血管生成素样3多肽的持续递送的制作方法

本申请要求于2018年10月3日提交的的美国临时申请序列号62/740,609的权益，将所述专利通过引用以其整体特此并入。

本文描述了用于递送包含伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂的药物递送系统、其药学上可接受的盐、与其相关的药物递送剂、包含这些药物递送系统的药物组合物以及这些药物递送系统作为持续释放治疗剂的用途。

对序列表的引用

本申请与根据37c.f.r.§1.821(c)的计算机可读形式的序列表一起提交。所提交的文本文件“pat058317-wo-pct_sl.txt”是在2019年10月31日创建的，文件大小为99,303字节，并且通过引用以其整体特此并入。

背景技术：

药物在体内的物理化学或药代动力学特性的调节可能受到药物与载体缀合的影响。具体而言，药物与载体的缀合经常用作增加治疗作用的持续时间、降低施用后药物的最大浓度、或将药物局部递送至所需组织或区室、或这些目的的组合的方法。通常，药物递送系统中的载体抑或(a)以非共价方式与药物以物理化学方式配制成溶剂-载体混合物来使用，抑或(b)通过载体试剂的共价附接与药物中存在的官能团连接。

非共价方法需要高效的药物包封，以防止药物的可能发生在载体-药物系统的初始施用时或向受试者施用后载体降解期间的不受控制的突释。抑制未结合的水溶性药物分子的扩散需要强范德华接触，通常通过以下来介导：疏水性部分、氢键合或通过带电部分介导的静电结合。许多构象敏感的药物(例如蛋白质、肽或抗体)在包封过程期间和/或在包封的药物后续存储期间变得功能异常。

可替代地，药物可以通过稳定的接头或通过释放药物的可逆接头部分与载体共价缀合。如果药物稳定地连接到载体，则这样一种缀合物需要表现出足够的残余活性以具有药物作用，并且该缀合物始终处于活性形式。

如果药物通过可裂解的接头与载体缀合，则此类缀合物通常被称为载体连接的药物。此方法可以应用于来自低分子量有机分子、天然产物、抗体及其类似物、蛋白质、肽等的各种类型和大小的生物活性分子。对于载体连接的药物的重要考虑因素是从载体释放药物的机制。释放机制可以是酶促的、ph依赖性的或通过自主水解。通常，药物释放不容易可控制并且难以长时间维持。

在治疗应用中仍然需要适于生物活性部分的持续释放的新药物递送系统。本文描述了为治疗上相关的应用提供生物活性部分的持续释放的药物递送系统。

技术实现要素：

本文所述的一个实施例是一种由式(i)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

其中虚线表示与该伯胺附接；r¹是氢或c1-c4烷基；r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团与它们所附接的一个或多个碳原子一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；a是0、1、2、3或4；r³是氢或c1-c4烷基；r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；r¹²是氢或c1-c4烷基；r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；r¹³是c1-c4烷基；或者r¹²和r¹³与c(r^12a)和o一起组合形成5、6或7元环醚；r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；b是从1至10的整数；z是ch-l-a、ch-a、n-l-a或n-a；l是任选经取代的二价接头；a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；r¹⁰是适于将式(i)与载体偶联的反应性官能团；并且r¹¹是载体。在一方面，d包含与seqidno：1或3-45中任一个具有至少95％同一性的angptl3多肽。在另一方面，d包含seqidno：1或3-45中的任一个。在另一方面，d包含具有k423q取代或k423缺失的angptl3多肽。在另一方面，d包含含有氨基酸残基201-460；207-460；225-455；225-455；225-460；225-460；226-455；226-455；226-460；226-460；228-455；228-455；228-460；228-460；233-455；233-455；233-460；233-460；241-455；241-455；241-460；241-460；242-455；242-455；242-460；或242-460的angptl3多肽，各自参考seqidno：1。在另一方面，d包含与参考seqidno：1的氨基酸残基242-460具有至少95％同一性且含有k423q取代的angptl3多肽。在另一方面，d包含含有参考seqidno：1的氨基酸残基242-460和k423q取代的angptl3多肽d1(seqidno：19)。在另一方面，r¹是氢或甲基，r^1a是氢或甲基，或者cr¹r^1a一起组合形成环丙-1，1-二基基团。在另一方面，变量a是0。在另一方面，r³和r^3a各自是氢。在另一方面，y是c(o)r⁴，并且r⁴是c1-c6烷基、c3-c6环烷基或c1-c2烷氧基c1-c2烷基。在另一方面，r⁴是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基。在另一方面，y是sir⁵r⁶r⁷；r⁵和r⁶各自是甲基、乙基、丙基或异丙基；并且r⁷是c1-c4烷基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、2-乙氧基乙氧基、2-异丙氧基-乙氧基、四氢吡喃基氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中b是2、3或4。在另一方面，z是ch-l-a、ch-a、n-l-a或n-a；l是任选经取代的二价接头q-[sp-q]h-q；q在每次出现时独立地选自键、o、c(o)、n(h)、n(c1-c4烷基)、c(o)nh、c(o)n(c1-c4烷基)、n(h)c(o)、n(c1-c4烷基)c(o)、n(h)c(o)o、n(c1-c4烷基)c(o)o、oc(o)n(h)、oc(o)n(c1-c4烷基)、n(h)c(o)n(h)、n(c1-c4烷基)c(o)n(h)、n(h)c(o)n(c1-c4烷基)、n(c1-c4烷基)c(o)n(c1-c4烷基)、c(o)o、oc(o)、oc(o)o、s、s(o)2、n(h)s(o)2、n(c1-c4烷基)s(o)2、s(o)2n(h)、s(o)2n(c1-c4烷基)、c1-c2烷基-c(o)n(h)、n(h)c(o)c1-c2烷基、c1-c2烷基-c(o)o、oc(o)c1-c2烷基、1，2，3-三唑、op(o)2、p(o)2o、c1-c4烷基-p(o)2-o或o-p(o)2-c1-4烷基；sp在每次出现时独立地选自任选经取代的c1-c20烷基、c2-c20烯基、c2-c20炔基、[w-o]g、c1-c8烷基-[o-w]g、[o-w]g-o-c1-c8烷基、c1-c8烷基-[o-w]g-o-c1-c8烷基或寡肽；h是在1与20之间的整数；g是在约2与约50之间的加权平均数；w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；r¹⁰是适于将式(i)与载体偶联的反应性官能团；并且r¹¹是载体。在另一方面，z是chr⁸或nr⁹；r⁸和r⁹各自独立地选自氢、c1-c8烷基、c(o)-(ch2)n-q-a、c(o)c1-c8烷基或-c(o)(ch2)q[o-w]g(nhc(o))m(ch2)q[o-w]p-q-a，其中该烷基基团任选地经0或1个q-a取代；q在每次出现时独立地是1、2或3；g和p各自独立地具有在约2与约50之间的加权平均长度；m是1或0；w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；q是键、o、n(h)或n(c1-c4烷基)；a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；r¹⁰是适于将式(i)与载体偶联的反应性官能团；并且r¹¹是载体。在另一方面，z是nr⁹；r⁹是c(o)-(ch2)n-q-a或-c(o)(ch2)q[o-w]g(nhc(o))m(ch2)q[o-w]p-q-a；n是1至8的整数；并且a是r¹⁰或r¹¹。在另一方面，r¹⁰是叠氮基(azidyl)、炔基、经取代的或未经取代的c7-c12环炔基、经取代的或未经取代的c7-c12杂环炔基、经取代的或未经取代的c7-c12环烯基、降冰片基、经取代的或未经取代的乙烯基羧基、经取代的或未经取代的乙烯基磺酰基、经取代的或未经取代的c2-c8烯基、氨基、巯基(thiol)、经取代的或未经取代的c1-c8羧基、经取代的或未经取代的c1-c8羰基、-o-nh2、酰肼基、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、经取代的或未经取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精或金刚烷基。在另一方面，r¹⁰包含适于将式(i)的药物递送系统或药学上可接受的盐与载体偶联的反应性官能团。在另一方面，r¹¹是生物可降解的。在另一方面，r¹¹包含聚合物或交联聚合物。在另一方面，r¹¹包含含有一种或多种交联聚合物的水凝胶。在另一方面，r¹¹包含含有以下中的一种或多种的聚合物、交联聚合物或水凝胶：透明质酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚谷氨酸酯、聚赖氨酸、聚唾液酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚噁唑啉、聚亚胺基碳酸酯、聚氨基酸、亲水性聚酯、聚酰胺、聚氨酯、聚脲、葡聚糖、琼脂糖、木聚糖、甘露聚糖、卡拉胶、海藻酸盐、明胶、胶原、白蛋白、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基淀粉、壳聚糖、核酸、其衍生物、其共聚物或其组合。在另一方面，r¹¹包含透明质酸、聚乙二醇、透明质酸的交联水凝胶、聚乙二醇的交联水凝胶或其组合。在另一方面，r¹¹包含透明质酸或聚乙二醇。在另一方面，r¹¹包含含有交联透明质酸或交联聚乙二醇的水凝胶。在另一方面，该透明质酸或聚乙二醇被至少一个包含叠氮基、炔基、经取代的或未经取代的c7-c12环炔基、经取代的或未经取代的c7-c12杂环炔基、c7-c12环烯基、降冰片基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、c2-c8烯基、氨基、巯基、c1-c8羧基、c1-c8羰基、-o-nh2、卡巴肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、经取代的或未经取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精、金刚烷基或其组合的官能团官能化。在另一方面，r¹¹包含含有交联透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含至少一个选自-nh(w1)(o(w1))d-v的侧链，其中w1是c2-c4烷基-1，2-二基，其中氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；d是0至500的数均值；并且v是包含叠氮基、炔基、经取代的或未经取代的c7-c12环炔基、经取代的或未经取代的c7-c12杂环炔基、c7-c12环烯基、降冰片基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、c2-c8烯基、氨基、巯基、c1-c8羧基、c1-c8羰基、-o-nh2、卡巴肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、经取代的或未经取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精或金刚烷基的合适的官能团。在另一方面，v是叠氮化物。

本文所述的另一个实施例是一种用于制备交联载体配制品的方法，该方法包括：(a)官能化载体分子r¹¹；(b)制备反应性交联剂；以及(c)通过在约4℃至约60℃的温度下孵育约0.5小时至约48小时，使该官能化的载体分子与该反应性交联剂反应以形成交联载体。在一方面，该载体分子包含透明质酸或聚乙二醇。在另一方面，该载体分子被叠氮化物、巯基、胺、氨氧基(o-nh2)或醛部分官能化以提供用于交联的反应性官能团。在另一方面，该反应性交联剂的制备包括使聚乙二醇与1-((叔丁氧羰基)氨基)环丙烷-1-甲酸、3-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸、1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-甲酸、2-(1-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)环丙基)乙酸、2-甲基-3-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸或7-((叔丁氧羰基)氨基)庚酸反应和使该官能化的聚乙二醇酯去保护。在另一方面，该反应性交联剂的制备还包括在该官能化的聚乙二醇酯去保护后引入至少两个双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基基团。另一方面包括可使用本文所述的方法获得的交联水凝胶。在另一方面，该载体分子被叠氮化物官能化。

本文所述的另一个实施例是一种用于制备药物加合物的方法，该药物加合物包含与包含至少一个伯胺的angptl3多肽d偶联的无痕接头r，该方法包括：(a)提供包含至少一个伯胺的angptl3多肽d；(b)使该生物活性剂与具有活化的羰基官能团的无痕接头r反应；以及(c)从这些试剂中纯化该药物加合物。一方面是可使用本文所述的方法获得的药物加合物。

本文所述的另一个实施例是一种用于制备药物递送系统的方法，该方法包括：(a)制备载体分子r¹¹，其中r¹¹是交联水凝胶；任选地，步骤(a)还可以包括纯化该交联水凝胶载体分子r¹¹；(b)分开地使无痕接头r与包含至少一个伯胺的angptl3多肽d缀合，从而形成无痕接头-d加合物；步骤(b)还可以任选地包括对该无痕接头-d加合物的纯化；(c)使该载体分子r¹¹与该无痕接头-d加合物缀合；以及(d)从这些试剂中纯化该药物递送系统。一方面是使用本文所述的方法制备的药物递送系统。

本文所述的另一个实施例是一种用于治疗黄斑变性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用由式(i)表示的包含缀合物d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；r是适于释放d的接头：

其中虚线表示与该伯胺附接；r¹是氢或c1-c4烷基；r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；a是0、1、2、3或4；r³是氢或c1-c4烷基；r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；r¹²是氢或c1-c4烷基；r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；r¹³是c1-c4烷基；或者chr¹²or¹³一起组合形成5、6或7元环醚；r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被羟基、氨基、c1-c4烷氧基或单和双c1-c4烷基氨基取代；r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；b是从1至10的整数；z是chr⁸或nr⁹；r⁸和r⁹各自独立地选自氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基或-c(o)(ch2)q[o-w]g(nhc(o))m(ch2)q[o-w]p-q-a，其中该烷基基团任选地经0或1个q-a取代；q在每次出现时独立地是1、2或3；g和p各自独立地具有在约2与约50之间的加权平均长度；m是1或0；w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中该氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；q是键、o、n(h)或n(c1-c4烷基)；a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；r¹⁰是适于将式(i)与载体偶联的反应性官能团；并且r¹¹是载体。

本文所述的另一个实施例是一种用于治疗肌肉骨骼障碍的方法，该方法包括向有需要的受试者施用由式(i)表示的包含缀合物d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；r是适于释放d的接头：

其中虚线表示与该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子附接；r¹是氢或c1-c4烷基；r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；a是0、1、2、3或4；r³是氢或c1-c4烷基；r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；r¹²是氢或c1-c4烷基；r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；r¹³是c1-c4烷基；或者chr¹²or¹³一起组合形成5、6或7元环醚；r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被羟基、氨基、c1-c4烷氧基或单和双c1-c4烷基氨基取代；r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；b是从1至10的整数；z是chr⁸或nr⁹；r⁸和r⁹各自独立地选自氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基或-c(o)(ch2)q[o-w]g(nhc(o))m(ch2)q[o-w]p-q-a，其中该烷基基团任选地经0或1个q-a取代；q在每次出现时独立地是1、2或3；g和p各自独立地具有在约2与约50之间的加权平均长度；m是1或0；w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中该氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；q是键、o、n(h)或n(c1-c4烷基)；a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；r¹⁰是适于将式(i)与载体偶联的反应性官能团；并且r¹¹是载体。

本文所述的另一个实施例是一种用于治疗疾病或障碍的方法，该方法包括向有需要的受试者施用由式(i)表示的包含缀合物d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；r是适于释放d的接头：

其中虚线表示与该伯胺附接；r¹是氢或c1-c4烷基；r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；a是0、1、2、3或4；r³是氢或c1-c4烷基；r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；r¹²是氢或c1-c4烷基；r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；r¹³是c1-c4烷基；或者chr¹²or¹³一起组合形成5、6或7元环醚；r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被羟基、氨基、c1-c4烷氧基或单和双c1-c4烷基氨基取代；r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；b是从1至10的整数；z是chr⁸或nr⁹；r⁸和r⁹各自独立地选自氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基或-c(o)(ch2)q[o-w]g(nhc(o))m(ch2)q[o-w]p-q-a，其中该烷基基团任选地经0或1个q-a取代；q在每次出现时独立地是1、2或3；g和p各自独立地具有在约2与约50之间的加权平均长度；m是1或0；w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中该氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；q是键、o、n(h)或n(c1-c4烷基)；a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；r¹⁰是适于将式(i)与载体偶联的反应性官能团；并且r¹¹是载体。

本文所述的另一个实施例是一种用于延长包含至少一个伯胺的angptl3多肽d的半衰期的方法，该方法包括将d附接到由式(i)表示的r，其中r是适于释放d的接头：

其中虚线表示与该伯胺附接；r¹是氢或c1-c4烷基；r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；a是0、1、2、3或4；r³是氢或c1-c4烷基；r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；r¹²是氢或c1-c4烷基；r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；r¹³是c1-c4烷基；或者chr¹²or¹³一起组合形成5、6或7元环醚；r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被羟基、氨基、c1-c4烷氧基或单和双c1-c4烷基氨基取代；r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；b是从1至10的整数；z是chr⁸或nr⁹；r⁸和r⁹各自独立地选自氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基或-c(o)(ch2)q[o-w]g(nhc(o))m(ch2)q[o-w]p-q-a，其中该烷基基团任选地经0或1个q-a取代；q在每次出现时独立地是1、2或3；g和p各自独立地具有在约2与约50之间的加权平均长度；m是1或0；w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中该氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；q是键、o、n(h)或n(c1-c4烷基)；a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；r¹⁰是适于将式(i)与载体偶联的反应性官能团；并且r¹¹是载体。在一方面，d包含与seqidno：1或3-45中任一个具有至少95％同一性的angptl3多肽。

本文所述的另一个实施例是一种包含式(iii)的药物递送系统：

其中angptl3包含与seqidno：1或3-45中任一个具有至少95％同一性的angptl3多肽或其组合。

本文所述的另一个实施例是一种包含式(iv)的药物递送系统：

其中d1包含含有参考seqidno：1的氨基酸残基242-460和k423q取代的angptl3多肽(seqidno：19)。

本文所述的另一个实施例是一种包含d-r-r¹¹的药物递送系统，其中r包含与生物活性剂d偶联的无痕接头；d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r¹¹包含多种透明质酸聚合物，其中每种聚合物包含一系列随机的未官能化d-葡糖醛酸单体、一个或多个被交联剂官能化的d-葡糖醛酸单体或一个或多个被药物加合物d-r官能化的d-葡糖醛酸单体。在一方面，d包含与seqidno：1或3-45中任一个具有至少95％同一性的angptl3多肽。

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxiv)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d是包含至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxv)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxvi)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxvii)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxviii)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxix)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxx)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r⁴是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxxi)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

其中虚线表示与该伯胺附接；y是c(o)r⁴；r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；z是n-l-a；l是c(o)ch2ch2nh；a是r¹¹；r¹¹是衍生自交联透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含n(h)(ch2ch2o)3ch2ch2n3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联剂包含peg(2000)-双-[3-(((((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸酯]。

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxxii)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r⁴是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：

本文所述的另一个实施例是一种由式xxxiii表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

其中虚线表示与该伯胺附接；y是c(o)r⁴；r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；z是n-l-a；l是c(o)ch2ch2nh；a是r¹¹；r¹¹是衍生自交联透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含n(h)(ch2ch2o)3ch2ch2n3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联剂包含peg(2000)-双-[1-((((1′r，8′s，9′s)-双环[6.1.0]壬-4′-炔-9′-基)甲氧基)羰基)氨基-环丙烷-1-甲酸酯]。

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxxiv)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r⁴是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：

本文所述的另一个实施例是一种由式xxxv表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

其中虚线表示与该伯胺附接；y是c(o)r⁴；r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；z是n-l-a；l是c(o)ch2ch2nh；a是r¹¹；r¹¹是衍生自交联透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含n(h)(ch2ch2o)3ch2ch2n3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联剂包含peg(2000)-双-[1-((((1′r，8′s，9′s)-双环[6.1.0]壬-4′-炔-9′-基)甲氧基)羰基)哌啶-4-甲酸酯]。

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxxvi)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中药物d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r⁴是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：

本文所述的另一个实施例是一种由式xxxvii表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

其中虚线表示与该伯胺附接；y是c(o)r⁴；r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；z是n-l-a；l是c(o)ch2ch2nh；a是r¹¹；r¹¹是衍生自交联透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含n(h)(ch2ch2o)3ch2ch2n3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联剂包含peg(2000)-双-[7-(((((1′r，8′s，9′s)-双环[6.1.0]壬-4′-炔-9′-基)甲氧基)羰基)氨基)庚酸酯]。

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxxviii)表示的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中药物d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r⁴是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基：

本文所述的另一个实施例是一种由式(xxxix)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含含有至少一个伯胺的angptl3多肽；并且r是适于释放d的接头：

其中虚线表示与该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子附接；y是c(o)r⁴；r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；z是n-l-a；l是c(o)ch2ch2nh；a是r¹¹；r¹¹是衍生自交联透明质酸的水凝胶，其中该透明质酸包含n(h)(ch2ch2o)3ch2ch2n3的至少一个酰胺连接的侧链，并且其中用于形成该水凝胶的交联剂包含peg(2000)-双-[2-甲基-3-(((((1′r，8′s，9′s)-双环[6.1.0]壬-4′-炔-9′-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸酯]。在一方面，d是d1(seqidno：19)，并且r⁴是-ch3、-ch2ch3、-ch(ch3)ch3或甲基环丙基。在另一方面，d是d1(seqidno：19)，并且r⁴是-ch3。在另一方面，该d-r加合物包含：

附图说明

图1显示了包含通过无痕接头与载体缀合的药物的药物递送系统、和释放后的药物的动画。引发物的反应产生亲核官能团，该亲核官能团裂解将药物与药物递送系统连接的酰胺键。在此非限制性实例中，药物通过伯胺基团连接。

图2显示了水凝胶-药物缀合物的部分化学表示，其中水凝胶由与peg交联的透明质酸组成，并且药物通过具有引发物y的无痕接头与水凝胶缀合。在图2和整个说明书中，聚合物分子(例如透明质酸)表示为[p]n，其中p表示单体重复单元，并且n表示单体的重复单元平均数。对于任何给定的聚合物群体，重复单元数是随机分布的。另外，本文所述的水凝胶或药物递送系统的独立分子的相对连接性在群体内是随机的。水凝胶或药物递送系统的结构描绘表示二维的单个潜在的结构单元，然而这些复合物是具有许多结构亚单元的三维复合物。

图3a显示了无痕接头与叠氮化物官能化的透明质酸聚合物的示例性反应。

图3b显示了无痕接头与叠氮化物官能化的水凝胶的示例性反应。

图4a(说明性实例8.1)显示了d1(seqidno：19)从水凝胶缀合物的体外释放的实例。

图4b显示了d1(seqidno：19)从水凝胶缀合物c2-2的体外释放。

图5(说明性实例9)显示了d1(seqidno：19)从通过关节内注射而在大鼠中施用的水凝胶缀合物c2-2的体内释放。

具体实施方式

本文描述了用于递送包含伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂的药物递送系统、其药学上可接受的盐、与其相关的药物递送剂、包含这些药物递送系统的药物组合物以及这些药物递送系统作为持续释放治疗剂的用途。

