物血管移植物来治疗有需要的对象血管缺损的方法。这种方法可以包括将本文所述聚合物血管移植物植入有需要的对象。术语“个体”、“宿主”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用。各种实施方式中，植入聚合物血管移植物以替代病变或受损的血管部分，例如替换因创伤或因血管疾病而受损的主动脉或血管的弱化部分。
[0079]
一些实施方式中，例如在冠状动脉或外周动脉旁路移植过程中，聚合物血管移植物用于搭建旁路和/或替换狭窄或部分闭塞的血管段。例如，本文所述aec细胞种植的聚合物血管移植物可用于心脏或腿部的旁路手术。另一例子中，本文所述aec细胞种植的聚合物血管移植物可用于修复手术，例如用于矫正发育异常或修复严重损伤。所述血管移植物也非常适合在动静脉分流中提供血液透析通路。
[0080]
一些情形中，治疗方法包括进行吻合术(即管状部分的外科结合)来植入聚合物血管移植物。通常，动脉或静脉与聚合物血管移植物之间的原位吻合是通过用缝线将移植物
缝合到原位血管来实现的。常用的缝合材料包括聚丙烯缝合线和eptfe。因此，本文所述血管移植物包含可缝合材料，例如ptfe或eptfe。
[0081]
现有自体静脉内皮细胞移植过程的一个主要问题是，收获、生长、在移植物上种植和培养细胞大约需要一个月的时间。大约30％的患者不能接受这种过程，因为他们的急症不允许等待30天才能获得自体静脉内皮细胞移植物。因此，本发明提供了相比传统方法特别有利的材料和方法。具体而言，本文提供的方法中，约10天内即可制备好临床即用的aec细胞种植的聚合物血管移植物。这种移植物用人aec规模化生产并冷冻备用。因此，一些情形中，该方法包括解冻人aec，将其种植到聚合物基材上，优选已至少部分涂覆有一种或多种内皮细胞粘附剂的聚合物基材。根据请求，基于与需要移植的患者的配型情况选择冷冻人aec，或者，所述冷冻人aec是对移植受主(患者)不会有免疫原性的“通用”aec。优选地，将所选细胞解冻并种植到备好的聚合物基材上，并且将aec种植的聚合物基材培养不到10天且优选不到7天(例如少至2天、3天、4天、5天或6天)。然后在自最初请求起约10天内、优选约7天内，将培养的聚合物基材递送至患者或与供患者治疗之用。如果aec按照例如美国专利公开2016/0244719中所述的aec分化方案衍生自库ipsc细胞，则自最初请求起算的制备好的aec种植血管移植物的送达时间必须包括完成分化所需的时间。本申请提供定向分化方案，其中，一些情形中，人多潜能干细胞在大约2
‑
3天内分化为中胚层细胞，所得中胚层细胞在大约3天内诱导分化为内皮细胞。一些情形中，所述方法包括用通用细胞系的细胞种植聚合物血管移植物。此类情形中，细胞种植的血管移植物可以制备成可即用的按需取用的“现成”产品。此时，aec种植的血管移植物可在有需求时立即提供给有需要的患者。例如，备好的“通用”aec种植血管移植物可用次日或更快的递送来送达。如果是当地生产的，备好的血管移植物可能只需要几分钟或几个小时就能送达。一些情形中，制备好的“通用”aec种植血管移植物可以是购买的就地保存的低温冷冻产品，此类情形中，aec种植的移植物在用于患者前的迟滞期最短。
[0082]
可用任何合适的方法来检测和测量植入本文所述聚合物血管移植物后的功能和形态变化。例如，可以进行血管超声检查来评估身体动脉和静脉中的液体流动来检测疾病的存在、严重程度和/或具体位置。血管超声检查是一种无创超声检查方法(也称为多普勒超声检查(duplex ultrasonography))，用于检查机体血管内的循环。一些情形中，血管超声检查用于计算在使用本文所述聚合物血管移植物治疗血管前后血管中流体流动的速度。一些情形中，对比增强超声造影(ceus)用于检测和/或监测干预前后的血管病变。血管超声和ceus在检测和表征介入治疗后再狭窄方面特别有用。“再狭窄”，如本文所定义，指先前的狭窄部位(即血管成形术中球囊扩张部位)的血管管腔变窄，或介入手术后血管或人造移植物管腔变窄(例如在使用移植物的旁路手术后动