如本文所用，术语“烷基”是指直链、支链或环状碳链。除非另有说明，烷基碳的一个或多个氢原子可以被取代基代替。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。当分子的两个部分通过烷基基团连接时，它也称为亚烷基。如本文所用，“低级烷基”是烷基的亚组，在一些实施例中是优选的，并且是指含有1至4个碳原子的直链或支链烃基。低级烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。除非另有指示，术语“烷基”或“低级烷基”旨在包括经取代的和未经取代的烷基或低级烷基，并且这些基团可以经另外的有机和/或无机基团取代，该另外的有机和/或无机基团包括但不限于选自以下的基团：卤代(例如，以形成卤代烷基)、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳基烷基、杂环、杂环烷基、羟基、烷氧基(从而产生聚烷氧基，例如聚乙二醇)、烯基氧基、炔基氧基、卤代烷氧基、环烷氧基、环烷基烷基氧基、芳基氧基、芳基烷基氧基、杂环氧基、杂环烷基氧基、巯基、氨基、烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、卤代烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、芳基氨基、芳基烷基氨基、杂环氨基、杂环烷基氨基、二取代的氨基、酰基氨基、酰基氧基、酯、酰胺、磺酰胺、脲、烷氧基酰基氨基、氨基酰基氧基、硝基、氰基烷基-s(o)m、卤代烷基-s(o)m、烯基-s(o)n、炔基-s(o)m、环烷基-s(o)m、环烷基烷基-s(o)m、芳基-s(o)m、芳基烷基-s(o)m、杂环-s(o)m或杂环烷基-s(o)m，其中m＝0、1、2或3。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“烯基”是指含有1至10、20或30个或更多个碳原子(或在低级烯基中，1至4个碳原子)的直链或支链烃，其在正链中包括1至4、5或6个或更多个双键。烯基的代表性实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-丁烯基、4-戊烯基、3-戊烯基、2-己烯基、3-己烯基、2，4-庚二烯等。除非另有指示，术语“烯基”或“低级烯基”旨在包括经取代的和未经取代的烯基或低级烯基，并且这些基团可以经如上文关于烷基和低级烷基所述的基团取代。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“炔基”是指含有1至10、20、30或40个或更多个碳原子(或在低级炔基中，1至4个碳原子)的直链或支链烃，其在正链中包括1、2或3个或更多个三键。炔基的代表性实例包括但不限于2-丙炔基、3-丁炔基、2-丁炔基、4-戊炔基、3-戊炔基等。除非另有指示，术语“炔基”或“低级炔基”旨在包括经取代的和未经取代的炔基或低级炔基，并且这些基团可以经如上关于烷基和低级烷基所述相同的基团取代。

如本文所用，术语“环炔基”是指在环结构中包括至少1个或多个三键的具有在6与16个之间的碳原子和1、2或3个稠合的或桥连的环的环状烃环系统。

如本文所用，术语“杂环炔基”是指在环结构中包括至少1个或多个三键的具有在6与16个之间的碳原子，1、2、3或4个独立地选自氧、氮和硫的杂原子以及1、2或3个稠合的或桥接的环的环状烃环系统。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“环烷基”是指含有3、4、5、6、7或8个碳(这些碳可以在如下所讨论的杂环基团中被代替)的饱和的或部分不饱和的环状烃基。环烷基的代表性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。这些环可以任选地经如本文所述的另外的取代基(例如卤代或低级烷基)取代。除非另有说明，术语“环烷基”是通用的并且旨在包括如下所讨论的杂环基团。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“杂环”或“杂环基”是指脂肪族的(例如，完全饱和的或部分饱和的杂环)或芳香族的(例如，杂芳基)单环的或双环的环系统。单环的环系统例示为含有1、2、3或4个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的任何3元至8元环。5元环具有0-2个双键，并且6元环具有0-3个双键。单环的环系统的代表性实例包括但不限于氮杂环丁烷、氮杂卓、氮杂环丙烷、二氮杂卓、1，3-二氧戊环、二噁烷、二噻烷、呋喃、咪唑、咪唑啉、咪唑烷、异噻唑、异噻唑啉、异噻唑烷、异噁唑、异噁唑啉、异噁唑烷、吗啉、噁二唑、噁二唑啉、噁二唑烷、噁唑、噁唑啉、噁唑烷、哌嗪、哌啶、吡喃、吡嗪、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡咯、吡咯啉、吡咯烷、四氢呋喃、四氢噻吩、四嗪、四唑、噻二唑、噻二唑啉、噻二唑烷、噻唑、噻唑啉、噻唑烷、噻吩、硫代吗啉、硫代吗啉砜、硫代吡喃、三嗪、三唑、三噻烷等。双环的环系统例示为与如本文所定义的芳基基团、如本文所定义的环烷基基团或如本文所定义的另一单环的环系统稠合的任何上述单环的环系统。双环的环系统的代表性实例包括但不限于例如苯并咪唑、苯并噻唑、苯并噻二唑、苯并噻吩、苯并噁二唑、苯并噁唑、苯并呋喃、苯并吡喃、苯并硫代吡喃、苯并二噁英、1，3-苯并间二氧杂环戊烯、噌啉、吲唑、吲哚、吲哚啉、中氮茚、萘啶、异苯并呋喃、异苯并噻吩、异吲哚、异吲哚啉、异喹啉、酞嗪、嘌呤、吡喃并吡啶、喹啉、喹嗪、喹喔啉、喹唑啉、四氢异喹啉、四氢喹啉、硫代吡喃并吡啶等。这些环包括其季铵化衍生物，并且可以任选地经另外的有机和/或无机基团取代，该另外的有机和/或无机基团包括但不限于选自以下的基团：卤代、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳基烷基、杂环、杂环烷基、羟基、烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、卤代烷氧基、环烷氧基、环烷基烷基氧基、芳基氧基、芳基烷基氧基、杂环氧基、杂环烷基氧基、巯基、氨基、烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、卤代烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、芳基氨基、芳基烷基氨基、杂环氨基、杂环烷基氨基、二取代的氨基、酰基氨基、酰基氧基、酯、酰胺、磺酰胺、脲、烷氧基酰基氨基、氨基酰基氧基、硝基、氰基、烷基-s(o)m、卤代烷基-s(o)m、烯基-s(o)m、炔基-s(o)m、环烷基-s(o)m、环烷基烷基-s(o)m、芳基-s(o)m、芳基烷基-s(o)m、杂环-s(o)m、杂环烷基-s(o)m，其中m＝0、1、2或3。

如本文所用，术语“杂芳基”如上关于杂环所述。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“环烷基烷基”、“环烷基烯基”和“环烷基炔基”是指分别通过如本文所定义的烷基、烯基或炔基基团附加到母体分子部分的如本文所定义的环烷基基团。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“烷氧基”是指通过氧基基团-o-附加到母体分子部分的如本文所定义的烷基或低级烷基基团(因此包括经取代的形式，例如聚烷氧基)。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。在一些方面，当烷氧基基团是较高复合物分子的一部分时，其包含通过醚键附加到烷基或低级烷基的烷氧基取代基。

如本文所用，术语“卤代”或“卤素”是指任何合适的卤素，包括-f、-cl、-br或-i。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“酰基”是指-c(o)r′自由基，其中r′是任何合适的取代基，例如芳基、烷基、烯基、炔基、环烷基或如本文所述的其他合适的取代基。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“烷硫基”是指通过如本文所定义的巯基部分附加到母体分子部分的如本文所定义的烷基基团。烷硫基的代表性实例包括但不限于甲硫基、乙硫基、叔丁硫基、己硫基等。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“酰胺”、“酰胺基(amido)”或“酰胺基(amidyl)”是指-c(o)nrarb自由基，其中ra和rb独立地是任何合适的取代基，例如烷基、氢、环烷基、烯基、炔基或芳基。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“酯”是指-c(o)or′自由基，其中r′是任何合适的取代基，例如烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“醚”是指-cor′自由基，其中r′是任何合适的取代基，例如烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“砜”是指-s(o)(o)r′自由基，其中r′是任何合适的取代基，例如烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基。

如本文所用，单独或作为另一基团的一部分的术语“磺酰胺”是指-s(o)2nrarb自由基，其中ra和rb独立地是任何合适的取代基，例如h、烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基。

如本文所用，术语“羧基”是指自由基-c(o)oh。

如本文所用，术语“羟基”是指自由基-oh。

如本文所用，术语“氨基”是指自由基-nh2。

如本文所用，乙烯基是指自由基-ch2ch2。

如本文所用，术语“磺酸酯”是指自由基-s(o)(o)or′，其中r′是任何合适的取代基，例如烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基。

如本文所用，术语“磺酰基”是指自由基-s(o)(o)r′，其中r′是任何合适的取代基，例如烷基、环烷基、烯基、炔基或芳基。

如本文所用，巯基(thiol)是指自由基-sh。

如本文所用，羟基胺或氨氧基是指自由基-onh2。

如本文所用，“酰肼”或“酰肼基”是指自由基-c(o)-nh-nh2。

如本文所用，“马来酰亚胺或马来酰亚胺基”是指具有分子式c2h2(c(o))2nh的环状化合物或具有至少一个c-c双键的自由基-n(c(o))2c2h2。

如本文所用，呋喃是指具有四个碳原子和一个氧的五元芳香族环。

如本文所用，“四嗪”或“四嗪基”是指具有分子式c2h2n4的含有四个氮原子的六元芳香族环或自由基-c2hn4。

如本文所用，术语“叠氮化物”、“叠氮基(azidyl)”或“叠氮基(azido)”是指-n3基团。

如本文所用，术语“bcn”是指双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基自由基，其中环外亚甲基可以具有相对于双环的外型或内型取向，如下所示：

如本文所用，在整个说明书中，为方便起见，大多数结构未描绘立体化学，因此代表所有可能的立体异构体。

具体而言，关于bcn与叠氮基化合物之间反应的三唑产物的结构，如本文所用，在整个说明书中，为方便起见，在单个区域化学位置上显示了三唑环上的n连接的取代基。本领域普通技术人员应认识到，bcn炔烃与叠氮基化合物的反应将产生三唑的1位和3位上具有n连接的取代基的产物的立体异构混合物，如下所示：

如本文所用，“反应性官能团”是指适于正交偶联反应的官能团。合适的反应性官能团是易于进行正交反应的那些。示例性且非限制性的正交化学反应包括表2中所示的官能团。

如本文所用，“引发物”是指存在于药物无痕接头加合物d-r中的官能团，其能够发生化学反应而产生新的官能团。新官能团的存在显著降低了药物与相关无痕接头之间的键的稳定性，并且导致药物释放的可能性增加。

术语“数均分子量”或“mn”是指样品中所有分子的统计平均分子量，以g/mol为单位表示。数均分子量可以通过本领域已知的技术来确定，例如凝胶渗透色谱法(其中mn可以基于已知标准基于在线检测系统例如折射率、紫外线或其他检测器来计算)、粘度测定法、质谱法或依数法(例如，蒸气压渗透法、端基测定或质子nmr)。数均分子量由以下方程式定义，

其中mi是分子的分子量，并且ni是该分子量的分子数。

术语“重均分子量”“mw”是指所有分子的统计平均分子量，在确定其对分子量平均值的贡献时考虑到每个分子的重量，以g/mol为单位表示。给定分子的分子量越高，该分子对mw值的贡献将越大。重均分子量可以通过对分子大小敏感的本领域已知的技术来计算，例如静态光散射、小角中子散射，x射线散射和沉降速度。重均分子量由以下方程式定义，

其中‘mi’是分子的分子量，并且‘ni’是该分子量的分子数。

术语“粘均分子量”“mv”是指所有分子的统计平均分子量，在确定其对分子量平均值的贡献时考虑到每个分子的重量，以g/mol为单位表示。大分子或聚合物具有比较小分子更高的粘度。粘均分子量由以下方程式定义，

其中‘mi’是分子的分子量，并且‘ni’是该分子量的分子数，并且a是由分子、溶剂和温度决定的常数。柔性聚合物分子具有0.5≤a≤0.8的a值。半柔性聚合物分子具有a≥0.8。粘均分子量可以通过特性粘度实验或尺寸排阻色谱法来确定。

如本文所用，“药物”包含一个或多个生物活性部分，其包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子。生物活性部分可以是小分子、大分子(例如蛋白质、肽或核酸)或其组合。具体关于无痕接头r，药物或生物活性部分包含在d-r表示中的“d”。术语或短语“药物”、“生物活性分子”、“生物活性部分”、“生物活性剂”、“活性剂”或“d”是指可以影响生物有机体(包括但不限于病毒、细菌、真菌、植物、动物和人)的任何物理或生化特性的任何物质。具体而言，药物或生物活性分子包括旨在诊断、治愈、缓解、治疗或预防人或其他动物疾病，或旨在以其他方式增强人或动物的身心健康的任何物质。

在一个实施例中，生物活性部分d包含血管生成素样3(angptl3)多肽。“angptl3”指血管生成素蛋白家族的成员。人angptl3的氨基酸序列(genbank登录号np_055310.1)列示于seqidno：1；并且相应的多核苷酸序列示为seqidno：2(ncbi参考序列号nm014495.2，其中angptl3编码序列包含seqidno：2的核苷酸52-1434)。参见表1。出于本披露的目的，通常参考全长野生型人angptl3多肽序列(seqidno：1)确定氨基酸的编号。因此，在本发明的多肽仅含有全长angptl3的c-末端部分但不含有n-末端部分的实施例中，尽管该肽的长度小于460个氨基酸，但这些位置的编号是基于seqidno：1。例如，对angptl3多肽的氨基酸位置423的提及是指seqidno：1的位置423，即使本发明的angptl3多肽本身长度可能仅为200个氨基酸。在确定目的序列中“对应于”参考序列(例如seqidno：1)中的位置的氨基酸时，这通过最佳地比对这些序列来进行，例如使用默认的clustal比对参数或默认的blast2比对参数并且比较这些序列来进行。例如，在“参考seqidno：1确定的”目的序列中的位置423或“对应于”seqidno：1的位置423的氨基酸意指当目的序列与seqidno：1最佳地比对时与seqidno：1的位置423对齐的氨基酸。

在一个实施例中，生物活性部分d包含angptl3多肽d1。如本文所用，d1是指具有seqidno：19的序列的angptl3多肽。

术语“肽模拟物”和“模拟物”是指合成的化学化合物，该化合物与天然或非天然存在的多肽(例如，angptl3)具有基本上相同的功能特征，但不同的(尽管通常是相似的)结构特征。肽类似物在本领域中通常用作和模板肽具有类似特性的非肽活性化合物(例如，药物)。此类非肽化合物被称为“肽模拟物”(“peptidemimetic”或“peptidomimetic”)。fauchere，j.adv.drugres.[高级药物研究杂志]15：29(1986)；veber和freidingertins第392页(1985)；evans等人j.med.chem.[药物化学杂志]30：1229(1987)。与治疗上有用的肽在结构上相似的肽模拟物可以用于产生等同或增强的治疗或预防效果。通常，肽模拟物与范例多肽(即，具有生物学或药理学活性的多肽)在结构上相似(例如在目的多肽中发现的)，但一个或多个肽键任选地被选自由例如以下组成的组的键代替：-ch2nh-、-ch2s-、-ch2-ch2-、-ch＝ch-(顺式和反式)、-coch2-、-ch(oh)ch2-和-ch2so-。模拟物可以完全由合成的非天然氨基酸类似物组成，或者是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。模拟物也可以掺入任何数量的天然氨基酸保守取代，只要此类取代也不实质地改变模拟物的结构和/或活性即可。例如，如果模拟物组合物能够具有angptl3多肽的成软骨活性，则该模拟物组合物落入本文所述的多肽的范围内。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中的一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所述的多肽、肽和蛋白质包含具有成软骨活性的蛋白酶抗性angptl3肽模拟物。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸、以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些、以及后来经修饰的那些氨基酸(例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(即，结合到氢、羧基基团、氨基基团和r基团的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的r基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸和硒代半胱氨酸。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子gca、gcc、gcg和gcu均编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述的相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异中的一种。本文中每一个由多核苷酸编码的多肽序列都涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员应认识到，核酸中的每个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子的aug和通常是色氨酸的唯一密码子的tgg)均可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。

技术人员应认识到，核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加(这相对于原始编码的氨基酸序列改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸)产生“保守修饰的变体”，其中该改变产生了对一个氨基酸用化学上相似的氨基酸的取代和/或如下多肽序列，该多肽序列产生与原始蛋白质具有相似功能活性的在结构上相似的蛋白质。提供在功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域是熟知的。此类保守修饰的变体是对如本文所述的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除这些多态变体、种间同源物和等位基因。

术语“保守氨基酸取代”是指来自一个这样的组的氨基酸被来自同一组的不同氨基酸取代(从概念上或以其他方式)。取代的一个实例是基于分析同源有机体的相应蛋白质之间的氨基酸变化的归一化频率。根据此类分析，可以定义氨基酸组，其中组内的氨基酸优先地彼此交换，因此就其对总体蛋白质结构的影响而言彼此最为相似。参见schulz和schirmer，principlesofproteinstructure[蛋白质结构原理]，springer-verlag[施普林格出版公司]。以这种方式定义的一组氨基酸基团的一个实例包括：(i)带电组，由glu和asp、lys、arg和his组成；(ii)带正电组，由lys、arg和his组成；(iii)带负电组，由glu和asp组成；(iv)芳香族组，由phe、tyr和trp组成；(v)氮环组，由his和trp组成；(vi)大脂肪族非极性组，由val、leu和ile组成；(vii)轻极性组，由met和cys组成；(viii)小残基组，由ser、thr、asp、asn、gly、ala、glu、gln和pro组成；(ix)脂肪族组，由val、leu、ile、met和cys组成；以及(x)小羟基组，由ser和thr组成。基于共有物理特性的保守取代的其他实例为以下组内的取代：(1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；(2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；(3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；(4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；(5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；(6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；(7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；以及(8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)。参见creighton，proteins[蛋白质](1984)。

“序列同一性百分比”通过在比较窗中比较两个最佳比对的序列来确定，其中比较窗中的氨基酸序列或多核苷酸序列部分与不包含添加或缺失的参考序列(例如，angptl3多肽)相比可以包含添加或缺失(即，空位)，以实现这两个序列的最佳比对。该百分比通过如下方式来计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置数，用该匹配位置数除于比较窗中的位置总数，结果乘以100，以得到序列同一性百分比。

在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或“同一性”百分比可以指两个或更多个作为相同序列的序列或子序列。当在比较窗或指定区域内进行比较和比对以寻求如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的最大对应时，如果两个序列具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域上或当没有规定时则在整个序列上，95％同一性，任选地96％、97％、98％或99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。分别与本文例示的多肽(例如，seqidno：1、3-45中的任一个)基本上相同的多肽及其用途，包括但不限于用于治疗或预防关节炎或关节损伤的用途。任选地，对于核酸，同一性存在于长度为至少约150个核苷酸的区域上、或更优选地长度为300至450个或600个或更多个核苷酸的区域上、或参考序列的全长上。任选地，对于氨基酸序列，同一性存在于长度为至少约50个氨基酸的区域上、或更优选地长度为100至150个或200个或更多个氨基酸的区域上、或参考序列的全长上。

为了序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

如本文所用，“比较窗”包括提及选自由50至600、通常约75至约200、更通常约100至约150组成的组的多个邻接位置中的任何一个的区段，其中在两个序列最佳比对后，可以将序列与相同数量的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域是熟知的。用于比较的序列最佳比对可以例如通过如下方式来进行：通过smith和waterman(1970)adv.appl.math.[应用数学进展]2：482c的局部同源性算法、通过needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.[分子生物学杂志]48：443的同源比对算法、通过pearson和lipman(1988)proc.nat’l.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85：2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实施(gap、bestfit、fasta和tfasta)或通过手动对齐和目视检查。参见例如，ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学实验指南](1995)。

适于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是blast和blast2.0算法，它们分别描述于altschul等人(1977)nuc.acidsres.[核酸研究]25：3389-3402和altschul等人(1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志]215：403-410。用于执行blast分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)公开地获得。此算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为w的短字来鉴定高评分序列对(hsp)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，该长度为w的短字匹配或满足一些正值阈值得分t。t被称为邻域词得分阈值(altschul等人，同上)。这些最初的邻域字命中点作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的hsp。字命中点沿着每个序列在两个方向上扩展，远至可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励得分；总是＞0)和n(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的延伸终止：累积比对得分从其最大获得值跌落数量x；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分走向零或更低；或到达任一序列的一端。blast算法参数w、t和x决定了比对的灵敏度和速度。blastn程序(对于核苷酸序列)使用字长(w)为11、期望值(e)为10、m＝5、n＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，blastp程序使用字长为3和期望(e)为10以及blosum62评分矩阵作为默认值。参见henikoff和henikoff，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：10915(1989)比对(b)为50、期望(e)为10、m＝5、n＝-4以及两条链的比较。

blast算法还执行两个序列之间相似性的统计分析。参见karlin和altschul，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90：5873-5787(1993)。由blast算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(p(n))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2、更优选地小于约0.01、最优选地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。

当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示该核酸或蛋白质被纯化为基本上不含天然状态下与其结合的其他细胞组分。它通常处于同质或接近同质的状态。它可以是干燥的或者是水溶液。纯度和均质性可以使用本领域已知且通常使用的分析化学技术(例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱法等)确定。作为制剂中存在的主要种类的蛋白质基本上得到纯化。在一些方面中，术语“纯化的”表示蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。通常，这意味着蛋白质为至少85％纯、更优选地至少95％纯、最优选地至少99％纯。

如本文所用，该angptl3多肽可以是天然的或重组的并且可以来自任何物种；angptl3肽也可以是合成的。在一方面，该angptl3多肽包含智人angptl3、其突变体、其缺失或其截短形式的序列。特别有用的是使用全长野生型人angptl3序列(seqidno：1)的编号包含氨基酸k423的突变体或缺失的angptl3多肽。在另一方面，该angptl3多肽在美国专利号9,301,971；9,649,359；9,745,358；9,868,771或欧洲专利号ep2964250中有描述，将其中的每一篇专利通过引用与angptl3多肽及其序列相关的具体指导而并入本文。在另一方面，该angptl3多肽是蛋白酶抗性多肽。在一方面，该angptl3多肽是相对于天然野生型肽序列在r或k残基上具有氨基酸取代的蛋白酶抗性多肽。

在另一方面，该angptl3多肽是d1(seqidno：19)，其包含使用全长野生型人angptl3序列(seqidno：1)的编号具有k423q突变的人angptl3的截短形式(例如，氨基酸242-460)。在另一方面，该angptl3多肽包含如表1所示的seqidno：1或3-45中的任一个。在另一方面，该angptl3多肽包含由seqidno：2或其突变体或缺失的dna序列编码的多肽。在一方面，该angptl3多肽包含与seqidno：1或3-45具有80％-99％同一性(包括指定范围内所有整数)的序列。在另一方面，该angptl3多肽包含与表1中所示的任何序列具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的氨基酸序列，其中该多肽在如参考seqidno：1所确定的位置423处包含作为除k或r之外的极性氨基酸的氨基酸。在一方面，该angptl3多肽具有成软骨活性。在另一方面，该angptl3多肽包含与seqidno：1或3-45中任一个具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的氨基酸序列。在另一方面，该angptl3多肽包含由与seqidno：2的编码部分(例如，核苷酸52-1434)具有90％-100％同一性的dna序列(包括编码突变、截断或缺失的dna序列)编码的多肽。

如本文所用，“包含至少一个伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分”是指在附接到无痕接头之前的游离生物活性部分或从无痕接头加合物“d-r”裂解后产生的游离生物活性部分“d-h”。在一些方面，该药物加合物d-r可能具有生物活性。在一些方面，生物活性部分包含如本文所述的angptl3多肽。

如本文所用，药物或生物活性部分的“游离形式”是指例如在附接到无痕接头之前或在药物递送系统中从无痕连接物释放后未修饰的药理活性形式的药物。

如本文所用，“无痕接头”r是由式(i)表示的适于释放包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分d的接头：

其中虚线表示与该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子附接；

r¹是氢或c1-c4烷基；

r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；

a是0、1、2、3或4；

r³是氢或c1-c4烷基；

r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；

r¹²是氢或c1-c4烷基；

r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r¹³是c1-c4烷基；或者

chr¹²or¹³一起组合形成5、6或7元环醚；

r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；

r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；

r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；

b是从1至10的整数；

z是ch-l-a、ch-a、n-l-a或n-a；

l是任选经取代的二价接头；

a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；

r¹⁰是适于将式i与载体偶联的反应性官能团；并且

r¹¹是载体。

在另一个实施例中，r是由式(i)表示的适于释放包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分d的接头：

其中虚线表示与该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子附接；

r¹是氢或c1-c4烷基；

r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；

a是0、1、2、3或4；

r³是氢或c1-c4烷基；

r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；

r¹²是氢或c1-c4烷基；

r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r¹³是c1-c4烷基；或者

chr¹²or¹³一起组合形成5、6或7元环醚；

r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；

r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；

r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；

b是从1至10的整数；

z是ch-l-a、ch-a、n-l-a或n-a；

l是任选经取代的二价接头q-[sp-q]h-q；

q在每次出现时独立地选自键、o、c(o)、n(h)、n(c1-c4烷基)、c(o)nh、c(o)n(c1-c4烷基)、n(h)c(o)、n(c1-c4烷基)c(o)、n(h)c(o)o、n(c1-c4烷基)c(o)o、oc(o)n(h)、oc(o)n(c1-c4烷基)、n(h)c(o)n(h)、n(c1-c4烷基)c(o)n(h)、n(h)c(o)n(c1-c4烷基)、n(c1-c4烷基)c(o)n(c1-c4烷基)、c(o)o、oc(o)、oc(o)o、s、s(o)2、n(h)s(o)2、n(c1-c4烷基)s(o)2、s(o)2n(h)、s(o)2n(c1-c4烷基)、c1-c2烷基-c(o)n(h)、n(h)c(o)c1-c2烷基、c1-c2烷基-c(o)o、oc(o)c1-c2烷基、1，2，3-三唑、op(o)2、p(o)2o、c1-c4烷基-p(o)2-o或o-p(o)2-c1-4烷基；

sp在每次出现时独立地选自任选经取代的c1-c20烷基、c2-c20烯基、c2-c20炔基、[w-o]g、c1-c8烷基-[o-w]g、[o-w]g-o-c1-c8烷基、c1-c8烷基-[o-w]g-o-c1-c8烷基、寡肽；

h是在1与20之间的整数；

g是在约2与约50之间的加权平均数；

w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中该氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；

a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；

r¹⁰是适于将式i与载体偶联的反应性官能团；并且

r¹¹是载体。

在另一个实施例中，r是由式(i)表示的适于释放包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分d的接头：

其中虚线表示与该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子附接；

r¹是氢或c1-c4烷基；

r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；

a是0、1、2、3或4；

r³是氢或c1-c4烷基；

r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；

r¹²是氢或c1-c4烷基；

r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r¹³是c1-c4烷基；或者

chr¹²or¹³一起组合形成5、6或7元环醚；

r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；

r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；

r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；

b是从1至10的整数；

z是chr⁸或nr⁹；

r⁸和r⁹各自独立地选自氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基或-c(o)(ch2)q[o-w]g(nhc(o))m(ch2)q[o-w]p-q-a，其中该烷基基团任选地经0或1个q-a取代；

q在每次出现时独立地是1、2或3；

g和p各自独立地具有在约2与约50之间的加权平均长度；

m是1或0；

w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中该氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；

q是键、o、n(h)或n(c1-c4烷基)；

a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；

r¹⁰是适于将式i与载体偶联的反应性官能团；并且

r¹¹是载体。

在一方面，该无痕接头是适于持续释放生物活性部分的接头。在一方面，“r”是在表示d-r中的无痕接头，其中“d”是指包含含有至少一个伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分的药物。

如本文所用，“药物加合物”是连接到无痕接头r的药物d。具体关于无痕接头r，该药物加合物包含“d-r”。

如本文所用，“载体”是可溶性聚合物、生物聚合物或交联聚合物或生物聚合物。载体包含蛋白质、核酸、碳水化合物或聚乙二醇。在一方面，该一种或多种载体是分子间地、分子内地或其组合地交联的。在一方面，该交联载体包含水凝胶。具体关于无痕接头r，该载体包含r¹¹。在一方面，z连接到载体，通常是聚合物或水凝胶。该载体直接或通过不可裂解的间隔子附接到该无痕接头r。作为非限制性实例，载体可以包含能够形成水凝胶的聚乙二醇、透明质酸聚合物或交联透明质酸或聚乙二醇。

如本文所用，“聚合物”是指由通过化学键以直链、环状、支链或树枝状方式或其组合连接的重复结构单元(单体)组成的分子，所述重复结构单元(单体)可以具有合成来源或生物来源或两者的组合。通常，聚合物具有至少1kda的平均分子量。共聚物是由至少两个在化学上不同的单体组成的聚合物。通常，聚合物由具有分子量分布的分子组成。描述聚合物分子量分布的一种方式是平均分子量。通常，聚合物由具有聚合度分布的分子组成。描述聚合物聚合度分布的一种方式是平均聚合度。

如本文所述和在本文结构中所描绘的，聚合物分子(例如聚乙二醇或透明质酸)表示为[p]n，其中p表示单体重复单元，并且n表示聚合物中单体的平均聚合度。本领域普通技术人员应理解，如果差异是n的约10％或更小，则用相同重复单元p但不同n描绘的两个聚合物分子被认为是等同的。对于本文结构中描述的和描绘的透明质酸共聚物，单体在聚合物中的分布是未限定的并且假定为随机的。另外，本文所述的水凝胶或药物递送系统的独立分子的相对连接性在群体内是随机的。水凝胶或药物递送系统的结构描绘表示二维的单个潜在的结构单元，然而这些复合物是具有许多结构亚单元的三维复合物。

如本文所述，对于无痕接头-药物加合物r-d，酰胺键形成的确切位置不能精确地了解。当d含有一个以上能够与接头r(例如，蛋白质或多肽)形成酰胺键的伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子时，会发生这种情况。为方便起见，本文描绘了酰胺键形成的位置未确切已知的加合物如下：

如本文所用，“水凝胶”是指能够吸收大量水的三维的亲水性或两亲性聚合物网络。该网络由均聚物或共聚物组成，并且由于共价化学或物理(离子、疏水性相互作用、缠结)交联的存在而不溶。该交联提供了网络结构和物理完整性。水凝胶表现出与水的热力学相容性，从而使其在水性介质中溶胀。网络的链以存在孔并且尺寸小于该孔的水溶性溶质能够在网络内外扩散的方式连接。

如本文所用，“接头”或“非生物活性接头”是指不产生任何药理作用的接头。在一些实施例中，该接头包含与生物系统相容的二价或多价有机接头。“二价”是指在聚合物的每个末端具有适于附接到无痕接头或药物d的反应性基团。“多价”是指在具有另外的沿着接头分子散布的反应性部分的聚合物的每个末端具有适于附接到无痕接头或药物d的反应性基团。

如本文所用，“药物递送系统”包含载体连接到药物加合物d-r-r¹¹，其中该载体包含r¹¹。如本文所述的药物递送系统是包含一种或多种药物d；一种或多种无痕接头r；和一种或多种载体r¹¹的分子缀合物。在一些实施例中，可以有多种不同的药物种类与药物递送系统缀合。例如，两种不同的药物(例如如本文所述的d1和另一种angptl3多肽)可以在单一药物递送系统中缀合。

如本文所用，短语“水不溶性”是指可膨胀的三维交联分子网络形成水凝胶。如果将水凝胶悬浮于大量过量的水或生理摩尔渗透压的水性缓冲液中，则可能会吸收大量的水，例如以重量/重量计多达10倍，因此是可溶胀的，但在除去多余的水后仍保留凝胶的物理稳定性和形状。这种形状可以属于任何几何形状，并且应理解，这种单个水凝胶对象应被认为是由组分组成的单个分子，其中每种组分通过化学键彼此连接。

如本文所用，“持续释放”或“持续释放速率”是指达到所需治疗效果所需的对应的药物递送系统的后续剂量之间的间隔扩大的情况。每日剂量的药物可以例如变成两次施用之间间隔一周或甚至更长时间的持续释放形式。

如本文所用，“官能团”是指分子内表现出特定化学活性的原子团。实例是酰胺、胺、醇、羰基化合物、羧酸、硫醇(thiol)。

如本文所用，“保护基”是指在合成期间暂时保护分子的官能团以在后续化学反应中获得化学选择性的部分。醇的保护基是例如苄基和三苯甲基，胺的保护基是例如叔丁氧基羰基、9-芴基甲基氧基羰基和苄基，并且对于硫醇，保护基的实例是2，4，6-三甲氧基苄基、苯硫基甲基、乙酰胺基甲基、对甲氧基苄基氧基羰基、叔丁硫基、三苯甲基、3-硝基-2-吡啶硫基、4-甲基三苯甲基。

如本文所用，“受保护的官能团”意指通过一个或多个保护基保护的官能团。

如本文所用，“pbs”是指磷酸盐缓冲盐水。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指保留生物活性剂的生物有效性和特性并且通常不是生物学或其他方面不期望的盐。在许多情况下，该生物活性剂能够因存在氨基和/或羧基基团或与之类似的基团而形成酸盐和/或碱盐。

药学上可接受的酸加成盐可以采用无机酸和有机酸形成，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、胆茶碱(chlortheophyllinate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳糖酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、碱式水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。

可以衍生出盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。

可以衍生出盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。

可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。

可以衍生出盐的无机碱包括例如铵盐和来自元素周期表第i至xii族的金属。在某些实施例中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。

可以衍生出盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺；经取代的胺(包括天然存在的经取代的胺)；环胺；碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星青霉素、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪或氨丁三醇。

药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从碱性或酸性部分的母体化合物合成。

通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学计量量的适当的碱(例如钠、钾、钙或镁的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应来制备，或者通过使这些化合物的游离碱形式与化学计量量的适当的酸反应来制备。此类反应通常在水中或在有机溶剂中或在二者的混合物中进行。通常，如果可行的话，使用非水性介质(像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈)是可取的。另外的合适的盐的列表可见于例如“remington'spharmaceuticalsciences[雷明顿药物科学]”，第18版，mackpublishingcompany[麦克出版公司]，宾夕法尼亚州伊斯顿，(1990)；以及stahl和wermuth的“handbookofpharmaceuticalsalts：properties，selection，anduse[药物盐手册：特性、选择和使用]”(wiley-vch出版社，德国魏因海姆，2002)。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，如本领域技术人员应已知的(参见例如，remington'spharmaceuticalsciences[雷明顿药物科学]，第18版mackprintingcompany[麦克出版公司]，1990，第1289-1329页)。除非任何常规载体与活性成分不相容，考虑了其在治疗或药物组合物中的使用。

术语生物活性剂的“治疗有效量”是指生物活性剂的将引起受试者的生物学或医学反应(例如，改善症状、减轻病症、减慢或延缓疾病进展或者预防疾病等)的量。

在另一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指生物活性剂的如下量，当施用细胞、或组织、或非细胞生物材料或介质时，该量可有效地至少部分地治疗疾病或障碍。如本领域普通技术人员应理解的，有效的特定药剂的绝对量可以根据诸如所需的生物学终点、待递送的药剂、靶组织等因素而变化。本领域普通技术人员理解，“治疗有效量”能以单剂量施用或这可以通过多剂量的施用来实现。例如，在药剂治疗心力衰竭的情况下，有效量可以是足以导致患者临床改善(例如，运动耐量/能力增加、血压升高、液体潴留减少/或在心脏功能的定量试验时结果改善，例如射血分数、运动能力(达到筋疲力尽的时间)等)的量。

如本文所用，术语“受试者”是指动物。通常，该动物是哺乳动物。受试者还指例如灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施例中，该受试者是灵长类动物。在又其他实施例中，该受试者是人。

如本文所用，术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibiting)”是指减轻或抑制给定的病症、症状、或障碍、或疾病，或者在生物活动或过程的基线活性方面的显著降低。

如本文所用，术语任何疾病或障碍的“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”在一个实施例中是指改善疾病或障碍(即，减慢或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指减轻或改善至少一种身体参数，包括不能被患者辨别的那些。在又另一个实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)或二者上调节疾病或障碍。在又另一个实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指预防或延缓疾病或障碍的发作或发展或进展。如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指防止由治疗(例如，治疗剂)的施用或治疗组合(例如，治疗剂组合)的施用而导致的受试者的障碍的一种或多种症状的复发、发作或发展。

如本文所用，如果受试者将在生物学上、在医学上或在生活质量上从治疗中获益，则该受试者是“需要(inneedof或inneedthereof)”这种治疗的。

如本文所用，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“该(the)”以及在本文中使用的类似术语(特别是在权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数二者，除非在本文中另有指示或与上下文明显相矛盾。

如本文所用，术语“约”是指在被术语“约”修饰的值的高达±10％的变化内的任何值，包括整数和分数部分二者。

术语“或”可以是连词的或转折的，使得“或”涵盖“和/或”。

本文所述的一个实施例是包含药物和无痕接头的药物加合物d-r，其中r是由式(i)表示的适于释放包含含有至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的angptl3多肽的d的接头：

其中虚线表示与该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子附接；

r¹是氢或c1-c4烷基；

r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；

a是0、1、2、3或4；

r³是氢或c1-c4烷基；

r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；

r¹²是氢或c1-c4烷基；

r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r¹³是c1-c4烷基；或者

chr¹²or¹³一起组合形成5、6或7元环醚；

r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；

r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；

r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；

b是从1至10的整数；

z是ch-l-a、ch-a、n-l-a或n-a；

l是任选经取代的二价接头；

a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；

r¹⁰是适于将式i与载体偶联的反应性官能团；并且

r¹¹是载体。

本文所述的另一个实施例是包含药物和无痕接头的药物加合物d-r，其中r是由式(i)表示的适于释放包含含有至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的angptl3多肽的d的接头；

其中虚线表示与该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子附接；

r¹是氢或c1-c4烷基；

r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；

a是0、1、2、3或4；

r³是氢或c1-c4烷基；

r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；

r¹²是氢或c1-c4烷基；

r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r¹³是c1-c4烷基；或者

chr¹²or¹³一起组合形成5、6或7元环醚；

r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；

r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；

r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；

b是从1至10的整数；

z是ch-l-a、ch-a、n-l-a或n-a；

l是任选经取代的二价接头q-[sp-q]h-q；

q在每次出现时独立地选自键、o、c(o)、n(h)、n(c1-c4烷基)、c(o)nh、c(o)n(c1-c4烷基)、n(h)c(o)、n(c1-c4烷基)c(o)、n(h)c(o)o、n(c1-c4烷基)c(o)o、oc(o)n(h)、oc(o)n(c1-c4烷基)、n(h)c(o)n(h)、n(c1-c4烷基)c(o)n(h)、n(h)c(o)n(c1-c4烷基)、n(c1-c4烷基)c(o)n(c1-c4烷基)、c(o)o、oc(o)、oc(o)o、s、s(o)2、n(h)s(o)2、n(c1-c4烷基)s(o)2、s(o)2n(h)、s(o)2n(c1-c4烷基)、c1-c2烷基-c(o)n(h)、n(h)c(o)c1-c2烷基、c1-c2烷基-c(o)o、oc(o)c1-c2烷基、1，2，3-三唑、op(o)2、p(o)2o、c1-c4烷基-p(o)2-o或o-p(o)2-c1-4烷基；

sp在每次出现时独立地选自任选经取代的c1-c20烷基、c2-c20烯基、c2-c20炔基、[w-o]g、c1-c8烷基-[o-w]g、[o-w]g-o-c1-c8烷基、c1-c8烷基-[o-w]g-o-c1-c8烷基、寡肽；

h是在1与20之间的整数；

g是在约2与约50之间的加权平均数；

w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中该氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；

a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；

r¹⁰是适于将式i与载体偶联的反应性官能团；并且

r¹¹是载体。

本文所述的另一个实施例是包含药物和无痕接头的药物加合物d-r，其中r是由式(i)表示的适于释放包含含有至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的angptl3多肽的d的接头：

其中虚线表示与该伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子附接；

r¹是氢或c1-c4烷基；

r^1a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r²在每次出现时独立地选自c1-c4烷基或氧代，或者两个r²基团一起组合形成稠合的c3-c6环烷基或螺c3-c6环烷-1，1-二基基团；

a是0、1、2、3或4；

r³是氢或c1-c4烷基；

r^3a是氢、c1-c4烷基，或者cr³r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

y是c(o)r⁴、c(o)or⁴、c(o)nhr⁴、c(o)nr⁵r⁶、sir⁵r⁶r⁷或cr¹²r^12aor¹³；

r¹²是氢或c1-c4烷基；

r^12a是氢或c1-c4烷基，或者cr¹²r^12a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基；

r¹³是c1-c4烷基；或者

chr¹²or¹³一起组合形成5、6或7元环醚；

r⁴是c1-c8烷基或c3-c7环烷基，其中环烷基任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代，并且其中烷基任选地被c1-c4烷氧基取代；

r⁵和r⁶各自独立地选自c1-c4烷基和c3-c6环烷基；

r⁷是c1-c8烷基、c3-c7环烷基、c1-c8烷氧基、c3-c7环烷氧基、杂环烷氧基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中该杂环烷氧基是具有一个选自n、o和s的环杂原子并且任选地经0、1或2个独立选择的c1-c4烷基基团取代的4至7元饱和杂环的环；

b是从1至10的整数；

z是chr⁸或nr⁹；

r⁸和r⁹各自独立地选自氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基或-c(o)(ch2)q[o-w]g(nhc(o))m(ch2)q[o-w]p-q-a，其中该烷基基团任选地经0或1个q-a取代；

q在每次出现时独立地是1、2或3；

g和p各自独立地具有在约2与约50之间的加权平均长度；

m是1或0；

w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中该氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；

q是键、o、n(h)或n(c1-c4烷基)；

a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；

r¹⁰是适于将式i与载体偶联的反应性官能团；并且

r¹¹是载体。

在一些方面，式(i)的r¹-r⁸具有以下含义。在一方面，r¹是氢或甲基。在另一方面，r^1a是氢或甲基。在另一方面，r¹和r^1a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基。在另一方面，r²是甲基。在另一方面，两个r²基团一起组合形成稠合的或螺c3-c6环烷基基团。在另一方面，r³是氢或甲基。在另一方面，r^3a是氢或甲基。在另一方面，r³和r^3a一起组合形成c3-c6环烷-1，1-二基。在另一方面，y是c(o)r⁴，并且r⁴是c1-c6烷基、c1-c2烷氧基、c1-c2烷基或c1-c6烷氧基。在另一方面，r⁴是甲基、乙基、丙基、异丙基、1-甲基-环丙基或甲氧基甲基。在另一方面，y是sir⁵r⁶or⁷；并且r⁵和r⁶各自是甲基、乙基、丙基或异丙基；并且r⁷是乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、乙氧基乙基、乙氧基异丙基、四氢吡喃基或-(ochr³ch2)bo-c1-c4烷基，其中b是2、3或4。

在一些方面，式(i)的r⁸和r⁹具有以下含义。在一方面，r⁹是c(o)c2氨基甲酰基。在另一方面，r⁹是c(o)c2酰胺基。在另一方面，r⁹是c(o)c5烷基。在另一方面，r⁹是c(o)c2烷基。在另一方面，r⁹是c(o)c1烷基。在另一方面，r⁹是c(o)ch2ch2nhc(o)ch2ch2ch2ch2。在另一方面，r⁹是c(o)(ch2ch2o)bch2ch2，其中b是1、2、3或4。在另一方面，r⁹是酰胺基。在另一方面，r⁹是氨基甲酰基。在另一方面，r⁹是c1烷基酰胺基。在另一方面，r⁹是c2烷基酰胺基。