‑
静脉吻合的静脉侧变窄)。本文中，再狭窄包括闭塞。再狭窄包括血管壁损伤后发生的任何管腔狭窄。因此，导致再狭窄的损伤可包括动脉粥样硬化病变的创伤(如血管成形术中所见)、病变的切除(如动脉内膜切除术中所见)、外部创伤(如横断损伤(cross
‑
clamping injury))或外科吻合术。
[0083]
另一方面中，本文提供一种制造聚合物血管移植物的方法。该方法可包括或基本上由以下所述组成：用一种或多种内皮附着剂涂覆聚合物基材的至少一部分；以及使人动脉内皮细胞接触经涂覆的聚合物基材，从而形成基本上不粘附白细胞或其细胞碎片的aec细胞种植的聚合物血管移植物。本文中，术语“涂覆”指通过任何合适的工艺将本文所述内
皮附着剂附着或沉积到聚合材料(例如eptfe)上，使得沉积剂覆盖材料的一些或全部表面。一些情形中，涂覆包括覆盖至少部分覆盖聚合材料的内腔表面区域。聚合物材料的涂层不必是完整的。具体而言，一些情形中，优选仅将组合物施加于有待涂覆的聚合材料的一个或多个部分，从而得到被一种或多种内皮附着剂至少部分涂覆的聚合材料。一些情形中，涂层包括一个或多个涂覆层。涂层可以具有基本上恒定的厚度或变化的厚度。
[0084]
一些情形中，在室温下或在动脉内皮细胞生理相关温度(例如37℃)涂覆聚合物基材的至少部分。一些情形中，涂覆包括将聚合物基材的至少部分与一种或多种内皮附着剂接触适当长度的时间，包括但不限于几分钟、几小时、或约12小时至约24小时，由此获得部分或完全涂覆的基材。
[0085]
一些情形中，所述方法可选性地可包括在用一种或多种内皮细胞附着剂涂覆之前对所述聚合物基材进行脱气。
[0086]
另一方面，在此提供一种将aec种植的聚合物血管移植物低温保存的方法。低温保存是这样一种过程：其中，通过冷却到非常低的温度(通常为
‑
40℃或
‑
80℃)来保存生物材料，例如细胞、组织、细胞外基质、器官或其他任何容易因为无控化学动力学受到损伤的生物构造体。所述方法可包含或基本上由以下所述组成：将aec种植的聚合物血管移植物与低温保护剂(亦称冷冻保护剂、冻存剂和低温防护剂)接触，然后将接触后材料暴露于冷冻温度。低温保护剂保护血管移植物上的生物材料免受冷冻的破坏(例如生物材料中水分子冷冻时的冰晶形成和溶质浓度升高)。一些情形中，据处理前移植物组织上的细胞计数和冷冻及解冻后移植物中的细胞计数测定，低温保存的血管移植物在冷冻和解冻后保留至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的aec细胞活力。
[0087]
另一方面，在此提供用于递送动脉内皮细胞种植的血管移植物的方法，所述方法包括：当收到动脉内皮细胞种植血管移植物请求时，选择人动脉内皮细胞；将所选人aec种植到以内皮细胞附着剂至少部分涂覆的聚合物基材上；将所述种植后的聚合物基材培养约2至约10天，由此产生适于作为血管移植物植入的aec种植的聚合物基材；并且在收到请求后大约10天递送所述aec种植的血管移植物。聚合物基材可选自膨化聚四氟乙烯(eptfe)、聚氯乙烯(pvc)、pga(聚乙醇酸)、pla(聚乳酸)、pcl(聚己内酯)、pgla(聚乳酸
‑