在一些方面，z是ch-l-a、ch-a、n-l-a或n-a；

l是任选经取代的二价接头；

a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；

r¹⁰是适于将式i与载体偶联的反应性官能团；并且

r¹¹是载体。

在一些方面，z是ch-l-a、ch-a、n-l-a或n-a；

l是任选经取代的二价接头q-[sp-q]h-q；

q在每次出现时独立地选自键、o、c(o)、n(h)、n(c1-c4烷基)、c(o)nh、c(o)n(c1-c4烷基)、n(h)c(o)、n(c1-c4烷基)c(o)、n(h)c(o)o、n(c1-c4烷基)c(o)o、oc(o)n(h)、oc(o)n(c1-c4烷基)、n(h)c(o)n(h)、n(c1-c4烷基)c(o)n(h)、n(h)c(o)n(c1-c4烷基)、n(c1-c4烷基)c(o)n(c1-c4烷基)、c(o)o、oc(o)、oc(o)o、s、s(o)2、n(h)s(o)2、n(c1-c4烷基)s(o)2、s(o)2n(h)、s(o)2n(c1-c4烷基)、c1-c2烷基-c(o)n(h)、n(h)c(o)c1-c2烷基、c1-c2烷基-c(o)o、oc(o)c1-c2烷基、1，2，3-三唑、op(o)2、p(o)2o、c1-c4烷基-p(o)2-o或o-p(o)2-c1-4烷基；

sp在每次出现时独立地选自任选经取代的c1-c20烷基、c2-c20烯基、c2-c20炔基、[w-o]g、c1-c8烷基-[o-w]g、[o-w]g-o-c1-c8烷基、c1-c8烷基-[o-w]g-o-c1-c8烷基、寡肽；

h是在1与20之间的整数；

g是在约2与约50之间的加权平均数；

w是c2-c4烷基-1，2-二基，其中该氢、甲基或乙基侧链可以存在于任一主链碳原子上；

a是氢、c1-c8烷基、c(o)c1-c8烷基、c(o)oc1-c8烷基、c(o)n(h)c1-c8烷基、r¹⁰或r¹¹，其中该烷基基团任选地经0或1个r¹⁰取代；

r¹⁰是适于将式i与载体偶联的反应性官能团；并且

r¹¹是载体。

在某些方面，g和h是1至约25或1至约10。

在一些方面，式(i)的z是nr⁹。在一方面，r⁹进一步经r¹⁰取代。在另一方面，r⁹经一步经r¹¹取代。

根据式(i)，r¹⁰是适于用于正交偶联反应的反应性官能团。合适的反应性官能团是易于进行正交反应的那些。示例性且非限制性的正交化学反应包括表2中所示的官能团。对于表2中的给定行，官能团x(左列)适于用于和官能团y(右列)的偶联反应。偶联反应可以是共价键或分子间复合物。在多数实施例中，偶联反应产生共价键。在其他反应中，例如金刚烷与环葡聚糖，该偶联是非共价分子结合。在一方面，该官能团选自叠氮基、炔基、经取代的或未经取代的c6-c12环炔基、c6-c12杂环炔基、c6-c12环烯基、降冰片基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、c2-c8烯基、经取代的或未经取代的c1-c8烷氧基、巯基、c1-c8羧基、c1-c8羰基、羟基胺、卡巴肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、经取代的或未经取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精和金刚烷基。在另一方面，该官能团是经取代的c6-c12环炔基，其中该取代包括稠合的环丙基基团。在另一方面，该官能团是双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基。在另一方面，该官能团是叠氮基。

在一些实施例中，该无痕接头r包含式(ii)：

其中，r⁹和d均如上针对式(i)所定义，并且t1包含经取代的或未经取代的c2-c10酯、含有一个或多个选自氮或氧的杂原子的经取代的或未经取代的c3-c10甲硅烷基醚。

在一些方面，t1是-cr¹r^1aoy，其含有引发物部分并且包含表3中以下结构中的一种。

在一些实施例中，根据式i或ii的无痕接头r包含表4中以下结构中的任一种。

在另一个实施例中，式(i)或式(ii)的无痕接头r与药物或生物活性部分缀合。在一方面，式(i)或式(ii)的无痕接头r与angptl3多肽缀合。在另一方面，该angptl3多肽包含seqidno：1或3-45。在另一方面，该angptl3多肽包含d1(seqidno：19)。

无痕接头r的合成

另一个实施例是用于制造式(i)的无痕接头r的方法，该方法包括任何一个以下步骤：(a)使在c2位置处含有亲核基团的哌嗪化合物的n4氮与官能化酰基接头化合物反应以形成n4-酰基哌嗪：(b)使n4-酰基哌嗪的哌嗪环的n1氮羧甲基化，其中该羧基基团共价附接到合适的保护基团上；(c)使n4-酰基哌嗪的亲核基团与本文所述的引发物化合物反应；(d)如果需要，加工(elaborating)在n4上的官能化酰基接头以含有适于将无痕接头附接到载体化合物的官能团。在一方面，在哌嗪化合物的c2位置处的亲核基团包含羟基。在另一方面，在哌嗪化合物的c2位置处的亲核基团是伯醇。在另一方面，存在于步骤(a)或(d)的哌嗪化合物中的伯醇附接到合适的保护基团或引发物基团。在另一方面，该保护基团或引发物基团包含酯、甲硅烷基醚、缩醛、氨基甲酸酯、碳酸酯或含有二硅氧烷的化合物。在一方面，使n4羧甲基酯保护基团去保护以形成适于与包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂形成酰胺键的羧酸。在另一方面，在羧甲基化步骤中，该羧甲基化试剂的羧基基团通过酰胺键与包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂共价附接。在一方面，步骤a的官能团适于将无痕接头附接到载体化合物。

另一个实施例是用于制造式(i)的无痕接头r的方法，该方法包括任何一个以下步骤：(a)羧甲基化在c2位置处含有亲核基团的哌嗪化合物的n1氮，其中该羧基基团共价附接到合适的保护基团上；(b)使哌嗪化合物的n4氮与官能化烷基接头反应以形成n4-烷基哌嗪；(c)使n4-烷基哌嗪的亲核基团与本文所述的引发物化合物反应；(d)如果需要，加工在n4上的官能化烷基接头以含有适于将无痕接头附接到载体化合物的官能团。在一方面，在哌嗪化合物上的反应性基团包含羟基。在另一方面，在哌嗪化合物的c2位置处的亲核基团是伯醇。在另一方面，存在于步骤(a)或(d)的哌嗪化合物上的伯醇附接到合适的保护基团或引发物基团。在另一方面，该引发物化合物包含酯、甲硅烷基醚、缩醛、氨基甲酸酯、碳酸酯或含有二硅氧烷的化合物。在一方面，使n4羧甲基酯保护基团去保护以形成适于与包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂形成酰胺键的羧酸。在另一方面，在羧甲基化步骤中，该羧甲基化试剂的羧基基团通过酰胺键与包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂共价附接。在一方面，步骤a的官能团适于将无痕接头附接到载体化合物。

另一个实施例是用于制造式(i)的无痕接头r的方法，该方法包括任何一个以下步骤：(a)通过交联或取代反应于在c2位置处含有亲核基团的吡啶化合物的c4位置处引入官能化接头；(b)氢化4-取代的吡啶化合物以形成4-取代的哌啶化合物；(c)羧甲基化4-取代的哌啶化合物的n1氮，其中该羧基基团共价附接到合适的保护基团上；(d)使4-取代的哌啶化合物的亲核基团与本文所述的引发物化合物反应；(e)如果需要，加工在c4上的官能化烷基接头以含有适于将无痕接头附接到载体化合物的官能团。在一方面，在吡啶或哌啶化合物上的亲核基团包含羟基。在另一方面，在吡啶或哌啶化合物的c2位置处的亲核基团是伯醇。在另一方面，该引发物化合物包含酯、甲硅烷基醚、缩醛、氨基甲酸酯、碳酸酯或含有二硅氧烷的化合物。在一方面，使n4羧甲基酯保护基团去保护以形成适于与包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂形成酰胺键的羧酸。在另一方面，在羧甲基化步骤中，该羧甲基化试剂的羧基基团通过酰胺键与包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂共价附接。在一方面，步骤a的官能团适于将无痕接头附接到载体化合物。

合适的保护基团是可逆地连接到反应性官能团或化学官能团从而使其不能与例如其他化学官能团反应的部分。示例性且非限制性的氨基保护基团包括芴基亚甲基氧基(fluorenylmethylenoxy)基团(fmoc)、叔丁氧基羰基(boc)、羧苄基(cbz)等。示例性且非限制性的醇保护基团包括叔丁基醚、烯丙基醚、苄基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(tbdms)等。在整个合成过程中可以根据需要添加或去除去保护基团，以封闭和暴露特定部分。

在一个实施例中，用于制造无痕接头的方法是根据反应方案1-3。以下方案是用于制造无痕接头的通用且非限制性的方案。如本文实例中所示，一些合成路线不特别符合这些通用方案。在另一方面，用于制造无痕接头的方法是根据实例1中提供的反应方案。

方案1

其中一个或多个以上所示的步骤可以根据所用的试剂以不同的顺序进行或省略；

x是包含cl、o-nhs、o(c＝o)-r^2a或x-oh的活化基团，并且该反应包括标准肽偶联试剂，例如1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(hatu)；

r^2a是c1-c8烷基或芳基；

p4是合适的保护基团或h；

l是任选经取代的二价接头；

p1和p2是可以相同的保护基团；

y是表3中提供的合适的引发物；并且

fg包含一个或多个能够与本文所述的载体缀合的合适的官能团。

方案2

其中一个或多个以上所示的步骤可以根据所用的试剂以不同的顺序进行或省略；

其中，x2是活化基团，例如cl、br、i或三氟甲磺酸酯；

y、l、p1、p2、p4和fg是如方案1中所述的；

p3是可以与p1和p2相同的保护基团。

方案3

其中一个或多个以上所示的步骤可以根据所用的试剂以不同的顺序进行或省略；并且

l、p1、p2、p3、y和fg是如方案2中所述的。

如本文所述，通过使羧酸形式的无痕接头r与包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂的氨基基团反应以形成酰胺键来制备式(i)或式(ii)的加合物d-r。此方法描述于方案4中。使用合适的羧酸活化剂以促进酰胺键形成反应。作为一个实例，通过碳酸二琥珀酰亚胺基酯的作用，羧酸可以转化为氨基反应性形式以形成nhs酯；然后使无痕接头的nhs酯与含有氨基的药物d反应以形成加合物d-r。

在方案4中，l、y和fg是如方案1-3中所述的；d是包含至少一个伯胺或仲胺或者氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂。

方案4

本文所述的一个实施例是通过具有一个或多个官能团的接头附接到载体组合物的式(i)或式(ii)的无痕接头r。在一方面，该载体组合物包含如本文所述的无痕接头的r¹¹。在一方面，r¹¹包含通过接头连接到r⁸或r⁹的聚合物、生物聚合物或聚乙二醇。在一方面，该载体组合物是水凝胶。在一方面，该水凝胶组合物包含透明质酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯、聚谷氨酸酯、聚赖氨酸、聚唾液酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯/聚甲基丙烯酸共聚物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚噁唑啉、聚亚胺基碳酸酯、聚氨基酸、亲水性聚酯、聚酰胺、聚氨酯、聚脲、葡聚糖、琼脂糖、木聚糖、甘露聚糖、卡拉胶、海藻酸盐、明胶、胶原、白蛋白、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基淀粉、壳聚糖、核酸、其衍生物、其共聚物或其组合。在另一方面，r¹¹包含纳米颗粒或分子表面。在一方面，该水凝胶包含透明质酸或聚乙二醇。在另一方面，r¹¹包含透明质酸或聚乙二醇的交联水凝胶。在一方面，当该药物递送系统用于眼睛中或滑膜关节中时，r¹¹包含透明质酸或交联透明质酸。

如本文所述，r¹¹载体组合物可以交联以将多种分子结合在一起并促进水凝胶形成。交联可以使用本领域已知的任何方法来完成。参见例如，liu等人，“solutionprocessable，cross-linkedsulfurpolymersassolidelectrolytesindye-sensitizedsolarcells[可溶液处理的交联的硫聚合物作为染料敏化太阳能电池中的固体电解质]，”chem.commun.[化学通讯]51：14660-14662(2015)。在本文所述的一个实施例中，透明质酸或聚乙二醇被一个或多个表2中所示的官能团官能化以提供用于交联的反应性官能团。在另一方面，该透明质酸或聚乙二醇被选自以下的官能团官能化：叠氮基、炔基、经取代的或未经取代的c7-c12环炔基、c7-c12环烯基、经取代的或未经取代的c7-c12杂环炔基、乙烯基羧基、乙烯基磺酰基、c2-c8烯基、氨基、巯基、c1-c8羧基、c1-c8羰基、羟基胺、卡巴肼、马来酰亚胺、α-卤代羰基、呋喃、经取代的或未经取代的四嗪基、赖氨酸、谷氨酰胺、环糊精和金刚烷基。在另一方面，该透明质酸被叠氮基基团官能化。

官能化程度可以决定水凝胶的孔隙率。在一方面，约5％至约50％的载体聚合物被官能化，包括指定范围内的所有整数。在一方面，该载体聚合物被官能化约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％或甚至更多。

在一方面，该载体是透明质酸。在另一方面，使透明质酸与4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-鎓盐酸盐(cas号3945-69-5)和2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙胺(cas号134179-38-7)反应以形成叠氮化物官能化透明质酸([ha-n3])。在一方面，该反应是：

实验条件描述于实例3中。在一方面，约5％至约50％的透明质酸被官能化，包括指定范围内的所有整数。在一方面，该透明质酸被官能化约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％或甚至更多。

在另一个实施例中，聚乙二醇被各种试剂官能化以形成用于连接如上所述的官能化透明质酸单体的交联剂。

2kda的2臂peg-bcn交联剂的合成

在一方面，如所示，使mn约2kda的聚乙二醇二胺盐酸盐反应。反应条件描述于实例4中。

10kda的4臂peg-bcn交联剂的合成

在另一方面，如所示，使mn约10kda的4臂聚乙二醇胺盐酸盐(季戊四醇核心，键凯科技公司(jenkemtechnology))反应。反应条件描述于实例4中。

2kda的2臂β-丙氨酸peg-bcn交联剂的合成

在另一方面，如所示，使mn约2kda的聚乙二醇和3-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸反应。反应条件描述于实例4中。

2kda的2臂氨基环丙烷甲酸peg-bcn交联剂的合成

在另一方面，如所示，使mn约2kda的聚乙二醇和1-((叔丁氧羰基)氨基)环丙烷-1-甲酸反应。反应条件描述于实例4中。

本文所述的另一个实施例是一种或多种交联剂。在一方面，该交联剂包含式v：

在另一方面，该交联剂包含式vi：

在另一方面，该交联剂包含式via：

在另一方面，该交联剂包含式vib：

在另一方面，该交联剂包含式vic：

在另一方面，该交联剂包含式vii：

在另一方面，该交联剂包含式viii：

在另一方面，该交联剂包含式ix：

在本文所述的另一个实施例中，r¹¹包含已经与一种或多种交联剂反应的官能化载体，以形成交联载体。在一个实施例中，该交联载体形成水凝胶。在一方面，该交联载体是已经被官能化并且与一种或多种如本文所述的聚乙二醇交联剂交联的透明质酸，以形成水凝胶。

在一个实施例中，可以通过使适当官能化的聚合物反应来制备包含透明质酸的交联载体，如下所示：

尽管不受任何特定实例的束缚并且通过说明的方式，在一个实施例中，透明质酸钠盐由供应商生命中心生物医学公司(lifecorebiomedical)(ha200k，明尼苏达州的查斯卡)标记为各批次具有在151kda-300kda范围内变化的标称平均分子量，如通过粘度测定法确定的。出于本说明的目的，具有假定标称平均分子量200kda的透明质酸钠盐分子将由平均大约500个单体单元组成。在此结构和后续结构中，未经修饰的单体单元定义为“m”，用叠氮基基团修饰的单体单元定义为“n”，缀合到交联分子的叠氮基单体单元定义为“p”，并且缀合到无痕接头-药物加合物的叠氮基单体单元定义为“q”。对于包含≈500个单体单元的聚合物链，(n+m+p+q≈500)。如果透明质酸钠盐分子的修饰百分比是25％，则m＝75％，并且(n+p+q)＝25％。

类似地，存在于交联剂的一个实施例中的peg单元衍生自起始peg，该起始peg被描述为具有1kda、2kda、4kda、6kda、8kda或10kda的标称平均分子量，并且分别由22、45、91、136、181或226个重复的氧乙烯单体单元组成，在这些描绘的结构中被描述为“w”。在一些方面，w可以在约5与约250之间。在其他方面，w包含约5、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240或约250个氧乙烯单体单元。在其他方面，w是约20、约45、约90、约140、约180或约225。

在下式中，在一个实施例中，透明质酸的未经修饰的二糖重复单元(m)与透明质酸的经修饰的二糖重复单元(n+p+q)以随机分布的方式之和(＝m+n+p+q)可以包含约500个单元，如通过粘度测定法确定标称平均分子量为大约200kda。这适用于式x至式xxii。

在一方面，该交联载体包含式x：

在另一方面，该交联载体包含式xi：

在另一方面，该交联载体包含式xii：

在另一方面，该交联载体包含式xiia：

在另一方面，该交联载体包含式xiib：

在另一方面，该交联载体包含式xiic：

在另一方面，该交联载体包含式xiii：

本文所述的另一个实施例是药物加合物d-r，其中d是包含至少一个伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分；并且r是适于释放生物活性部分的接头。在一方面，d包含蛋白质、核酸、碳水化合物、肽、核苷酸、寡糖或小分子，其中的每一种具有至少一个伯胺或仲胺，并且小分子具有在约100g/mol与约2000g/mol之间的分子量。

本文所述的一个实施例是药物加合物d-r，其中d包含angptl3多肽。在一方面，d包含与seqidno：1或3-45中任一个具有至少95％同一性的angptl3多肽。在另一方面，d包含seqidno：1或3-45中的任一个。在另一方面，d包含具有k423q取代或k423缺失的angptl3多肽。在另一方面，d包含含有氨基酸残基201-460；207-460；225-455；225-455；225-460；225-460；226-455；226-455；226-460；226-460；228-455；228-455；228-460；228-460；233-455；233-455；233-460；233-460；241-455；241-455；241-460；241-460；242-455；242-455；242-460；或242-460的angptl3多肽，各自参考seqidno：1。在另一方面，d包含与参考seqidno：1的氨基酸残基242-460具有至少95％同一性且含有k423q取代的angptl3多肽。在另一方面，d包含含有参考seqidno：1的氨基酸残基242-460和k423q取代的angptl3多肽d1(seqidno：19)。

本文所述的另一个实施例是包含载体-无痕接头-生物活性剂缀合物的药物递送系统d-r-r¹¹，其中d包含如本文所述的包含至少一个伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性部分，r包含附接到包含如本文所述的载体聚合物或水凝胶的r¹¹的如本文所述的无痕接头。在一方面，r¹¹包含透明质酸、交联透明质酸、聚乙二醇、交联聚乙二醇或如本文所述的其他合适的聚合物。在另一方面，r包含如本文所述的无痕接头。在另一方面，d包含如本文所述的angptl3多肽。在一方面，d包含与seqidno：1或3-45中任一个具有至少95％同一性的angptl3多肽。在另一方面，d包含seqidno：1或3-45中的任一个。在另一方面，d包含具有k423q取代或k423缺失的angptl3多肽。在另一方面，d包含含有氨基酸残基201-460；207-460；225-455；225-455；225-460；225-460；226-455；226-455；226-460；226-460；228-455；228-455；228-460；228-460；233-455；233-455；233-460；233-460；241-455；241-455；241-460；241-460；242-455；242-455；242-460；或242-460的angptl3多肽，各自参考seqidno：1。在另一方面，d包含与参考seqidno：1的氨基酸残基242-460具有至少95％同一性且含有k423q取代的angptl3多肽。在另一方面，d包含含有参考seqidno：1的氨基酸残基242-460和k423q取代的angptl3多肽d1(seqidno：19)。

在另一个实施例中，d-r-r¹¹包含式xiv，其中“药物”包含含有seqidno：1或3-45中的一个或多个的angptl3多肽或与其具有至少90％同一性的多肽。

在一些实施例中，d-r-r¹¹包含式xv-xxiii中所示的种类中的任一种。

在一个实施例中，该药物或生物活性剂d包含含有seqidno：1或3-45中的一个或多个的angptl3多肽。

在一个实施例中，该药物或生物活性剂d包含具有seqidno：19的序列的d1。

本文所述的一个实施例是用于修复软骨的肽组合物。具体而言，与野生型angptl3多肽相比，如本文所述的angptl3肽具有增加的蛋白酶抗性。

本文所述的另一个实施例是用于施用angptl3多肽的组合物和方法，以通过向关节、软骨组织或软骨邻近组织中或全身性地施用本发明的多肽来预防或改善关节炎或关节损伤。还描述了用于诱导间充质干细胞分化为软骨细胞的组合物和方法。

本文所述的另一个实施例是用于组装药物递送系统的方法；该方法可以包括以下步骤序列中的一个：

(a)制备载体分子r¹¹，其中r¹¹是交联水凝胶，然后此步骤包括用于制备该水凝胶的方法；可以任选地在此阶段纯化该载体分子；

(b)分开地使无痕接头r与包含伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂d缀合，从而形成无痕接头-d加合物；可以任选地在此阶段纯化该无痕接头-d加合物，

(c)使该载体分子r¹¹与该无痕接头-d加合物缀合；以及

(d)从这些试剂中纯化该药物递送系统。此方法显示于以下方案5a中。

本文所述的另一个实施例是用于组装药物递送系统的方法，该方法包括以下步骤：

(a)制备载体分子r¹¹，其中r¹¹是交联水凝胶，然后此步骤包括用于制备该水凝胶的方法；可以任选地在此阶段纯化该载体分子；

(b)使无痕接头r与该载体分子r¹¹缀合，从而形成载体分子-无痕接头加合物，其可以任选地在此阶段进行纯化；

(c)使包含伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂d与该载体分子-无痕接头加合物缀合；以及

(d)从这些试剂中纯化该药物递送系统。此方法显示于以下方案5b中。

本文所述的另一个实施例是用于组装药物递送系统的方法，该方法包括以下步骤：

(a)制备未交联的载体分子r¹¹，可以任选地在此阶段纯化该载体分子；

(b)分开地使无痕接头r与包含伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂d缀合，从而形成无痕接头-d加合物；可以任选地在此阶段纯化该无痕接头-d加合物；