共乙醇酸)、聚氨酯、聚二氧杂环己酮、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯四氟乙烯(tfe)、聚四氟乙烯(ptfe)、丝、脱细胞支架、细胞外基质蛋白基支架、透明质酸、壳聚糖和聚羟基链烷酸酯。内皮细胞附着剂可包含多巴胺、纤维蛋白胶、rgd肽、玻连蛋白和层粘连蛋白中的一种或多种。
[0088]
一些情形中，与静脉内皮细胞种植的聚合物基材相比，本文所述血管移植物的白细胞粘附减少。一些情形中，与静脉内皮细胞种植的聚合物基材或裸露未涂覆的聚合物基材相比，本文所述血管移植物表现出血栓形成减少。一些情形中，与没有涂覆内皮细胞附着剂的聚合物基材相比，本文所述血管移植物表现出长期通畅率提高。一些情形中，所述方法还包括在用内皮细胞附着剂涂覆之前对聚合物基材进行脱气。一些情形中，脱气包括在丙酮和乙醇中洗涤聚合物基材，在有机溶剂中洗涤聚合物基材，或施加真空。优选的，人动脉内皮细胞对血管移植物受主无免疫原性。一些情形中，人动脉内皮细胞包含一个或多个基因修饰从而不表达β2微球蛋白基因。一些情形中，人动脉内皮细胞包含一个或多个基因修饰从而不表达一种或多种i类主要组织相容性复合体(mhc)基因编码的蛋白质。一些情形
中，人动脉内皮细胞包含一个或多个基因修饰从而不表达一种或多种ii类主要组织相容性复合体(mhc)基因编码的蛋白质。一些情形中，人动脉内皮细胞包含一个或多个基因修饰从而不表达cd58多肽。一些情形中，人动脉内皮细胞包含一个或多个基因修饰从而过度表达hla
‑
e(e二聚体)和cd47之一或两者。
[0089]
另一方面，在此提供用于递送动脉内皮细胞种植的血管移植物的方法，所述方法包括：当收到动脉内皮细胞种植血管移植物请求时，选择低温保存的适合有此需要对象的动脉内皮细胞(aec)种植的血管移植物；将所选低温保存的aec种植的血管移植物解冻；如果解冻的aec种植血管移植物上有低温保存溶液则将其去除；并且在收到请求后大约1
‑
2天(例如约24小时至约48小时内)递送所述aec种植的血管移植物。重要的是，这些方法为患者医护的重要需求提供了解决方案，具体地说是在收到移植材料请求后1至2天内(例如约24至约48小时内)提供患者即用的(“patient
‑
ready”)aec种植的血管移植物的能力。因此，与传统方法相比，这些方法提供了显著的改进，传统方法需要大约30天来提供种植了患者自体静脉内皮细胞的血管移植物。本文中，术语“患者即用的(“patient
‑
ready”)”指移植物已预先配置好，仅最短等待或再需最少的准备即可用于患者。
[0090]
一些情形中，合适的低温保存的aec种植血管移植物包含对对象无免疫原性的人动脉内皮细胞。人动脉内皮细胞可包含一个或多个基因修饰从而不表达一种或多种ii类主要组织相容性复合体(mhc)基因编码的蛋白质。一些情形中，人动脉内皮细胞包含一个或多个基因修饰从而不表达cd58多肽。一些情形中，人动脉内皮细胞包含一个或多个基因修饰从而过度表达hla
‑
e(e二聚体)和cd47之一或两者。
[0091]
制品
[0092]
另一方面，在此提供一种制品。例如，在此提供了一种容器，其中包含低温保存的组合产品和低温保存溶液，其中，所述冷冻保存的组合产品包括种植在至少部分涂覆有内皮细胞附着剂的可植入聚合物基材上的人动脉内皮细胞群。一些情形中，内皮细胞附着剂包含多巴胺。如本文所述，人动脉内皮细胞优选非免疫原性的，使得聚合物移植物成为“通用的”，适合任何有需要的人对象。例如，人动脉内皮细胞可包含一个或多个基因修饰从而不表达β2微球蛋白基因和/或一种或多种由i类或ii类主要组织相容性复合体(mhc)基因编码的蛋白质。容器可以是小瓶(vial)、冷冻管、袋或适合容纳聚合物血管移植物和低温保存溶液的任何其他容器。优选地，容器可在冷冻温度下存储，包括但不限于从1℃至约
‑