(c)使该载体分子r¹¹与该无痕接头-d加合物缀合，可以任选地在此阶段纯化该产物；

(d)通过将未交联的载体分子-无痕接头-生物活性剂r¹¹-r-d与适当的交联剂一起孵育以形成水凝胶来制备交联水凝胶；以及

(e)从这些试剂中纯化该药物递送系统。此方法显示于以下方案5c中。

本文所述的另一个实施例是用于组装药物递送系统的方法，该方法包括以下步骤：

(a)制备未交联的载体分子r¹¹，可以任选地在此阶段纯化该载体分子；

(b)使无痕接头r与该载体分子r¹¹缀合，从而形成载体分子-无痕接头加合物，其可以任选地在此阶段进行纯化；和

(c)使包含伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂d与该载体分子-无痕接头加合物缀合；

(d)通过将未交联的载体分子-无痕接头-生物活性剂r¹¹-r-d与适当的交联剂一起孵育以形成水凝胶来制备交联水凝胶；以及

(e)从这些试剂中纯化该药物递送系统。此方法显示于以下方案5d中。

本文所述的另一个实施例是用于组装药物递送系统的方法，该方法包括以下步骤：

(a)制备未交联的载体分子r¹¹，可以任选地在此阶段纯化该载体分子；

(b)使无痕接头r与该载体分子r¹¹缀合，从而形成载体分子-无痕接头加合物，其可以任选地在此阶段进行纯化；

(c)通过将未交联的载体分子-无痕接头-加合物r¹¹-r与适当的交联剂一起孵育以形成水凝胶来制备交联水凝胶，可以任选地在此阶段纯化该水凝胶；

(d)使包含伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性剂d与交联载体分子-无痕接头加合物缀合，可以任选地在此阶段纯化该产物；以及

(e)从这些试剂中纯化该药物递送系统。此方法显示于以下方案5e中。

方案5a-e。方案5显示了用于组装如本文所述的药物递送系统的五种方法a-e。

图例：

载体分子r¹¹，非交联

交联剂

载体分子r¹¹，交联水凝胶

无痕接头r

生物活性剂d

方案5a

方案5b

方案5c

方案5d

方案5e

在一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xiv)：

其中l2表示间隔子基团，其可以特异于特定的交联剂，并且“药物”表示包含至少一个伯胺、仲胺或氮杂杂芳基环的环氮原子的生物活性分子，该生物活性分子以治疗上有益的方式调节至少一种生物相关靶标。在一方面，“药物”包含如本文所述的angptl3多肽。在另一方面，“药物”包含与seqidno：1或3-45中任一个具有至少95％同一性的angptl3多肽。在另一方面，“药物”包含seqidno：1或3-45中的任一个。在另一方面，“药物”包含具有k423q取代或k423缺失的angptl3多肽。在另一方面，“药物”包含含有氨基酸残基201-460；207-460；225-455；225-455；225-460；225-460；226-455；226-455；226-460；226-460；228-455；228-455；228-460；228-460；233-455；233-455；233-460；233-460；241-455；241-455；241-460；241-460；242-455；242-455；242-460；或242-460的angptl3多肽，各自参考seqidno：1。在另一方面，“药物”包含与参考seqidno：1的氨基酸残基242-460具有至少95％同一性且含有k423q取代的angptl3多肽。在另一方面，“药物”包含含有参考seqidno：1的氨基酸残基242-460和k423q取代的angptl3多肽，例如d1(seqidno：19)。

在一个实施例中，间隔子l2包含表5中所示的任何种类。

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xv)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xvi)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xvii)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xviii)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xviiia)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xviiib)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xviiic)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xviiid)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xviiie)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xviiif)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

在另一个实施例中，该药物递送系统可以包含式(xxiii)，其中药物是如本文所述的angptl3多肽：

本文所述的另一个实施例是用于使用本文所述的药物递送系统治疗疾病或障碍的方法。本文所述的另一个实施例涉及由式(i)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，用作药剂。另一个实施例是由式(i)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐在制造用于治疗关节损伤或疾病(包括关节炎、骨关节炎、创伤性关节炎或急性关节损伤或创伤)的药剂中的用途。在一方面，本文所述的药物递送系统的药物组合物可以通过注射施用有需要的受试者。在一方面，施用可以通过注射或手术植入来完成。

本文所述的另一个实施例涉及由式(i)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，其中d包含与seqidno：1、3-45中的一个或多个具有至少95％序列同一性的angptl3多肽，用于治疗关节损伤或疾病，包括关节炎、骨关节炎、创伤性关节炎、急性关节损伤或创伤。在一方面，d包含d1(seqidno：19)。在一方面，该组合物是注射到关节中的溶液或悬浮液。在另一方面，该组合物是使用手术方法或通过大口径注射植入关节中的凝胶或半固体组合物。在另一方面，该组合物呈注射到关节中或关节附近的颗粒形式。在另一方面，该组合物作为最终原位吸收或加工的生物可降解的网或纱布植入关节内或周围。在另一方面，将组合物浸渍到缝合线、钉、板、网或在手术期间用于在创伤或疾病之后重新附接或修复肌腱、韧带、软骨、骨头或其他关节组件的类似物品中。在另一方面，该组合物是静脉内、动脉内、皮下、肌内或腹膜内递送的溶液或悬浮液。在另一方面，该组合物是使用手术方法或大口径注射植入的凝胶或半固体组合物。在另一方面，该组合物是局部或直接施用于皮肤伤口的凝胶或半固体组合物。

在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统以特定的释放速率释放生物活性剂。在一方面，释放速率可以通过无痕接头r的“引发物”组分来调谐或调节。不受任何理论的束缚，据信，在生理条件下，引发物的反应产生以分子内方式裂解连接药物与药物递送系统的酰胺键的亲核官能团，例如羟基官能团。在一个实施例中，该引发物的反应是导致羟基官能团的形成的水解反应。不受任何理论的束缚，据信，该引发物部分的空间位阻与引发物的较慢反应相关，并且吸电子基团的存在和接近与引发物的较快反应相关。

在一个实施例中，释放该生物活性部分的半衰期是约0.5小时、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年或长于4年。在一方面，该生物活性部分的释放半衰期是约2.5天、约4.5天、约7天、约10天、约11天、约12天、约14天、约15天、约21天、约28天、约30天、约31天、约32天、约40天、约58天、约60天、约65天、约70天、约80天、约125天、约165天、约380天、约940天或甚至更长。

在一个实施例中，该无痕接头引发物酯水解的半衰期是约0.5小时、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年或长于4年。在一方面，该无痕接头引发物酯水解的半衰期是约1天、约1.5天、约2天、约2.5天、约4天、约5天、约10天、约12天、约15天、约20天、约30天、约32天、约35天、约40天、约55天、约60天、约90天、约120天、约150天、约180天、约200天、约300天、约400天或甚至更长。

在另一个实施例中，在释放药物d后(例如，d-r-r¹¹→r-r¹¹+d)，药物递送系统r-r¹¹从该药物递送系统所给药的组织、器官或区室清除的半衰期是约0.5小时、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年或长于4年。

本文所述的其他实施例是包含如本文所述的药物递送系统d-r-r¹¹的药物组合物。在一方面，该药物组合物适于在有需要的受试者体内注射或植入。

适于通过注射或植入施用的药物组合物包括无菌水性溶液、悬浮液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末或冻干剂。

对于静脉内施用，合适的载体包括磷酸盐缓冲盐水(pbs)、生理盐水、林格氏溶液或注射用水。在所有情况下，该组合物应当是无菌的并且应当具有达到容易注射的程度的流动性。优选的药物配制品在制造和储存条件下是稳定的并且必须抗微生物(例如细菌和真菌)污染作用而保存。通常，相关载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、缓冲液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣(例如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选的是在该组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇)、氨基酸、山梨糖醇、氯化钠或其组合。可以通过在该组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)延长可注射组合物的吸收。

某些可注射组合物是水性等渗溶液或悬浮液，并且栓剂有利地由脂肪乳液或悬浮液制备。所述组合物可以灭菌和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂或其组合。另外，它们也可以含有其他有治疗价值的物质。所述组合物分别根据常规的混合、制粒或包衣方法来制备，并且含有约0.1％-75％、或含有约1％-50％的活性成分。

可以通过将所需量的药物递送系统与根据需要的成分中的一种或组合一起掺入适当的溶剂中、随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液或悬浮液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物(如无菌pbs和任何赋形剂)中来制备溶液或悬浮液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分的粉末以及来自其以前的无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。

透粘膜或透皮施用方法也是可能的。用于透皮施用的合适的组合物包括有效量的生物活性剂与合适的载体。适于透皮递送的载体包括帮助通过宿主皮肤的可吸收的药理学上可接受的溶剂。例如，透皮装置呈绷带的形式，该绷带包括衬件、含有化合物并任选地含有载体的贮库、任选地在延长的一段时间内以受控且预定的速率将化合物递送至宿主皮肤的控速屏障、以及将该装置固定至皮肤的器具。

用于局部施用(例如，施用至皮肤、眼睛或关节)的合适的组合物包括水性溶液、悬浮液、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂或可喷雾配制品(例如，用于通过气雾剂等递送)。此类局部递送系统特别地适合于表皮施用。因此，它们特别地适合用于本领域熟知的局部(包括化妆品)配制品中。此类局部递送系统可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂或防腐剂。

如本文所用，局部施用也可以涉及吸入或鼻内施用。它们可以在使用或不使用合适的推进剂的情况下自干燥粉末吸入器以干燥粉末的形式(单独的作为混合物，例如与乳糖的干燥掺混物，或经混合的组分颗粒，例如与磷脂混合的组分颗粒)或自加压容器、泵、喷雾、雾化器或喷雾器以气溶胶喷雾形式便利地递送。

本文还描述了包含一种或多种降低作为活性成分的本文所述的组合物分解速率的试剂的药物组合物和剂型。此类试剂在本文中称为“稳定剂”，包括但不限于抗氧化剂(例如抗坏血酸)、ph缓冲剂或盐缓冲剂等。

例如，待在治疗上使用的药物组合物的有效量将取决于治疗环境和目的。本领域技术人员应理解，用于治疗的适当剂量水平将因此部分地根据掺入药物递送系统中的治疗剂、药物递送系统使用的适应症、施用途径和患者大小(体重、体表面积或器官大小)和情况(年龄和一般健康状况)而改变。因此，临床医师可以递增剂量并且改变施用途径，以获得最佳治疗效果。

给药频率将取决于掺入所使用的药物递送系统中的治疗剂的药代动力学参数。通常，临床医师将施用组合物直至剂量达到实现所需效果为止。因此，可以将该组合物作为单剂量施用，作为两次或更多次剂量(其可以含有或不含有相同量的所需分子)随时间施用，或者作为通过植入装置或导管连续输注施用。适当剂量的进一步精简通常由本领域普通技术人员进行并且在他们通常所执行的任务范围内。可以通过使用适当的剂量反应数据确定适当剂量。

可以作为微粒的溶液或悬浮液制备药物递送系统。在一方面，该载体形成可以通过标准注射器施用(例如，皮下、关节内、肌腱内或肌内施用)至靶组织的微粒。此类颗粒可以具有在1μm与5000μm之间的平均粒径分布。其他方面包括已经用如本文所述的药物递送系统浸渍的生物可降解的纱布、网或缝合线。

在一些实施例中，本文所述的药物递送系统的微粒可以通过乳液聚合、平版印刷、旋压、模塑、喷雾干燥、研磨、挤出、机械粉碎或本领域已知的类似程序来生产。在一个实施例中，如本文所述的药物递送系统、载体聚合物或水凝胶可以通过网或筛挤出而分成微粒。在一方面，挤出可以重复多次和/或连续通过较小的网以获得所需颗粒分布尺寸。

在一个实施例中，基于测量粒径的激光衍射，当悬浮于等渗水性配制品缓冲液中时，该药物递送系统具有在1μm与5000μm之间的平均粒径分布。在一些方面，当悬浮于等渗缓冲液中时，该药物递送系统具有在10μm与1000μm之间的平均粒径分布。在另一方面，当悬浮于等渗水性缓冲液中时，该药物递送系统具有在50μm与500μm之间的平均粒径分布。在另一方面，当悬浮于等渗水性缓冲液中时，该药物递送系统具有在100μm与300μm之间的平均粒径分布。在另一方面，当悬浮于等渗水性缓冲液中时，该药物递送系统具有在200μm与300μm之间的平均粒径分布。在一些实施例中，平均粒径分布包含约10μm、约50μm、约100μm、约150μm、约200μm、约250μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm、约500μm、约750μm、约1000μm、约1500μm、约2000μm、约2500μm或约5000μm。

可以使用本领域普通技术人员已知的标准技术来确定粒径。可以用于测量药物递送系统颗粒的粒径分布的示例性技术可以包括激光衍射分析、光散射(例如，动态光散射)、微观颗粒图像分析、淘析或气溶胶质谱法。药物递送系统颗粒的样品可以作为干样品或湿样品来测量。可以使用用于测量粒径的任何可商购的仪器，包括来自西莱斯公司(cilas)；布鲁克海文仪器公司(brookhaveninstrumentscorporation)；马尔文仪器公司(malverninstruments)；堀场科学公司(horibascientific)；或怀亚特公司(wyatt)的仪器，根据制造商的说明书按照推荐的操作程序进行。

使用本文所述的技术测得的粒径可以表示为具有正态分布或非正态分布(具有粒径大小的均值、中值(例如，质量中值直径)和模式)的衍生的直径。粒径分布可以表示为直径数分布、表面积分布或颗粒体积分布。粒径分布的均值能以各种方式计算和表示，例如体积平均直径(d[4，3]或d43)、平均表面积直径(d[3，2]或d32)或平均数粒径(d[1，0]或d10)。由于粒径分布值会根据测量方法学和表达分布的方式而变化，因此，为了得出准确的比较结果，必须通过相同的方法学来计算不同平均粒径分布的比较。例如，必须将具有测量和计算出的体积平均直径的样品与具有测量和计算出的体积平均直径的第二样品进行比较，理想地使用相同测量仪器在相同条件下测量。因此，本文所述的特定粒径分布不旨在限于用于测量或计算粒径分布(例如，直径数分布、表面积分布或颗粒体积分布)的任何一种类型的方法，而是指示本文所述的每种测量粒径的方法的粒径值及其分布。

在一个实施例中，药物递送系统可以通过小于0.6mm内径(例如，20规格)的针头、优选地通过小于0.3mm内径(例如，25规格)的针头、更优选地通过小于0.25mm内径(例如，27规格)的针头、甚至更优选地通过小于0.2mm内径(例如，28规格)的针头、最优选地通过小于0.16mm内径(例如，30规格)的针头进行注射来施用。例如，当注射100μm至300μm粒度分布的药物递送系统时，20规格针头对于递送可能是最佳的。但是，由于颗粒形态具有柔性，因此可以成功地使用比药物递送系统粒径窄的针头尺寸。

短语和术语“可以通过注射施用”、“可注射的”或“可注射性”是指如下因素的组合，例如向含有在一定浓度(w/v)和一定温度下在液体中发生溶胀的本文所述的药物递送系统的注射器的柱塞上施加的一定力、与此注射器的出口连接的给定内径的针头以及通过针头从注射器挤出一定体积的药物递送系统所需的时间。

在一个实施例中，对悬浮于pbs或生理盐水中至浓度为约0.1％至约20％(w/v)(包括指定百分比范围内的所有整数)的药物递送系统进行了可注射性测量。

因此，就释放的药物d-h而言，该药物递送系统显示了受控释放速率的有益效果。优选地，获得了持续释放速率。持续释放意味着，与不存在药物递送系统的情况下的药物的施用相比，本文所述的对应的药物递送系统的施用间隔得以扩大。例如，基于通常每天施用一次或几次药物的药物递送系统提供了至少三天、至少一周、至少一个月、几个月或几年的治疗有效水平。

本文所述的另一个实施例是本文所述的药物递送系统的药物组合物。该药物组合物可以包含一种或多种赋形剂，例如：

(i)缓冲剂：将ph维持在所需范围内的生理上耐受的缓冲液，例如磷酸钠、碳酸氢盐、琥珀酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和乙酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化物、丙酮酸盐。也可以使用抗酸剂，例如mg(oh)2或znco3。可以调节缓冲能力以匹配对ph稳定性最敏感的条件。

(ii)等渗调节剂：用于将由于注射储器的渗透压差引起的细胞损伤可引起的疼痛最小化。甘油和氯化钠是实例。有效浓度可以使用假定的渗透压285-315mosmol/kg(对于血清)通过渗透法来确定。

(iii)防腐剂和/或抗微生物剂：多剂量肠胃外制剂可能需要添加足够浓度的防腐剂，以将受试者在注射后被感染的风险最小化，并且已经建立了相应的法规要求。典型的防腐剂包括间甲酚、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、硝酸苯汞、硫柳汞、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、氯甲酚和苯扎氯铵。

(iv)稳定剂：通过增强稳定蛋白质的力、通过变性状态的去稳定或通过赋形剂与蛋白质的直接结合来实现稳定性。稳定剂可以是氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸)、糖(例如葡萄糖、蔗糖、海藻糖)、多元醇(例如甘油、甘露糖醇、山梨糖醇)、盐(例如磷酸钾、硫酸钠)、螯合剂(例如edta、六磷酸盐)、配体(例如二价金属离子(锌、钙等))、其他盐或有机分子(例如苯酚衍生物)。另外，可以使用低聚物或聚合物，例如环糊精、葡聚糖、树状聚合物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、鱼精蛋白或人血清白蛋白。

(v)抗吸附剂：主要使用离子或非离子表面活性剂或其他蛋白质或可溶性聚合物来包衣或竞争性吸附到该组合物容器的内表面，例如泊洛沙姆(pluronicf-68)、peg十二烷基醚(brij35)、聚山梨醇酯20和80、葡聚糖、聚乙二醇、peg-聚组氨酸、bsa和hsa以及明胶。赋形剂的所选浓度和类型取决于待避免的作用，但通常在界面处仅在cmc值之上形成表面活性剂单层。

(vi)冻干或冷冻保护剂：在冷冻干燥或喷雾干燥期间，赋形剂可能会抵消由氢键断裂和脱水引起的去稳定作用。为此，可以使用糖和多元醇，但是针对表面活性剂、氨基酸、非水性溶剂和其他肽还观察到了相应的积极作用。海藻糖在减少水分引起的聚集方面特别有效，并且还改善可能由蛋白质疏水性基团暴露于水导致的热稳定性。当已知较高比例的甘露糖醇或蔗糖可以增强冻干饼的物理稳定性时，也可以将甘露糖醇和蔗糖作为冻干保护剂/冷冻保护剂单独使用或彼此组合使用。甘露糖醇也可以与海藻糖组合。海藻糖也可以与山梨糖醇组合，或者山梨糖醇可以作为唯一的保护剂使用。也可以使用淀粉或淀粉衍生物。

(vii)氧化保护剂：抗氧化剂例如抗坏血酸、四氢嘧啶、甲硫氨酸、谷胱甘肽、一硫代甘油、桑色素、聚乙烯基亚胺(pei)、没食子酸丙酯、维生素e，螯合剂例如柠檬酸、edta、六磷酸盐、巯基乙酸。

(viii)增粘剂或粘度增强剂：延迟小瓶和注射器中颗粒的沉降，并且用于促进颗粒的混合和重悬以及使悬浮液更易于注射(即，对注射器柱塞的力降低)。合适的增粘剂或粘度增强剂是例如卡波姆增粘剂(像carbopol940、carbopolultrez10)、纤维素衍生物(像羟丙基甲基纤维素(羟丙甲纤维素，hpmc)或二乙基氨基乙基纤维素(deae或deae-c))、胶体硅酸镁(veegum)或硅酸钠、羟基磷灰石凝胶、磷酸三钙凝胶、黄原胶、卡拉胶(像satiagumutc30)、脂肪族聚(羟基酸)(例如聚(d，l-或l-乳酸)(pla)和聚(乙醇酸)(pga)及其共聚物(plga))、d，l-丙交酯、乙交酯和己内酯的三聚物、泊洛沙姆、亲水性聚(氧乙烯)嵌段和疏水性聚(氧丙烯)嵌段以组成聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)的三嵌段(例如，pluronic.^tm)、聚醚酯共聚物(例如对苯二酸聚乙二醇酯/对苯二酸聚丁烯酯共聚物)、乙酸异丁酸蔗糖酯(saib)、葡聚糖或其衍生物、葡聚糖和peg的组合、聚二甲基硅氧烷、胶原、壳聚糖、聚乙烯醇(pva)和衍生物、聚烷基酰亚胺、聚(丙烯酰胺-共-二烯丙基二甲基铵(dadma))、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、葡糖氨基葡聚糖(gag)(例如硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素)、透明质酸、由疏水性a-嵌段(例如聚丙交酯(pla)或聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga))和亲水性b-嵌段(例如聚乙二醇(peg)或聚乙烯吡咯烷酮)组成的aba三嵌段或ab嵌段共聚物。此类嵌段共聚物以及上述泊洛沙姆可以表现出相反的热胶凝行为(在室温下为流动状态以促进施用，而在注射后在体温下为高于溶胶-凝胶转变温度的凝胶状态)。

(ix)扩散剂：通过间质空间中细胞外基质的组分(例如但不限于透明质酸，一种在结缔组织细胞间隙中发现的多糖)的水解来改变结缔组织的渗透性。铺展剂(例如但不限于透明质酸酶)暂时降低细胞外基质的粘度并且促进注射药物的扩散。

(x)其他助剂：例如润湿剂、粘度调节剂、抗生素、透明质酸酶。酸和碱(例如盐酸和氢氧化钠)是制造期间用于调节ph所必需的助剂。

该药物递送系统可以作为液体、悬浮液或作为干组合物提供。

在一个实施例中，该药物递送系统是干组合物。合适的干燥方法是例如喷雾干燥和冻干(冷冻干燥)。在一方面，该药物递送系统通过冻干来干燥。

在一个实施例中，该药物递送系统在该组合物中足量给药以提供在一次施用中生物活性剂持续至少12小时的治疗有效量。在一方面，药物递送系统的一次施用足以持续约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约2周、约3周、约4周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月、1年、2年、3年、4年或甚至更长。