196℃或更低的温度(例如1
°
、0
°
、
‑1°
、
‑
5、
‑
10
°
、
‑
20
°
、
‑
30
°
、
‑
40
°
、
‑
50
°
、
‑
60
°
、
‑
70
°
、
‑
80
°
、
‑
90
°
、
‑
100
°
、
‑
110
°
、
‑
120
°
、
‑
130
°
、
‑
140
°
、
‑
150
°
、
‑
160
°
、
‑
170
°
、
‑
180
°
、
‑
190
°
、
‑
196℃或更低)。
[0093]
一些情形中，人动脉内皮细胞群在种植到可植入聚合物基材之前与低温保存溶液接触。另一些情形中，可植入聚合物基材在种植人动脉内皮细胞后与低温保存溶液接触。低温保存溶液合适的例子包括但不限于二甲基亚砜(dmso)。一些情形中，将10％二甲基亚砜溶液用于冷冻保存。一些情形中，在植入前将低温保存溶液从细胞种植的聚合物基材中去除。溶液接触和去除步骤通常在无病源微生物(aseptic)、优选无菌(sterile)的条件下进行。
[0094]
另一方面，在此提供一种容器，其中包含低温保存的组合产品和低温保存溶液，其中，低温保存的组合产品包含人动脉内皮细胞种植的可植入聚合物基材，其中，所述可植入聚合物基材以一种或多种内皮细胞附着剂至少部分涂覆。聚合物基材可选自膨化聚四氟乙
烯(eptfe)、聚氯乙烯(pvc)、pga(聚乙醇酸)、pla(聚乳酸)、pcl(聚己内酯)、pgla(聚乳酸
‑
共乙醇酸)、聚氨酯、聚二氧杂环己酮、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯四氟乙烯(tfe)、聚四氟乙烯(ptfe)、丝、脱细胞支架、细胞外基质蛋白基支架、透明质酸、壳聚糖和聚羟基链烷酸酯。一些情形中，人动脉内皮细胞对可植入聚合物基材的受主无免疫原性。一些情形中，人动脉内皮细胞包含一个或多个基因修饰从而不表达β2微球蛋白基因。人动脉内皮细胞可包含一个或多个基因修饰从而不表达一种或多种i类和/或ii类主要组织相容性复合体(mhc)基因编码的蛋白质。另一些情形中，人动脉内皮细胞包含一个或多个基因修饰从而不表达cd58多肽。替代地或者另外，人动脉内皮细胞可包含一个或多个基因修饰从而过度表达hla
‑
e(e二聚体)和cd47之一或两者。容器可以是小瓶、冷冻管或袋子。低温保存溶液可包含约10％二甲基亚砜(dmso)。一些情形中，人动脉内皮细胞群在种植到可植入聚合物基材上之前与低温保存溶液接触。优选地，在植入之前从细胞种植的可植入聚合物基材中去除低温保存溶液。优选地，组合产品被配置为储存于37℃至约
‑
196℃(例如约37
°
、30
°
、25
°
、15
°
、10
°
、4
°
、1
°
、0
°
、
‑1°
、
‑
5、
‑
10
°
、
‑
20
°
、
‑
30
°
、
‑
40
°
、
‑
50
°
、
‑
60
°
、
‑
70
°
、
‑
80
°
、
‑
90
°
、
‑
100
°
、
‑
110
°
、
‑
120
°
、
‑
130
°
、
‑
140
°
、
‑
150
°
、
‑
160
°
、
‑
170
°
、
‑
180
°
、
‑
190
°
、
‑
196℃或更低)而相比非在此条件下储存的对照没有显著的细胞活力损失。
[0095]
除非另外定义，本文中的所有技术和科学术语都具有本文所属领域普通技术人员通常所理解的含义。若有冲突，以本说明书(包括定义)为准。除非另作说明，单数术语应包括复数含意，复数术语应包括单数含意。本文提及的所有出版物、专利和其他参考文献通过援引整体纳入本文用于所有目的，如同单独具体指明每篇出版物或专利申请通过援引纳入，除非指明仅通过援引纳入某专利或专利出版物的特定部分。