在一个实施例中，该药物递送系统作为单剂量提供，意味着提供药物递送系统的容器含有一个药物剂量。

在另一个实施例中，该组合物作为多剂量组合物提供，意味着其含有多于一个的治疗剂量。优选地，多剂量组合物含有至少2个剂量。此类多剂量药物递送系统可以用于有需要的不同受试者，或者旨在用于一名受试者，其中剩余剂量在施用第一剂量之后储存直至需要。

在另一个实施例中，该药物递送系统包含在一个或多个容器中。对于液体或悬浮液组合物，该容器优选地为单室注射器。对于干组合物，优选地该容器是双室注射器。该干组合物提供于双室注射器的第一室中，并且重构溶液提供于双室注射器的第二室中。

在向有需要的受试者施用干药物递送系统之前，将该干组合物重构。重构可以在提供干药物递送系统的容器中进行，例如在小瓶、注射器、双室注射器、安瓿和药筒中进行。通过向干组合物中添加预定量的重构溶液完成重构。重构溶液是无菌液体(例如磷酸盐缓冲盐水、等渗盐水、注射用水或其他缓冲液)，其还可以含有赋形剂，例如防腐剂和/或抗微生物剂，例如苄醇和甲酚。优选地，该重构溶液是无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)或生理盐水。可替代地，该重构溶液是无菌注射用水。

另一个实施例是制备包含治疗有效量的药物递送系统和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂的重构组合物的方法，该方法包括使该组合物与一定体积的重构媒介物接触的步骤。然后可以通过注射或其他途径施用重构的药物递送系统。

另一个实施例是包含治疗有效量的药物递送系统、重构媒介物和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂的重构组合物。

另一个实施例是包含含有治疗有效量的药物递送系统和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂的溶液或悬浮液的预填充注射器。在一方面，该注射器填充有在约0.01ml与约5ml之间的如本文所述的药物递送系统。在一方面，该注射器填充有在约0.05ml与约5ml之间、在约1ml与约2ml之间、在约0.1ml与约0.15ml之间、在约0.1ml与约0.5ml之间、在约0.15ml与约0.175ml之间或约0.5ml至约5ml的如本文所述的药物递送系统。在一个实施例中，该注射器填充有0.165ml的如本文所述的药物递送系统。在一些方面，注射器填充有约0.01ml、约0.02ml、约0.03ml、约0.04ml、约0.05ml、约0.06ml、约0.07ml、约0.08ml、约0.09ml、约0.1ml、约0.2ml、约0.3ml、约0.4ml、约0.5ml、约0.6ml、约0.7ml、约0.8ml、约0.9ml、约1ml、约1.2ml、约1.5ml、约1.75ml、约2ml、约2.5ml、约3ml、约4ml或约5ml的如本文所述的药物递送系统。考虑到归因于注射器和针头内的“死腔”的损耗，注射器通常填充有比待施用患者的所需剂量多的剂量。当由医生灌注注射器时，也可能存在预定量的废物，以便准备好为患者注射。

在一个实施例中，取决于注射途径，注射器填充有在约0.01ml与约5ml之间(例如，在约0.01ml与约0.1ml之间、在约0.1ml与约0.5ml之间、在约0.2ml与约2ml之间、在约0.5ml与约5ml之间或在约1ml与约5ml之间)的剂量体积(即，旨在递送给患者的药剂体积)的如本文所述的药物递送系统。在旨在用于关节内注射的一个实施例中，注射器填充有在约0.05ml与约5.0ml之间的剂量体积的如本文所述的药物递送系统溶液或悬浮液，其中药物浓度为1mg/ml至40mg/ml。在旨在用于皮下注射的一个实施例中，注射器填充有在约0.1ml与约5.0ml之间的剂量体积的如本文所述的药物递送系统溶液或悬浮液，其中药物浓度为0.1mg/ml至40mg/ml。在旨在用于通过其他途径注射的其他实施例中，注射器填充有在约0.01ml与约5.0ml之间的剂量体积的如本文所述的药物递送系统溶液或悬浮液，其中药物浓度为0.1mg/ml至40mg/ml。在一些方面，注射器填充有约0.01ml、约0.02ml、约0.03ml、约0.04ml、约0.05ml、约0.06ml、约0.07ml、约0.08ml、约0.09ml、约0.1ml、约0.2ml、约0.3ml、约0.4ml、约0.5ml、约0.6ml、约0.7ml、约0.8ml、约0.9ml、约1ml、约1.2ml、约1.5ml、约1.75ml、约2ml、约2.5ml、约3ml、约4ml或约5ml的如本文所述的药物递送系统用于递送给有需要的患者。

由于注射器含有药剂溶液，出口可以可逆地密封以维持药剂的无菌性。这种密封可以通过本领域已知的密封装置(例如鲁尔锁(luerlock)或防篡改密封件)来实现，。

另一个实施例是包含一个或多个预填充注射器的试剂盒，该试剂盒包含如本文所述的一种或多种药物递送系统的溶液或悬浮液。在一个实施例中，这样一种试剂盒包含预填充注射器，该注射器包含在泡罩包装或密封套筒中的如本文所述的药物递送系统。泡罩包装或套筒的内部可以是无菌的。在一方面，如本文所述的预填充注射器可以在经受灭菌(例如终端灭菌)之前被放置在此类泡罩包装或套筒内。

这样一种试剂盒还可以包含一个或多个用于施用如本文所述的药物递送系统的针头。此类试剂盒还可以包含使用说明书、药物标签、禁忌症、警告或其他相关信息。本文所述的一个实施例是包含一个或多个预填充注射器、针头和任选地施用说明书、药物标签、禁忌症、警告或其他相关信息的纸盒或包装，该注射器包含在泡罩包装内所含的如本文所述的一种或多种药物递送系统。

可以使用终端灭菌方法对注射器进行灭菌，并且这样一个过程可以使用已知方法，例如环氧乙烷或过氧化氢(h2o2)灭菌方法。与注射器一起使用的针头以及本文所述的试剂盒可以通过相同的方法灭菌。在一方面，包装暴露于灭菌气体直至注射器的外部无菌。这样一个过程后，注射器的外表面可以保持无菌(在其泡罩包装中时)长达6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、24个月或更长时间。因此，在一个实施例中，如本文所述的预填充注射器(在其泡罩包装中)可以具有长达6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、24个月或更长时间的有效期。在一个实施例中，在储存18个月后，少于百万分之一的注射器在注射器外部具有可检测到的微生物存在。在一方面，已经使用具有至少10^-6的无菌保证水平的环氧乙烷对预填充注射器进行了灭菌。在另一方面，已经使用具有至少10^-6的无菌保证水平的过氧化氢对预填充注射器进行了灭菌。大量的灭菌气体不应当进入注射器的可变容积室。如本文所用，术语“大量”是指会导致在可变容积室内的药物递送系统溶液或悬浮液不可接受的改变的量。在一个实施例中，灭菌过程导致药物递送系统的烷基化≤10％(优选地≤5％、≤3％、≤1％)。在一个实施例中，已经使用环氧乙烷对预填充注射器进行了灭菌，但是注射器的外表面的环氧乙烷残留≤1ppm，优选地≤0.2ppm。在一个实施例中，已经使用过氧化氢对预填充注射器进行了灭菌，但是注射器的外表面的过氧化氢残留≤1ppm，优选地≤0.2ppm。在另一个实施例中，已经使用环氧乙烷对预填充注射器进行了灭菌，并且注射器的外表面和泡罩包装的内部发现的总环氧乙烷残留≤0.1mg。在另一个实施例中，已经使用过氧化氢对预填充注射器进行了灭菌，并且注射器的外表面和泡罩包装的内部发现的总过氧化氢残留≤0.1mg。

另一方面是部件试剂盒(kitofparts)。对于液体和悬浮液组合物，并且当施用装置仅是皮下注射器时，该试剂盒可以包含注射器、与注射器一起使用的针头和包含药物递送系统组合物的容器。在干组合物的情况下，该容器可以具有一个含有干药物递送系统组合物的腔室以及包含重构溶液的第二腔室。在一个实施例中，该注射装置是适合的皮下注射器，因此具有药物递送系统组合物的单独容器可以与注射装置接合，使得在使用时，容器中的液体或悬浮液或重构干组合物与注射装置的出口流体连通。施用装置的实例包括但不限于皮下注射器和笔式注射器装置。特别优选的注射装置是笔式注射器，在这种情况下，该容器是药筒，优选地一次性药筒。

另一个实施例包括试剂盒，该试剂盒包含针头和含有药物递送系统组合物并且任选地还含有重构溶液的容器，该容器适于与针头一起使用。在一方面，该容器是预填充注射器。在另一方面，该容器是双室注射器。

另一个实施例是含有如上文所述的药物递送系统组合物的与笔式注射装置一起使用的药筒。该药筒可以含有单剂量或多剂量的药物递送系统。

在另一个实施例中，该药物递送系统溶液或悬浮液包含药物递送系统和一种或多种赋形剂以及呈游离形式或作为药物或与其他药物递送系统(例如聚乙二醇化药物或水凝胶连接的药物)组合的其他生物活性剂。在一方面，此类另外的一种或多种生物活性剂是游离形式的药物或第二药物递送系统。

在另一个实施例中，同时施用一种或多种药物递送系统，其中每种药物递送系统具有单独或相关的生物活性。

在一个替代性实施例中，将该药物递送系统与第二生物活性化合物以这种方法组合，使得首先向有需要的受试者施用药物递送系统，随后施用第二化合物。可替代地，向有需要的受试者施用另一种化合物后，向同一名受试者施用药物递送系统组合物。

另一个实施例是由式(i)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，用作药剂。

另一个实施例是由式(i)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐，用于治疗肌肉骨骼障碍。

另一个实施例是由式(i)表示的包含d-r的药物递送系统或其药学上可接受的盐在制造用于治疗肌肉骨骼障碍的药剂中的用途。

另一个实施例是在治疗或预防疾病或障碍的方法中使用的药物递送系统或药物组合物，该疾病或障碍可以通过从药物递送系统中释放的生物活性部分来治疗。

另一个实施例是制造药物递送系统的溶液或悬浮液组合物的方法。在一个实施例中，此类组合物通过如下方式制备：

(i)将该药物递送系统与一种或多种赋形剂混合；

(ii)将相当于单剂量或多剂量的量的液体或悬浮液组合物转移到合适的容器中；以及

(iii)密封该容器。

另一个实施例是制造药物递送系统的干组合物的方法。在一个实施例中，此类组合物通过如下方式制备：

(i)将该药物递送系统与一种或多种赋形剂混合；

(ii)将相当于单剂量或多剂量的量转移到合适的容器中；

(iii)在所述容器中干燥该组合物；以及

(iv)密封该容器。

合适的容器是小瓶、注射器、双室注射器、安瓿和药筒。

另一个实施例是用于合成如上所定义的药物递送系统或其药学上可接受的盐的方法。药物递送系统或药物递送系统的前体可以通过已知方法或根据如下所述的反应顺序来制备。在药物递送系统或其前体的制备(合成)中使用的起始材料是已知的或可商购的，或者可以通过已知方法或如下所述来制备。

对于相关领域的普通技术人员容易清楚的是，在不脱离其任何实施例或方面的范围的情况下，可以对本文所述的组合物、方法和应用做出合适的修改和调整。所提供的组合物和方法是示例性的，并不旨在限制任何特定实施例的范围。本文披露的所有各个实施例、方面和选项能以任何和所有变化或迭代进行组合。本文所述的组合物、配制品、方法和过程的范围包括本文所述的实施例、方面、选择、实例和优选项的所有实际的或潜在的组合。

实例

缩写

方法

在一些以下实例中使用的

((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯的合成描述于a.m.jawalekar等人；molecules[分子]，2013，18，7346-7363中。

在一些以下实例中使用的

((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(4-硝基苯基)碳酸酯描述于j.dommerholt等人；angew.chem.int.ed.[德国应用化学国际版]2010，49，9422-9425中。

本文未具体描述合成的所有其他中间体和试剂是可商购的，并且可以按交付时使用。

lcms方法

方法1

柱sunfirec183.5μm3.0×30mm；柱温40℃；流速2.0ml/min；停止时间2.20min；ph2.2；洗脱剂a1在水中的0.05％tfa；洗脱剂b1乙腈；梯度时间(min)/％a(洗脱剂a1)：％b(洗脱剂b1)；0.00/95：5；1.70/5：95；2.00/5：95；2.10/95：5。

方法2

柱acquityuplcbehc181.7μm2.1×30mm；柱温50℃；流速1.0ml/min；停止时间2.00min；ph2.6；洗脱剂a1在水中的0.1％甲酸；洗脱剂b1在乙腈中的0.1％甲酸；梯度时间(min)/％a(洗脱剂a1)：％b(洗脱剂b1)；

0.00/98：2；0.10/98：2；1.50/2：98；1.80/2：98；1.90/98：2；2.00/98：2。

方法3

柱：kinetexc18100a(2.6μm100×4.6mm)；流动相a(在水中的0.1％甲酸)，b(乙腈)；梯度(时间(min)/％b)：0/5、1/30、3/95、4/95、4.1/5、6/5。

方法4

柱：acquityuplcbehc181.7μm2.1×30mm；柱温50℃；流速1.0ml/min；停止时间：2.00min；ph2.6；洗脱剂a1在水中的0.1％甲酸；洗脱剂b1在乙腈中的0.1％甲酸；梯度时间(min)/％a(洗脱剂a1)：％b(洗脱剂b1)；0.00/98：2；0.10/98：2；1.50/2：98；1.80/2：98；1.90/98：2；2.00/98：2。

方法5

柱：sunfirec183.5μm3.0×30mm；柱温40℃；流速2.0ml/min；停止时间2.20min；ph2.2；洗脱剂a1在水中的5mm氢氧化铵；洗脱剂b1乙腈；梯度时间(min)/％a(洗脱剂a1)：％b(洗脱剂b1)；0.00/95：5；1.70/5：95；2.00/5：95；2.10/95：5。

方法6

柱：kinetexc18100a(2.6μm100×4.60mm)；梯度/(时间(min)/％b)0/5、1/30、3/95、4/95、4.1/5、6/5；流动相：在水中的0.1％甲酸(a)/乙腈(b)；流速：1.4ml/min；柱温：40℃。

方法7

柱：synergimax-rp100amercury(2.5μm100×4.6mm)；流动相a(在水中的0.1％甲酸)，b(乙腈)；梯度(时间(min)/％b)：0/30、0.5/30、1.5/95、2.4/95、2.5/30、3.0/30。

方法8

柱：kinetexc18100a(2.6μm100×4.6mm)；流动相a(在水中的0.1％甲酸)，b(乙腈)；梯度(时间(min)/％b)：0/50、1/70、2/100、4/100、4.1/50、6/50。esi-ms数据记录于acquityg2xevo-qtof-ms上。使用masslynx软件包中的maxent1程序对正离子质谱进行解卷积。

方法9

柱：acclaimpepmapc4，5μm，(300μm×15cm)；流动相a(在水中的0.1％甲酸/乙腈(95％/5％))，b(在乙腈中的0.1％甲酸/异丙醇/水(47.5％/47.5％/5％))；梯度(时间(min)/％b)：0/5、2/5、10/40、11/95、13/95、14/5、20/5。将样品在meoh/h2o(50％/50％)中以1/100稀释，并且在联接到ultimate3000caplc的lumosorbitrapms系统上记录esi-ms数据。使用biopharmafinder3.0(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))对正离子质谱进行解卷积，并且报告了质量。

方法10

柱acquityuplchsst3c18(1.8μm2.1×50mm)；柱温60℃；流速1.0ml/min；停止时间2.00min；洗脱剂a1在水中的0.05％甲酸+3.75mm乙酸铵；洗脱剂b1在乙腈中的0.04％甲酸；梯度时间(min)/％a(洗脱剂a1)：％b(洗脱剂b1)0.00/95：5；1.40/2：98；1.80/2：98；1.90/95：5；2.00/95：5。在正负两种模式下使用电喷雾电离(esi)，将uplc仪器联接到单级四极质谱仪。报告了对(m+h)⁺的解卷积m/z。

实例1

无痕接头

此实例描述了许多能够与含胺药物和载体二者缀合的无痕接头的合成。

无痕接头的合成

共同中间体：l-int-1c

l-int-1c.1-(boc)-2-(羟基甲基)-4-(n-cbz-β-丙氨酰基)哌嗪

在250-ml烧瓶中装入2-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯sm-2(5.81g，26.9mmol)、3-(((苄基氧基)羰基)氨基)丙酸sm-1(5g，22.4mmol)和乙腈(100ml)。向此悬浮液中依次添加三乙胺(9.37ml，67.2mmol)、hobt(0.686g，4.48mmol)和edc.hcl(6.44g，33.6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15h。在此时间之后，将混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层依次用1mhcl溶液、nahco3饱和溶液洗涤，最后用盐水洗涤。将有机层经无水硫酸镁干燥，过滤并且使用旋转蒸发仪真空浓缩以得到呈无色油状物的l-int-1c(8.75g，83％产率)。将材料不经进一步纯化而用于下一步骤。ms(esi+；方法10)m/z422.5(m+h)。¹hnmr(500mhz，meoh-d4)δ7.49-7.27(m，5h)，5.15-4.98(m，2h)，4.56-4.27(m，1h)，4.19-3.83(m，3h)，3.61-3.37(m，4h)，3.29-2.55(m，5h)，1.49(s，9h)。

接头中间体xc

xa.1-(boc)-2-(乙酰氧基甲基)-4-(n-cbz-β-丙氨酰基)哌嗪

在500ml烧瓶中制备l-int-1c(8.6g，20.4mmol)在二氯甲烷(160ml)中的溶液。使用冰浴将溶液冷却至0℃，然后添加三乙胺(7.11ml，51.0mmol)，随后添加乙酰氯(1.74ml，24.48mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4h。在此时间之后，将混合物用水淬灭并且用二氯甲烷萃取。将合并的有机层依次用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤并且使用旋转蒸发仪真空浓缩以得到呈黄色油状物的xa(10.6g，95％产率)。将材料不经进一步纯化而用于下一步骤。ms(esi+；方法10)m/z464.3(m+h)。¹hnmr(500mhz，meoh-d4)δ7.48-7.27(m，5h)，5.18-5.01(m，2h)，4.54-3.84(m，6h)，3.47-3.36(m，2h)，3.19-2.51(m，5h)，2.33-2.01(m，3h)，1.49(s，9h)。可交换的质子在meod中不可见。

xb.1-(n-cbz-β-丙氨酰基)-3-(乙酰氧基甲基)哌嗪三氟乙酸盐

向xa(10.6g，19.44mmol)在二氯甲烷(160ml)中的0℃溶液中缓慢添加三氟乙酸(22.46ml，292mmol)。除去冰浴，并且将溶液在室温下搅拌6h。在此时间之后，将混合物浓缩至干以提供三氟乙酸盐xb，将其不经进一步纯化而使用。ms(esi+)m/z364.3(m+h)。¹hnmr(500mhz，meoh-d4)δ7.52-7.22(m，5h)，5.09(s，2h)，4.62-4.04(m，4h)，3.71-3.38(m，5h)，3.17-2.59(m，4h)，2.27-2.10(m，3h)。可交换的质子在meod中不可见。

xc.2-(乙酰氧基甲基)-4-(n-cbz-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸苄基酯

在250ml烧瓶中装入xb(16g，18.1mmol)、碳酸钾(7.50g，54.3mmol)和乙腈(160ml)。然后，添加2-溴乙酸苄酯sm-3(4.26ml，27.1mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌15h。在此时间之后，将反应混合物用水淬灭并且用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层依次用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤并且使用旋转蒸发仪真空浓缩。将粗混合物通过快速色谱法(biotageisolera，redisep柱：二氧化硅220g，洗脱剂a：二氯甲烷，洗脱剂b：二氯甲烷+meoh(9∶1)，梯度在20min内从0至100％b)纯化以得到不够纯的混合物。使用快速色谱法(biotageisolera，redisep柱：二氧化硅sikp-nh44g，洗脱剂a：环己烷，洗脱剂b：乙酸乙酯，梯度在20min内从0至100％b)进行第二次纯化以获得呈无色油状物的xc(6.52g，63％产率)。ms(esi+)m/z512.3(m+h)。¹hnmr(500mhz，meoh-d4)δ7.49-7.15(m，10h)，5.17(s，2h)，5.08(s，2h)，4.19-3.96(m，3h)，3.82-3.54(m，3h)，3.40(m，2h)，3.27-3.08(m，2h)，3.06-2.94(m，1h)，2.88-2.73(m，2h)，2.69-2.52(m，2h)，1.99(d，j＝5.1hz，3h)。可交换的质子在meod中不可见。

xd.2-(1′-甲基环丙基羰基氧基甲基)-4-(n-cbz-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸苄基酯

l-int-5a.1-(boc)-2-(1′-甲基环丙基羰基氧基甲基)-4-(n-cbz-β-丙氨酰基)哌嗪

向1-甲基环丙烷甲酸sm-4(47.5mg，0.475mmol)在二氯甲烷(2ml)中的溶液中添加edc·hcl(91mg，0.475mmol)和dmap(58.0mg，0.475mmol)。将反应在室温下搅拌30min并且添加l-int-1c(100mg，0.237mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15h。在此时间之后，将反应混合物用氯化铵饱和溶液淬灭并且用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层依次经无水硫酸镁干燥，过滤并且使用旋转蒸发仪浓缩至干。将粗残余物通过快速色谱法(teledyneisco，柱：redisep4g，洗脱剂a：二氯甲烷，洗脱剂b：二氯甲烷/meoh8∶2，梯度在20min内从0至100％b)纯化以得到呈浅黄色油状物的所需化合物(97mg，77％产率)。ms(esi+；方法10)m/z504.2(m+h)。

xd.2-(1′-甲基环丙基羰基氧基甲基)-4-(n-cbz-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸苄基酯

按照针对xb和xc的合成描述的通用方法，从l-int-5a以两步制备xd。l-int-5：uplc-ms(方法10)：保留时间＝1.18min；ms(esi+)m/z552.4(m+h)。¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ7.40-7.30(m，10h)，7.19-7.17(m，1h)，5.14-5.06(m，2h)，5.05-5.00(m，2h)，4.07-3.97(m，2h)，3.91-3.79(m，1h)，3.67-3.56(m，3h)，3.23-3.18(m，2h)，3.10-2.88(m，3h)，2.78-2.57(m，3h)，2.45-2.39(m，2h)，1.20(m，3h)，1.08-1.07(m，2h)，0.72-0.71(m，2h)。

无痕接头；l1-l7

l-2b：2-(乙酰氧基甲基)-4-(β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸双三氟乙酸盐

将xc(3g，5.86mmol)溶解于四氢呋喃(60ml)中，并且添加三氟乙酸(1.04ml，13.49mmol)，随后添加钯炭(0.624g，5.86mmol)。将烧瓶依次置于真空下并且用氢回填。重复该操作三次，并且将反应混合物在室温搅拌15h。在此时间之后，将混合物用二氯甲烷/甲醇混合物(9∶1，50ml)稀释并且通过硅藻土垫过滤。将硅藻土小心地用甲醇(50ml)洗涤，并且将合并的滤液真空浓缩以提供呈微黄色泡沫的粗标题材料l-2b(3.2g，95％产率)。ms(esi+)m/z288.3(m+h)。¹hnmr(500mhz，meoh-d4)δ4.50-4.16(m，3h)，4.10-3.82(m，3h)，3.72-3.39(m，4h)，3.29-3.20(m，3h)，2.92-2.76(m，2h)，2.11(d，j＝5.1hz，3h)。可交换的质子在meod中不可见。

l2.2-(乙酰氧基甲基)-4-(n-(((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基羰基)-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸

将粗l-2b(200mg，0.349mmol)吸收于二氯甲烷(2ml)和乙腈(3ml)中以提供轻微混浊的混合物。添加三乙胺(0.195ml，1.397mmol)和((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(112mg，0.384mmol)产生溶液，将其在1h后蒸发。将粗材料：(i)溶解于6ml的3∶1乙腈∶水中并且使用hplc(柱：watersxbridgebeh5μm19×150mm；方法：在水中的15％-30％乙腈10min梯度(10mm氢氧化铵)，30ml/min)纯化。将级分蒸发，快速冷冻并且冻干以提供l2；或(ii)直接吸附在isolute上并且通过反相色谱法(teledyneisco，柱：redisepc1815.5金，洗脱剂a：水，洗脱剂b：乙腈，梯度在20min内从10％至100％b)纯化冻干后以得到l2。白色粉末。uplc-ms(方法10)：保留时间＝0.71min；ms(esi+)m/z464.3(m+h)。¹hnmr(500mhz，meoh-d4)δ4.31-4.11(m，4h)，4.06-3.96(m，1h)，3.84-3.64(m，1h)，3.55-3.36(m，5h)，3.29-3.00(m，2h)，2.98-2.74(m，2h)，2.66-2.54(m，2h)，2.32-2.16(m，6h)，2.10-2.03(m，3h)，1.69-1.57(m，2h)，1.46-1.35(m，1h)，1.03-0.89(m，2h)。可交换的质子在meod中不可见。

表7中所示的种类是使用类似于l2的合成中所使用的那些的方法制备的。

无痕接头l8.2-(2′-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(6′-叠氮基己酰基)-1-哌嗪乙酸

l-8a.1-(boc)-2-(羟基甲基)-4-(6′-叠氮基己酰基)哌嗪

将6-叠氮基己酸(743mg，4.73mmol)和n-(3-二甲基氨基丙基)-n′-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.0g，5.22mmol)称重到圆底烧瓶中并且溶解于二氯甲烷(20ml)中。5min后，添加固体2-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.98g，4.53mmol)和二异丙基乙胺(1.0ml，5.73mmol)并且将溶液在室温下储存过夜。第二天，将反应混合物用100ml二氯甲烷稀释并且用1mhcl(2×50ml)、1mnaoh(1×50ml)和盐水(1×50ml)洗涤。浓缩有机相以提供l-8a。ms(esi+)m/z356.3(m+h)。

l-8b.1-(boc)-2-(2′-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(6″-叠氮基己酰基)哌嗪

在圆底烧瓶中，将l-8a(959mg，2.70mmol)溶解于二氯甲烷(12ml)中。添加搅拌棒和二异丙基乙胺(1ml，5.73mmol)，随后添加2-甲氧基乙酰氯(0.32ml，3.51mmol)，并且将烧瓶盖上。将反应在室温下搅拌。6h后，添加100μl另外的2-甲氧基乙酰氯。30min后，将反应混合物用90ml乙酸乙酯稀释并且用1mhcl(2×25ml)和盐水(1×20ml)洗涤。将有机相使用旋转蒸发仪浓缩。将产物通过二氧化硅快速柱色谱法(使用乙酸乙酯：庚烷梯度)纯化。将含有产物的级分合并并且浓缩以提供l-8b。ms(esi+)m/z＝428.3(m+h)。

l-8c.1-(6′-叠氮基己酰基)-3-(2″-甲氧基乙酰氧基甲基)哌嗪三氟乙酸盐

将l-8b(846mg，1.979mmol)溶解于三氟乙酸(10ml，130mmol)和二氯甲烷(10ml)中。将溶液在室温下搅拌。1h后，使用旋转蒸发仪除去溶剂，并且将产物在真空下干燥以提供l-8c。ms(esi+)m/z328.2(m+h)。

l-8d.2-(2′-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(6″-叠氮基己酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁基酯

在带有搅拌棒的玻璃小瓶中，将l-8c(439mg，0.994mmol)溶解于二甲基甲酰胺(5ml)中。添加溴乙酸叔丁酯(0.220ml，1.491mmol)和二异丙基乙胺(0.868ml，4.97mmol)，并且将小瓶盖上。将反应在50℃下搅拌过夜。第二天，将反应混合物从热源中除去并且在-20℃下储存直至第二天纯化。将反应混合物在不进行萃取后处理的情况下通过二氧化硅快速柱色谱法(使用庚烷：乙酸乙酯梯度)纯化。将含有产物的级分合并并且浓缩以提供l-8d。ms(esi-)m/z＝486.5(m+甲酸酯)。

l8.2-(2′-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(6″-叠氮基己酰基)-1-哌嗪乙酸

将l-8d(150mg，0.317mmol)溶解于二氯甲烷(5ml)和三氟乙酸(5ml)中，并且将反应在室温下搅拌过夜。第二天，将溶液使用旋转蒸发仪浓缩并且将残余物再溶解于4ml乙腈中。将溶液过滤并且通过制备型反相hplc与质量导向级分收集纯化(方法如下)。将含有产物的级分合并，冷冻并且冻干以提供l8。ms(esi+)m/z＝386.5(m+h)。制备型hplc条件：waterssunfirec18；粒径：5μm；柱尺寸：30×50mm；洗脱剂/梯度：10％ch3cn/h2o/0.7min、10％-30％ch3cn/h2o/3.5min、30％-95％ch3cn/h2o0.5min(ch3cn和含有0.1％tfa的h2o)；流速：75ml/min；柱温：室温；收集m/z：+385。

无痕接头：l9-l11

l-9a.2-(丙酰基氧基甲基)-4-(n-cbz-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸三氟乙酸盐

在0℃下，将l-int-3(250mg，0.51mmol)溶解于二氯甲烷(5ml)中，然后用三氟乙酸(2.5ml)处理并且在氩气下在室温下搅拌6h。将反应蒸发，用戊烷洗涤并且干燥以提供呈三氟乙酸盐的粗l-9a。lcms(方法5)：保留时间＝0.262min；ms(esi+)m/z436.2(m+h)。

l-9b.2-(丙酰基氧基甲基)-4-(β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸

将l-9a(250mg，0.57mmol)溶解于乙醇(5ml)中，向其中添加10％钯碳(25mg)。将溶液在氢气气球下搅拌6h，然后通过过滤(用乙醇洗涤)。将合并的滤液蒸发以提供化合物l-9b。lcms(方法5)：保留时间＝0.774min；ms(esi+)m/z302.2(m+h)。

l9.

在0℃下，将在乙酸乙酯(5ml)中的l-9b(100mg，0.33mmol)和5-叠氮基戊酸(57mg，0.40mmol)用二异丙基乙胺(107mg，0.83mmol)和丙基膦酸酐(在乙酸乙酯中的50％溶液，158mg，0.50mmol)处理。将反应在氩气下在室温下16h，然后用水淬灭并且蒸发。初始快速色谱法(sio2，10％甲醇∶二氯甲烷)之后是制备型hplc(柱：zorbaxc-184.6×150mm；流动相a＝在水中的0.01％tfa∶甲醇(1∶1)，流动相b＝乙腈∶甲醇(1∶1)；时间＝0min：30％b；1min：70％b；6min：100％b；1ml/min)以提供l9。lcms(方法5)：保留时间＝0.18min；ms(esi+)m/z427.1(m+h)。¹h-nmr(meoh-d4，ppm)(所有分配都是临时的)4.23-4.17(m，2h)，4.16-3.98(m，1h)，3.78-3.62(m，1h)，3.54(s，2h)，3.46-3.43(t，j＝4，3h)，3.26-3.20(m，1h)，3.18-3.05(m，1h)，3.03-2.76(m，2h)，2.64-2.61(t，j＝8，2h)，2.43-2.36(m，2h)，2.24-2.21(t，j＝8，2h)，1.75-1.58(m，4h)，1.15-1.12(t，j＝8，3h)。可交换的质子在meod中不可见。

表8中所示的种类是使用类似于l-9的合成中所使用的那些的方法制备的：

无痕接头：l12和l13

l-12a.1-(boc)-2-(羟基甲基)-4-(n-马来酰基-β-丙氨酰基)哌嗪

在0℃下，将2-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(200mg，0.93mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中。添加二异丙基乙胺(359mg，2.78mmol)和hatu(422mg，1.11mmol)，并且将溶液在0℃下搅拌15min。添加3-马来酰亚胺基丙酸(187mg，1.11mmol)，然后将反应在氩气下在室温下搅拌12h。将反应用水稀释并且用二氯甲烷萃取。将有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。通过快速色谱法(中性氧化铝，2％甲醇：乙酸乙酯)纯化提供标题材料l-12a。lcms(方法6)：保留时间＝2.87min。

l-12b.1-(boc)-2-(乙酰氧基甲基)-4-(n-马来酰基-β-丙氨酰基)哌嗪

在氩气下，在0℃下，向l-12a(300mg，0.82mmol)和三乙胺(330mg，3.27mmol)在二氯甲烷(4ml)中的溶液中逐滴添加乙酰氯(125mg，1.64mmol)。将反应在室温下搅拌3h，然后用水处理并且用二氯甲烷萃取。将有机层干燥(硫酸钠)，浓缩并且通过快速色谱法(中性氧化铝，2％甲醇∶乙酸乙酯)纯化以提供标题材料l-12b。lcms(方法6)：保留时间＝3.2min。

l-12c.1-(n-马来酰基-β-丙氨酰基)-3-(乙酰氧基甲基)哌嗪三氟乙酸盐

在0℃下，将l-12b(200mg，0.49mmol)溶解于二氯甲烷(5ml)中，然后逐滴用三氟乙酸(0.4ml)处理并且在氩气下在室温下搅拌3h。将反应蒸发，用戊烷洗涤并且干燥以提供粗标题材料l-12c。lcms(方法6)：保留时间＝1.709min；ms(esi+)m/z310(m+h)。

l12.2-(乙酰氧基甲基)-4-(n-马来酰基-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁基酯

在0℃下，向在乙腈(5ml)中的l-12c(140mg，0.45mmol)和碳酸钾(156mg，1.13mmol)中逐滴添加溴乙酸叔丁酯(100mg，0.54mmol)。将反应温热至10℃-15℃，然后允许在氩气下在室温下搅拌12h。将反应用水稀释并且用乙酸乙酯萃取。将有机层干燥(硫酸钠)，浓缩并且通过制备型hplc(柱：zorbaxeclipsexdbc18，21.2×150mm，5μm；流动相a＝水，流动相b＝乙腈；时间＝0min：30％b；2min：40％b；10min：60％b)纯化以提供l12。lcms(方法6)：保留时间＝3.08min；ms(esi+)m/z424(m+h)。¹h-nmr(cdcl3，ppm)6.69(s，2h)，4.25-4.14(m，2h)，4.09-3.96(m，2h)，3.88-3.83(t，j＝9，2h)，3.65-3.54(m，1h)，3.46-3.33(m，2h)，3.31-3.17(m，2h)，3.05-2.98(m，2h)，2.84-2.75(m，2h)，2.68-2.63(t，j＝9，2h)，2.09-2.07(d，j＝6，3h)，1.45(s，9h)。

l13是使用类似于l12的合成中所使用的那些的方法制备的：

l13.2-(2′-甲氧基乙酰氧基甲基)-4-(n-马来酰基-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁基酯(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-4-(3-(马来酰亚胺基)丙酰基)哌嗪-2-基)甲基2-甲氧基乙酰酯

l13.lcms(方法6)：保留时间＝3.04min；ms(esi+)m/z454.5(m+h)。¹h-nmr(cdcl3，ppm)6.70(s，2h)，4.40-4.24(m，1h)，4.20-4.10(m，1h)，4.07-4.60(d，j＝4，2h)，4.02-3.94(m，1h)，3.87-3.83(t，j＝8，2h)，3.70-3.60(m，1h)，3.68-3.60(m，1h)，3.58-3.51(m，1h)，3.45(s，3h)，3.41-3.39(d，j＝8，1h)，3.36-3.32(s，1h)，3.32-3.28(s，1h)，3.18-3.10(m，1h)，3.04-2.97(m，1h)，2.83-2.81(t，j＝4，1h)，2.79-2.75(m，1h)，2.67-2.64(t，j＝8，2h)，1.46(s，9h)。

无痕接头；l14-l16

l14a.1-(boc)-2-(羟基甲基)-4-(3′-(2″-(2″′-(2″″-((n-cbz)-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)哌嗪

在0℃下，向溶解于二氯甲烷(20ml)中的2-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.0g，4.63mmol)中添加二异丙基乙胺(1.79g，13.9mmol)和hatu(2.10g，5.55mmol)。将溶液在0℃下搅拌15min。添加3-(2′-(2″-(2″′-((n-cbz)-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(1.64g，4.63mmol)，并且将反应在氩气下在室温下搅拌16h。将反应用水稀释并且用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。通过快速色谱法(sio2，1％-4％甲醇∶二氯甲烷)纯化提供标题材料l-14a。lcms(方法5)：保留时间＝1.27min；ms(esi+)m/z554.3(m+h)。

l-14b.1-(boc)-2-(乙酰氧基甲基)-4-(3′-(2″-(2″′-(2″″-((n-cbz)-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)哌嗪

在0℃下，向溶解于二氯甲烷(20ml)中的l-14a(500mg，0.90mmol)和三乙胺(228mg，2.26mmol)中逐滴添加乙酰氯(83mg，1.08mmol)。将反应在氩气下在室温下搅拌16h。将反应用水稀释并且用二氯甲烷萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并且浓缩，然后通过快速色谱法(sio2，1％-4％甲醇∶二氯甲烷)纯化以提供标题材料l-14b。lcms(方法7)：保留时间＝1.54min；ms(esi+)m/z595.8(m+h)。

l-14c.1-(3′-(2″-(2″′-(2″″-((n-cbz)-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)-3-(乙酰氧基甲基)哌嗪三氟乙酸盐

在0℃下，将l-14b(500mg，0.84mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，然后逐滴用三氟乙酸(3ml)处理并且在氩气下在室温下搅拌3h。将反应蒸发，用戊烷洗涤并且干燥以提供粗标题材料l-14c，将其不经进一步纯化或分析而用于下一反应。

l14.2-(乙酰氧基甲基)-4-(3′-(2″-(2″′-(2″″-((n-cbz)-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)-1-哌嗪乙酸叔丁基酯

在0℃下，向在乙腈(10ml)中的l-14c(500mg，1.0mmol)和碳酸钾(418mg，3.03mmol)中逐滴添加溴乙酸叔丁酯(295mg，1.51mmol)。将反应在氩气下在室温下搅拌20h。将反应用水稀释并且用乙酸乙酯萃取。将有机层干燥(硫酸钠)，浓缩并且通过初始快速色谱法(sio2，1％-5％甲醇∶二氯甲烷)纯化，随后通过制备型hplc(柱：zorbaxeclipsexdbc18，4.6×150mm，5μm；流动相a＝在水中的0.01％tfa，流动相b＝乙腈∶甲醇(1∶1)，1ml/min；时间＝0min：30％b；1min：70％b；6min：100％b)纯化以提供l14。lcms(方法5)：保留时间＝3.43min；ms(esi+)m/z610.35(m+h)。¹h-nmr(cdcl3，ppm)7.36-7.31(m，5h)，5.49(s，1h)，5.09(s，2h)，4.26-4.16(m，1h)，4.07-3.98(m，1h)，3.78-3.74(t，j＝6，2h)，3.60-3.53(m，11h)，3.39-3.32(m，4h)，2.84-2.72(m，2h)，2.61-2.57(t，j＝3，2h)，2.08-2.06(d，j＝6，2h)，1.45(s，9h)。

表9中所示的种类是使用类似于l14的合成中所使用的那些的方法制备的：

实例2

无痕接头与生物活性部分的加合物

此实例描述了许多也能够与载体缀合的无痕接头-药物加合物的合成。如下所描绘的d1包含含有参考seqidno：1的氨基酸残基242-460和k423q取代的angptl3多肽(seqidno：19)。

加合物的合成

生物活性部分与无痕接头的酰化：

l2-nhs.2-(乙酰氧基甲基)-4-(n-(((1r′，8′s，9′s)-双环[6.1.0]壬-4′-炔-9′-基)甲氧基羰基)-β-丙氨酰基)-1-哌嗪乙酸n-羟基琥珀酰亚胺基酯

将l2(16mg，0.031mmol)溶解于二甲亚砜(0.818ml)中以达到38mm的浓度。添加三乙胺(3.46μl，0.025mmol)，随后添加n，n′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(11.94mg，0.047mmol)，并且将所得的澄清溶液在氩气下在室温下搅拌1h。将溶液不经进一步纯化按原样用于下一步骤。lcms(方法10)：保留时间＝0.93min；ms(esi+)m/z561.4(m+h)。

表12中的种类是使用类似于l2-nhs的合成中所使用的那些的方法制备的。

l2-d1(seqidno：19)(l2d1)

向d1(seqidno：19)(30ml，9.66mmol)在组氨酸缓冲液(20mm，ph5.8)或1xpbs(ph7.4)中的10mg/ml溶液中缓慢添加l2-nhs在dmso中的38mm溶液(0.508ml，19.32mmol)。将反应混合物剧烈涡旋，然后在室温下以200tr/min振荡2h。通过超速离心(amicon过滤器，3kdamwco，2000rcf，45min，室温)进行纯化，用组氨酸缓冲液或1xpbs洗涤(3次)除去残余小分子杂质，从而得到l2d1和未经修饰的d1的混合物。ms(方法9)解卷积m/z29969(d1，m+h)；解卷积m/z30415(l2d1，m+h，预期mw＝mw(d1)+446)。

重要的分析参数是确定(未经修饰的d1，n＝0)的比率：(单酰化d1，n＝1)∶(聚酰化d1，n＞1)。比较质谱中各种种类的相对峰高允许估算出待制备的产物比率。

估算反应产物比率的另一种方法是利用衍生化反应产物的sec(尺寸排阻色谱法)分析；为了实现反应产物的分离，需要进行衍生化。

l2d1衍生化反应

将来自反应混合物的等分试样(10mg/ml的l2d1溶液，0.020ml，0.060μmol)用mn约5kda的甲氧基-peg-叠氮化物(西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich)，689475，0.014ml的在1×pbs中的100mg/ml溶液，0.28μmol)处理，涡旋，在37℃下振荡30min并且用pbs(0.066ml)稀释。

l2d1衍生物的分析

sec：(仪器：agilentlc1260infinity；柱：superdex200increase10/300gl(28-9909-44)；柱温：室温，流速：0.75ml/min；注射体积：10μl；流动相：通过0.10膜过滤器(等度)初步过滤的1/9pbs/水；运行时间：40min；检测波长：214nm)。l2d1衍生物比率的确定(未经修饰的d1，n＝0，保留时间＝20.90min)∶(单酰化d1，n＝1，保留时间＝18.23min)∶(双酰化d1，n＝2，保留时间＝16.64min)＝[(n＝0)∶(n＝1)∶(n＝2)]＝87∶12∶1。

实例3

透明质酸的官能化

此实例描述了官能化透明质酸的合成，该透明质酸本身可以是载体，或者也可以与交联部分反应以形成水凝胶。

透明质酸中间体[ha-n3]的合成：

透明质酸钠盐是一种线性聚合物，由葡糖醛酸和n-乙酰半乳糖胺的重复二聚体单元组成，其中重复单元分子量为401.3da。在此实例中，报告的透明质酸的摩尔数是指重复单元的摩尔数，并且相对于透明质酸的重复单元的摩尔数报告与透明质酸反应所用的试剂的当量。聚合物的平均分子量决定了每条聚合物链的重复单元的平均数。由供应商生命中心生物医学公司(ha200k，明尼苏达州的查斯卡)标记为具有200kda的标称平均分子量的透明质酸钠盐的各批次可以在151kda-300kda范围内变化，如通过粘度测定法确定的。在此实例中，这样一个具有200kda的假定标称平均分子量的透明质酸钠盐分子将具有大约500个单体单元的平均长度。

[ha-n3]-23％的合成

将透明质酸钠盐溶液(标称平均分子量200kd；250.1mg，0.623mmol；生命中心生物医学有限责任公司(lifecorebiomedical，llc)；产品编号ha200k)完全溶解于25ml的mes缓冲液(50mm，ph5.5)中。向此溶液中添加4-(4′，6′-二甲氧基-1′，3′，5′-三嗪-2′-基)-4-甲基吗啉-4-鎓盐酸盐(dmtmm，295mg，1.07mmol，1.71当量)，随后5min后添加11-叠氮基-3，6，9-三氧杂十一烷-1-胺(n3-peg3-nh2，196mg，0.90mmol)。将反应搅拌过夜，然后用25ml的0.25mnacl溶液稀释并且通过切向流过滤纯化。