[0096]
为了进一步阐明本文公开的内容，提供以下术语、缩写和定义。
[0097]
在本申请的说明书和权利要求书中，除非有明确的相反说明，带“一”的不定冠词应理解为“至少一
…”
。除非另有说明，否则本文中的“或”涵盖“和/或”。
[0098]
本说明书和权利要求所用的“或”应理解为与以上定义的“和/或”有相同的含意。例如，当在一个列表中将事项隔开时，“或”或者“和/或”应解释为是包含性的，即包括至少一项，但也包括多于一项，包括一定数量或一系列元素或元件，还包括可选的未列明的事项。仅清楚指示相反的术语例如“其中仅一
…”
或“确切一
…”
或是权利要求中使用“由
……
组成/构成”时，指准确地包含数项元素或一系列元素中的一项。一般而言，如本文中所用，“或”只有在其前后有排他性词语例如“任一”、“(其中)之一”、“仅(其中)之一”或“确切地(其中)之一”时才可解释为指示彼此排他的并列选择(即，“此或彼但非两者”)。“基本由
……
组成/构成”用在权利要求中时应理解为其在专利法领域中的普通含意。
[0099]
本文所用的术语“包含”、“包括”和“包含了”与“含有”、“具有”、“涵盖”、“囊括”同义，其为包含性或开放式表述，不排除其他未列明的元件、元素或方法步骤。本文所用的术语和词语在此用于说明目的，不应被视为是限制性的。“包含”、“包括”、“具有”、“含有”、“涉及”及其变体涵盖其后列出的事项和其他事项。换言之，这些术语是非排他性的，或者是开放性的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、过程、方法、物品或设备不一定仅限于那些元素，而可以包括未列明的其他元素或此类组合物、混合物、过程、方法、物品或设备所固有的其他元素。权利要求中，权利要求元素前的“第一”、“第二”、“第三”等序数词修饰本身并不意味着一项权利要求元素相对于另一项权利要求元素的任何优先序、等级或顺序，也
不意味着方法实施中动作的时序。序数词仅用作标签来区分具有相同名称的非同一权利要求元素(不具有序数意义)，从而用来区分权利要求元素。
[0100]
如本文所用，与数量相关的“近似”或“(大)约”一般认为包括该数量任一方向(大于或小于该数量)5％范围内的数量，除非另有说明或从上下文中明显看出另有别解(除非该数超过可能值的100％)。提到范围时，所述范围包括端值，除非另有说明或从上下文中明显看出另有别解。
[0101]
应理解，本文中前有“(大)约”、“基本上”、“近似于”的任何数值、范围或范围的两个端值(包括例如“大致无”、“大约无”、“约全部”等)同时记载了或揭示了前面没有“(大)约”、“基本上”、“近似于”的该数值、范围或范围的两个端值。
[0102]
提供以下实施例以更好地阐释各种实施方式，不应以任何方式将它们解释成对本公开范围的限定。实施例
[0103]
eptfe表面修饰对细胞粘附的改善
[0104]
meinhart等(asaio j 43:m515
‑
521,1997)报道了静脉内皮化eptfe(膨化聚四氟乙烯)血管移植物的构建，与没有静脉内皮细胞的eptfe相比该移植物具有改善的体内通畅率。由于动脉移植物比静脉移植物更适合动脉旁路手术，我们将动脉内皮细胞种植到eptfe上以进一步改善通畅率。eptfe是疏水性的，因此细胞粘附性低。为了提高细胞粘附力，我们采用等离子体处理使eptfe亲水。结果表明，等离子体处理提高了细胞密度，但只有约20％的融合度(图1a)，提示需要细胞粘附分子来进一步提高细胞粘附。由于rgd肽、胶原、纤连蛋白(fn)、层粘连蛋白、玻连蛋白(vtn)和基质胶被广泛用于细胞粘附，我们用这些细胞附着剂涂覆eptfe。然后用细胞种植装置将细胞种植在eptfe上。种植后，细胞进一步在培养基中培养2
‑
20天，培养基包含补充有fgf、vegf、tgf
‑
β抑制剂(例如sb431542)和白藜芦醇(resv)的基本培养基，由此形成化学组成明确的fvir培养基(见表1)。出人意料的，只有和vtn能够实现超过95％的细胞融合(图1b)。
[0105]
接着，我们用多巴胺涂覆eptfe(图2a)，多巴胺能够自聚合并沉积在eptfe表面。结果显示，多巴胺涂层提高合成基材上的细胞密度并降低细胞死亡(图2b
‑
2c)。用纤维蛋白胶被来改善eptfe上的内皮细胞种植(zilla等，1989)。然而，该方法包括多个步骤，因此升级到大规模临床应用有困难。因此，我们研究了其他内皮细胞粘附剂如多巴胺是否可代替纤维蛋白胶用于细胞种植。我们比较了多巴胺涂覆eptfe上的细胞种植。如图2d所示，免疫染色显示多巴胺涂覆和纤维蛋白胶涂覆eptfe上的aec密度相当。这些数据表明，多种内皮细胞粘附剂可用于在聚合物基材上种植人aec。表1：化学组成明确的fvir培养基配方
[0106]
多巴胺涂覆和纤维蛋白胶涂覆eptfe的细胞种植效率比较
[0107]
纤维蛋白胶被用来改善eptfe上的内皮细胞种植(zilla等，1989)。然而，该方法包括多个步骤，因此升级到大规模临床应用有困难。因此，我们研究了其他内皮细胞粘附剂如多巴胺和细胞外基质是否可代替纤维蛋白胶用于细胞种植。我们比较了多巴胺、纤维蛋白胶、rgd(arg
‑
gly
‑
asp)肽、vtn(玻连蛋白)和层粘连蛋白涂覆eptfe上的细胞种植。如图2a所示，免疫染色显示多巴胺涂覆和纤维蛋白胶涂覆eptfe上的aec密度相当。如图2b所示，aec与rgd肽、玻连蛋白和层粘连蛋白涂覆的eptfe粘附良好。这些数据表明，多种内皮细胞粘附剂可用于在聚合物基材上种植人aec。
[0108]
aec
‑
eptfe显示较低白细胞粘附
[0109]
白细胞粘附增加是动脉粥样硬化开始的标志(de caterina等，1995；legein等，2013)。与静态培养的静脉内皮细胞相比，动脉内皮细胞(aec)表现出较低的白细胞粘附(zhang等，2017)，提示aec更抗动脉粥样硬化。为了研究人aec种植的eptfe材料(“aec
‑
eptfe移植物”)是否能维持动脉特异性流通功能，我们分别比较了种植aec和种植huvec(人脐静脉内皮细胞；“huvec
‑
eptfe移植物)的eptfe上的白细胞粘附情况。通过暴露于2μm钙黄绿素am约15分钟进行白细胞染色。然后将钙黄绿素am标记的白细胞按约1
×
106个细胞/ml的细胞密度加入aec
‑
种植和huvec
‑
种植的eptfe中。将钙黄绿素am标记的白细胞悬浮液和eptfe都置于0.5ml管中，60rpm旋转1小时。1小时后，将细胞种植的eptfe用新鲜培养基温和洗3次，然后固定并用dapi染色成像。为了模拟流体流经血管，白细胞粘附试验在剪切应力下进行。
[0110]
tnfα处理之前，我们观察到少量白细胞附着到aec种植和huvec种植的基材上(图3a)。tnfα处理后，大量白细胞附着到huvec
‑
eptfe移植物上，但aec
‑
eptfe移植物上附着的白细胞少得多(图3a
‑
3b)。结果显示，与静脉内皮化eptfe相比，aec
‑
eptfe对血管疾病的抗性更高。
[0111]
eptfe脱气抑制细胞聚集体形成并提高cd31表达和细胞密度
[0112]
eptfe血管移植物含70％体积的空气(bensen等，1991)。流体流动时，eptfe表面会产生气泡或气核(bensen等，1991)，这可能损害多巴胺涂层，从而损害内皮化。我们用丙酮
和乙醇进行脱气。将eptfe浸在丙酮中10
‑
60分钟，然后分别用100％etoh、90％etoh和70％etoh各漂洗30分钟。脱气后的eptfe用前保存在h2o中。脱气后，用多巴胺涂覆eptfe，然后种植aec。观察到cd31表达的平均荧光强度(红色染色)在脱气后升高(图4a、4c)。通过比较第8天脱气前后的细胞核数测得，脱气还提高了细胞种植基材上的细胞密度(图4a，4b)。此外，据cd31荧光强度测得，cd31表达也增加(图4a、4c)。观察到aec种植的eptfe样品2上有细胞聚集体形成(图4a)，但脱气处理减少了细胞聚集体的数量(图4a)。综上，这些数据表明脱气能促进eptfe内皮化。
[0113]
为了开发一种“现成”的产品，我们对用于aec
‑
eptfe血管移植物的各种低温保存溶液进行了测试。甘油被用于低温保存临床用人皮肤替代品(us20140271583a1)。然而我们的结果显示甘油不适合aec
‑
eptfe血管移植物的低温保存(图5a)。recovery
tm
细胞培养冷冻培养基(thermofisher公司)在5种不同贴壁细胞系和悬浮细胞系的低温保存中提高细胞活度，但当recovery
tm
用于冷冻aec
‑
eptfe血管移植物时，大多数细胞死亡(图5b)。通常，dmso与胎牛血清(fbs)组合被广泛用于低温保存(ha等，2005)。有趣的是，我们的结果表明，fbs降低冷冻aec
‑
eptfe移植物上的细胞存活率(图5b)。相比之下，含10％dmso的无血清培养基显示最高的细胞存活率，与非冷冻对照样品中的细胞存活率相当(图5b)。降低或提高dmso浓度对细胞存活不利(图5c)，表明10％dmso非常适合于aec
‑
eptfe血管移植物的低温保存。
[0114]
方法和材料
[0115]
纤维蛋白胶涂覆：用4ml热的纤维蛋白溶解抑制剂稀释一份2ml的纤维蛋白原，然后加入1ml氨甲环酸(20mg/ml)，由此制得纤维蛋白原组分(baxter，tisseel)。将2ml纤维蛋白原稀释在4ml cacl2、75ml h2o和4ml氨甲环酸(20mg/ml)中，由此制得凝血酶组分。纤维蛋白原组分流动通过eptfe，共三次。接着，凝血酶组分流动通过eptfe，共5分钟。eptfe用蒸馏水淋洗3次。涂覆步骤重复一次，然后用5ml 50u/ml肝素淋洗eptfe。
[0116]
多巴胺涂覆：将多巴胺溶于浓度为2mg/ml的10mm tris溶液(ph＝8.5)中。立即将eptfe浸入该溶液中，室温或37℃在溶液中孵育4
‑
24小时。经涂覆的eptfe用蒸馏水洗五次。
[0117]
eptfe上的细胞种植：将内皮细胞按密度(1.5
×
106个细胞/ml)悬浮于包含y27632(rock抑制剂)的细胞培养基中，将其种植到eptfe上。将eptfe放入试管中，然后装入细胞种植装置(endostradilisatorⅲ，biggler)。eptfe(于管内)以4rph旋转3小时。或者，可将eptfe孵育1小时，然后手动旋转90
°
，再孵育1小时。90
°
旋转重复4次。
[0118]
eptfe脱气：将eptfe浸在丙酮中3小时，然后，经丙酮处理的eptfe用70％乙醇洗30分钟(重复3次)，如此进行脱气。脱气的eptfe在蒸馏水中淋洗30分钟(重复3次)。从此刻起，eptfe需要浸在蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水(pbs)中以避免再充气。
[0119]
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