使用来自赛多利斯公司(sartorius)的30kdamwcovivaflow-50rhydrosart滤筒进行切向流过滤(用400ml的0.25mnacl溶液洗脱，然后用400ml水洗脱)。

将产物快速冷冻并且冻干以提供标题材料[ha-n3]-23％。

¹hnmr(400mhz，d2o)δ4.45(bs，2h)，4.0-3.1(m，15.5h)，1.95(s，3h)。

dosy-nmr。在带有5mmdch冷冻探针的brukeravanceiii400mhz(对于¹h)仪器上，使用具有一个破坏梯度脉冲序列(stegplsld)的受激回波收集一维扩散序nmr谱(dosy)。扩散时间和扩散梯度时间分别设定为50ms和4ms。收集了两个光谱，梯度强度(gpz6)分别设定为2％和95％。这两个光谱的比较显示除了溶剂峰外没有差异，表明在聚合物中不存在小分子杂质。

elem.anal：c：40.05％；h：5.67％：n：5.70％。

[ha-n3]的取代度定义为其中的羧酸酯部分已经发生反应以给出所描绘的酰胺的重复单元的％。元素分析用于确定取代度。将通过经纯化的样品的元素分析确定的[％c/％n]比率输入以下公式以提供取代度。其中y＝[(％c)/(％n)]，则：

在此实例中，[ha-n3]的取代度(ds)是23％。

将用23％的叠氮化物接头官能化的此200kda的透明质酸标记为[ha-n3]-23％。

在剩余的实例中，将用x％的叠氮化物接头官能化的200kda的透明质酸标记为[ha-n3]-x％。

表13中的种类是使用类似于[ha-n3]-23％的合成中所使用的那些的方法制备和表征的。我们发现所达到的取代度取决于所使用的dmtmm试剂的给定存量，并且可能是特质的。通常，对于dmtmm的给定存量，取代度随着使用的dmtmm当量数的增加而增长，并且取代度随着使用的dmtmm当量数的减少而降低。通过透析而不是切向流过滤纯化一些[ha-n3]中间体([ha-n3]-23％b、[ha-n3]-37％)。在这些情况下，将粗反应混合物填充到再生的纤维素透析膜(mwco1-25kd)中，并且对0.25m-1mnacl透析1-3天，更换几次透析溶液，随后对去离子水进行1-3天的透析，也多次更换透析液。完成后，将样品从透析管中取出，快速冷冻，并且冻干。

实例4

peg聚合物xl-1-xl-10的制备

此实例描述了可以与其他官能化聚合物反应以形成水凝胶的交联剂的合成。

peg基交联聚合物

通用结构1。

在一些方面，w可以是22、45、91、136、181或226，并且分别对应具有约1kda、约2kda、约4kda、约6kda、约8kda或约10kda的标称平均分子量的peg。

通用结构2。

xl-8的结构：

起始peg的mw：mn约10,000kda。

peg基交联聚合物的合成

取代度是peg衍生的交联剂的重要参数，并且定义为被所需引入的官能团取代的peg端基的百分比。使用¹h-nmr确定取代度，以比较特异于peg端基的亚甲基基团的整合与特异于引入的官能团的质子的整合。对于xl-1-xl-6，特异于peg部分的亚甲基基团是酯或氨基甲酸酯亚甲基[-(c＝o)-o-ch2-]，将其与在双环[6.1.0]壬-4-炔部分中的质子的整合进行比较。取代度＝((通过¹h-nmr测得的引入官能团的摩尔数)/(通过¹h-nmr测得的peg端基的摩尔数))×100。

xl-1.peg(2000)-双-[3-(((((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸酯]

xl-1a.peg(2000)-双-[3-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸酯]

将3-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸(1.15g，6.0mmol)和mn约2kda的peg(3g，1.500mmol)溶解于30ml二氯甲烷中。添加二甲基氨基吡啶(0.092g，0.750mmol)和edc·hcl(1.211g，6.0mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。将粗产物通过二氧化硅快速柱色谱法(带有elsd检测器)(使用0-20％二氯甲烷∶二氯甲烷/甲醇(4∶2)梯度)纯化。将含有产物的级分合并并且浓缩至干以提供xl-1a。¹hnmr(500mhz，dmso-d6)δ6.83(t，j＝5.7hz，2h)，4.16-4.09(m，4h)，3.61-3.56(m，5h)，3.51(s，184h)，3.15(q，j＝6.7hz，4h)，2.43(t，j＝7.0hz，4h)，1.37(s，18h)。

xl-1b.peg(2000)-双-[3-(氨基)丙酸酯]双-三氟乙酸

将xl-1a(3.12g，1.357mmol)溶解于二氯甲烷(36ml)中。添加三氟乙酸(36ml)，并且将反应混合物在室温下搅拌2小时。将溶剂在减压下去除。将粗产物依次用乙醚研磨并且滤出。重复该操作三次，并且将所得的固体在真空下干燥以提供xl-1b。¹hnmr(500mhz，dmso-d6)δ7.80(s，4h)，4.24-4.11(m，4h)，3.72-3.32(m，182h)，3.09-2.95(m，4h)，2.67(t，j＝6.9hz，4h)。

xl-1-1.peg(2000)-双-[3-(((((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸酯]

将xl-1b(600mg，0.286mmol)溶解于乙腈(7ml)中。添加三乙胺(1.99ml，14.3mmol)，随后添加((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(333mg，1.14mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物通过二氧化硅快速柱色谱法(带有elsd检测器)(使用0-40％二氯甲烷∶二氯甲烷/甲醇(4∶2)梯度)直接纯化。将含有产物的级分合并并且浓缩至干以得到xl-1-1。出于储存目的，将xl-1-1作为在乙腈中的溶液(50mg/ml)保存放置在冰箱中。分析型uplc(方法b，参见下文)：保留时间＝1.19min。¹hnmr(500mhz，meoh-d4)δ4.23(m，4h)，4.14(m，4h)，3.64(brs，214h)，2.55(m，4h)，2.22(m，12h)，1.61(m，4h)，1.35(m，2h)，0.92(m，4h)。

方法a：带有cad检测器的分析型hplc：watersxbridgebeh300c18；粒径：3.5μm；柱尺寸：4.6×100mm；洗脱剂/梯度：2％ch3cn/h2o/0.5min、2％-98％ch3cn/h2o/17.5min(含有0.05％tfa的ch3cn和含有0.1％tfa的h2o)；流速：1ml/min；柱温：50℃。

方法b：带有elsd检测器的分析型uplc：watersacquityuplchsst3；粒径：1.8μm；柱尺寸：2.1×50mm；洗脱剂/梯度：在1.4min内5％-98％ch3cn/h2o(含有0.04％fa的ch3cn和含有0.05％fa+3.75mmaa的h2o)；流速：1ml/min；柱温：60℃。

方法c：带有cad的分析型uplc：watersacquitybehc18；粒径：1.7μm；孔径：柱尺寸：2.1×50mm；洗脱剂/梯度：5％ch3cn/h2o/1.2min、5％-95％ch3cn/h2o/1.8min(含有0.1％tfa的ch3cn和含有0.1％tfa的h2o)；流速：1ml/min；柱温：45℃。

表15中的种类是使用类似于xl-1(xl-1-2除外)的合成中所使用的那些的方法制备的。

peg基交联聚合物的合成中使用的中间体：

xl-5.peg(2000)-双-[3-(((((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基氨基甲酰]

将mn约2kda的peg二胺盐酸盐(键凯科技公司，300mg，0.148mmol)溶解于乙腈(3ml)中。添加三乙胺(0.413ml，2.96mmol)，随后添加((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(345mg，1.184mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌4h。将反应混合物通过制备型反相hplc与elsd引发的级分收集直接纯化(方法如下)。将含有产物的级分合并，冷冻并且冻干以提供xl-5。出于储存目的，将xl-5作为乙腈、dmso或甲醇溶液保存在冰箱中。分析型hplc-cad(方法如下)：保留时间＝11.85min。nmr(400mhz，meoh-d4)δ4.14(m，4h)，3.63(brs，186h)，3.54(m，4h)，2.22(m，12h)，1.61(m，4h)，1.38(m，2h)，0.94(m，4h)。可交换的质子在meod中不可见。

制备型hplc条件：watersxbridgec18；粒径：5μm；柱尺寸：19×250mm；洗脱剂/梯度：5％ch3cn/h2o/0.5min、5％-95％ch3cn/h2o/12.5min、95％ch3cn/h2o/3min；流速：30ml/min；柱温：室温。

分析型hplc-cad条件：watersxbridgebeh300c18；粒径：3.5μm；柱尺寸：4.6×100mm；洗脱剂/梯度：2％ch3cn/h2o/0.5min、2％-98％ch3cn/h2o/17.5min(含有0.05％tfa的ch3cn和含有0.1％tfa的h2o)；流速：1ml/min；柱温：50℃。

xl-6.peg(10000)-四-[3-(((((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基氨基甲酰]

将mn约10kda的4臂peg胺盐酸盐(季戊四醇核心，键凯科技公司，500mg，0.05mmol)溶解于二氯甲烷(15ml)中。添加三乙胺(0.554ml，4.00mmol)，随后添加((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(175mg，0.600mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过使用2kdamwcospectra/por6再生纤维素透析膜(斯百全公司(spectrum，inc.))对甲醇透析直接纯化。为了在进一步反应中分析和利用，使用旋转蒸发仪将xl-6通过浓缩分离。出于储存目的，将化合物作为甲醇溶液保存在室温下。¹hnmr(400mhz，meoh-d4)δ4.14(m，8h)，3.63(brs，995h)，2.22(m，24h)，1.61(m，8h)，1.38(m，4h)，0.94(m，8h)。可交换的质子在meod中不可见。

xl-8.

将mn约10kda的8臂peg胺盐酸盐(六甘油核心，键凯科技公司，800mg，0.08mmol)溶解于二氯甲烷(5ml)中。添加三乙胺(0.887ml，6.40mmol)，随后添加((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(807mg，2.56mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌5h。将反应混合物使用旋转蒸发仪浓缩，然后溶解于甲醇中并且通过使用2kdamwcospectra/por6再生纤维素透析膜(斯百全公司)对甲醇透析纯化。为了在进一步反应中分析和利用，使用旋转蒸发仪将xl-8通过浓缩分离，然而出于储存目的，将xl-8作为甲醇溶液保存在室温下。¹hnmr(400mhz，meoh-d4)δ4.14(m，16h)，3.63(brs，935h)，2.23(m，48h)，1.61(m，16h)，1.38(m，8h)，0.95(m，16h)。可交换的质子在meod中不可见。

xl-12.peg(4000)-((氧基双(乙烷-2，1-二基))双(氧基))双(乙烷-2，1-二基)双(1-(((((1r，8s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)环丙烷-1-甲酸酯)

xl-12a.peg(4000)-((氧基双(乙烷-2，1-二基))双(氧基))双(乙烷-2，1-二基)双(1-((叔丁氧羰基)氨基)环丙烷-1-甲酸酯)

将1-((叔丁氧羰基)氨基)环丙烷甲酸(252mg，1.25mmol)和mn约4kda的peg(1g，0.25mmol)溶解于10ml二氯甲烷中。添加二甲基氨基吡啶(15mg，0.125mmol)和edc·hcl(192mg，1.0mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。将粗产物通过二氧化硅快速柱色谱法(带有elsd检测器)(使用0-100％己烷∶etoac，然后0-100％二氯甲烷∶二氯甲烷/甲醇(4∶2)梯度)纯化。将含有产物的级分合并并且浓缩至干以提供xl-12a。¹hnmr(500mhz，dmso-d6)δ7.53(s，2h)，4.09(t，4h)，3.51(s，446h)，3.38-3.35(m，4h)，1.41-1.33(m，18h)，1.30(d，4h)，1.03-0.97(m，4h)。

xl-12b.peg(4000)-((氧基双(乙烷-2，1-二基))双(氧基))双(乙烷-2，1-二基)双(1-氨基环丙烷-1-甲酸酯)双-三氟乙酸

将xl-12a(1.03g，0.238mmol)溶解于二氯甲烷(4ml)中。添加三氟乙酸(4ml)，并且将反应混合物在室温下搅拌2小时。将溶剂在减压下去除。将粗产物依次用乙醚研磨并且滗析出。重复该操作三次，并且将所得的固体在真空下干燥以提供xl-12b。¹hnmr(500mhz，dmso-d6)δ8.72(s，4h)，4.30-4.20(m，4h)，3.67-3.60(m，4h)，3.50(s，443h)，1.46-1.41(m，4h)，1.36-1.31(m，4h)。

xl-12.peg(4000)-((氧基双(乙烷-2，1-二基))双(氧基))双(乙烷-2，1-二基)双(1-(((((1r，8s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)环丙烷-1-甲酸酯)

将xl-12b(1.04g，0.238mmol)溶解于乙腈(5ml)中。添加三乙胺(1.66ml，11.89mmol)，随后添加((1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(277mg，0.952mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过二氧化硅快速柱色谱法(带有elsd检测器)(使用0-100％己烷∶etoac，然后0-100％二氯甲烷∶二氯甲烷/甲醇(4∶2)梯度)直接纯化。将含有产物的级分合并并且浓缩至干。然后，将固体溶解于二氯甲烷中并且用去离子水洗涤。将有机层经相分离器干燥以得到xl-12。出于储存目的，将xl-12作为在乙腈中的溶液(50mg/ml)保存并且放置在冰箱中。分析型uplc(方法b，参见上文)：保留时间＝1.21min。¹hnmr(500mhz，meoh-d4)δ4.25-4.13(m，8h)，3.64(s，401h)，2.33-2.10(m，8h)，1.67-1.56(m，4h)，1.52-1.47(m，4h)，1.44-1.34(m，2h)，1.19-1.11(m，4h)，1.00-0.91(m，4h)。可交换的质子在meod中不可见。

实例5

此实例描述了通过使适当官能化的聚合物与交联剂反应制备的水凝胶的合成。

透明质酸水凝胶的合成：h1g

在15ml管中，在室温下，经1h将[ha-n3]-19％(60mg，137μmol，取代度＝19％)溶解于4.0ml无菌1×pbs缓冲液(ph7.4)中。未经取代的羧酸钠盐重复二聚体单元的分子量是401.3da。叠氮化的重复二聚体单元的mw是579.6da。[ha-n3]-19％钠盐形式的二聚体单元的平均mw是435.2da＝((401.3×0.81)+(579.6×0.19))。使用钠盐二聚体单元的平均mw，重复二聚体单元的总摩尔数是137μmol，并且叠氮化的重复二聚体单元的摩尔数是26μmol。

向此溶液中添加xl-1-1的50mg/ml溶液(0.205ml，假定2474da的mw的试剂4.1μmol，反应官能度8.20μmol)。这产生了关于[ha-n3]-19％为3％w/v的溶液，并且预测其中6％的[ha-n3]-19％重复单元与xl-1-1交联((8.20μmol[xl-1-1-反应官能度]/137μmol[ha单元])×100＝6％)。

将混合物短暂涡旋以混合，然后分配到10ml注射器中，将该注射器盖上并且在37℃下保持过夜，以提供h1g。目视检查(反转测试)显示成功的凝胶化。

透明质酸基水凝胶颗粒的制备

强压h1g(2ml)穿过100目不锈钢筛网盘到5ml注射器中，从而得到粗凝胶颗粒。向此注射器中添加1ml的1×pbs，随后涡旋以混合。将注射器保持在室温下6h以允许水凝胶溶胀。这产生了关于[ha-n3]-19％为1.5％的混合物。强压h1g的溶胀的粗凝胶颗粒通过200目不锈钢筛网盘20次，从而得到作为最终产物的细凝胶颗粒。

表17中列出的透明质酸基水凝胶(和相应的水凝胶颗粒)类似于h1g来制备。通过使用的[ha-n3]组分及其在交联反应中的浓度以及通过使用的peg交联剂及其预期与骨架聚合物形成交联的程度(交联％)来定义水凝胶。

实例6

水凝胶-药物缀合物的合成

此实例描述了其中的药物通过无痕接头与载体缀合的水凝胶-药物缀合物的合成。

当制备用于体内给药的样品时，未盖上的材料或溶液的所有操作均在无菌条件下在层流罩中进行。使用的所有消耗品此前未打开并且标记为“无菌”。

c1-2(h1g-l2d1)

将h1g的水凝胶颗粒悬浮液(1.08g，15mg/ml，19mm总二聚体重复单元)用l2d1的溶液(7ml的在20mm组氨酸缓冲液(ph＝5.8)中的13.33mg/ml溶液)处理，涡旋并且在30℃下振荡过夜(600rpm)。将反应管离心(1500rcf，5min)，并且使用针头和注射器将上清液从管中除去。将新鲜的1×pbs(10-15ml)添加到管中，将管振荡以重悬凝胶。重复离心、除去上清液并且用新鲜的缓冲液稀释。继续洗涤直至在上清液中检测不到d1。使用nanodrop分光光度计在280nm处检测吸光度。

水凝胶-药物缀合物的关键描述符是每体积的水凝胶负载药物的量(＝载药量)。当药物是蛋白质时，有几种方法确定负载量。

水凝胶的蛋白质负载量是通过使缀合的蛋白质从已知体积的水凝胶中强制释放，随后定量释放的蛋白质来确定的。在此实例中：将20.0mg的[c1-2]称重到反应管中。将样品用0.5mnaoh(4ml，avstitrinorm，31951.290)处理，涡旋并且在37℃下振荡30min。使用uv分光光度计测量在此样品中释放的药物d1(seqidno：19)的浓度为11.68mg/ml，相当于在[c1-2]中11.68mgd1/ml的水凝胶。一式两份地进行此分析。稀释前[c1-2]的平均确定蛋白负载量是12.14mgd1/ml的水凝胶。

在另一种方法中，将20.8mg的[c1-2]称重到反应管中。将样品用1mtris-hcl缓冲液ph＝9.5(4ml)处理，涡旋并且在37℃下振荡24小时(或直至测量浓度达到稳定状态)。使用uv分光光度计测量在此样品中释放的药物d1的浓度为13.3mg/ml，相当于在[c1-2]中13.3mgd1/ml的水凝胶。一式三份地进行此分析。稀释前[c1-2]的平均确定蛋白负载量是12.72mgd1/ml的水凝胶。

在另一种方法中，将24.5mg的[c2-2]称重到反应管中并且添加2800μl的水，随后添加58.05μl的透明质酸酶溶液(来自沃辛顿公司(worthington)，ls005475，8140u/mg)。将反应混合物在室温下振荡3hr，并且使用uv分光光度计测量在此样品中的吸收为19.68mg/ml。一式三份地进行此分析。稀释前[c2-2]的平均确定蛋白负载量是19.49mgd1/ml的水凝胶。

确定蛋白质负载量的替代方法依赖于差分计算。在此方法中，在实验开始时从已知的总添加蛋白质中减去在水凝胶洗涤液中回收的d1的测量浓度(使用uv分光光度计)(例如：d1+l2d1)。基于总水凝胶的体积，该差分给出d1负载量。

表18中的水凝胶是使用类似于c1-2的合成中所使用的那些的方法制备的。

可以将水凝胶-药物缀合物用1×pbs稀释以达到用于给药的所需最终药物浓度。添加的1×pbs的量可以通过以下方程式计算：(pbs稀释剂(ml))＝[总药物(mg)/所需载药量(mg/ml)]-(缀合物的初始体积(ml))。

通过移除柱塞并且回填所需体积的c2-2，将缀合物c2-2分配到附带30g针头的0.5ml胰岛素注射器中用于给药。

将水凝胶-药物缀合物在室温下储存。

实例7

体外药物释放研究

7-1.d1(seqidno：19)从水凝胶-药物缀合物中的释放

其中y选自上表3。

d1(seqidno：19)从水凝胶缀合物c1-2和c2-2中的释放如图4a中所描绘的发生。在此研究中，在37℃下，将一系列水凝胶-d1-缀合物保持在1×pbs中以评估无痕接头裂解反应后药物的释放。在不同的时间点对这些反应取样，并且进行分析以确定在上清液中释放的d1的浓度。

将每种水凝胶(大约125μl；通过称量确定的精确量，假定水凝胶密度＝1g/ml)添加到插入皿(康宁公司(corninginc)；6孔板，24mm直径，聚碳酸酯膜，8.0μm孔径)中。板的孔中填充有2.6ml的pbs+(1％)青霉素/链霉素。(生命技术公司(lifetechnologies)，10000iu/μg/ml)。然后，将含有水凝胶的插入皿放入孔中，并且在水凝胶的顶部(在插入皿中)添加1.375ml的pbs+(1％)青霉素/链霉素。为每个水凝胶样品准备了三个孔。将板牢固地盖上并在潮湿的环境中保持在37℃下。

在不同的时间点将收集缓冲液样品从孔中取出，持续长达28天。在每个时间点，并且对于每个孔，将插入皿从孔中取出，滴干并且转移到新板的含有3.6ml的新鲜1xpbs+(1％)青霉素/链霉素的孔中。将补充的板返回到培养箱。同时，将全部体积的收集缓冲液转移到干净的管中并且称量，然后从收集缓冲液中取出时间点样品(0.10ml用于分析目的)，并且将剩余的样品储存在-80℃下直至测定。

此测定中使用的其他缓冲液是包含1％胎牛血清(吉博科公司(gibco)，参考号10270106)、12.5μg/ml胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠补充剂(罗氏公司(roche)，参考号11074547001)、50μg/mll-抗坏血酸磷酸镁盐n水合物(和光株式会社(wako)，参考号013-12061)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的牛滑液(bsf)、1mtris·hcl溶液(天惠华公司(teknova)，ph9.5)或杜尔贝科改良的伊格尔培养基(dulbecco′smodifiedeaglemedium)(吉博科公司，参考号41965)。如果实验是在22℃下而不是在37℃下运行，则可以省略青霉素/链霉素添加剂。

对于每个时间点样品，蛋白质浓度(其代表该时间点每个孔中的蛋白质浓度)是通过用d1初步校准的尺寸排阻色谱法sec确定的(仪器：agilentlc1260infinity；柱：superdex200increase10/300gl(28-9909-44)；柱温：室温，流速：0.75ml/min；注射体积：10μl；流动相：通过0.10μm膜过滤器初步过滤的1/9pbs/水；运行时间：40min；检测波长：214nm、280nm和680nm)。一式三份地对每个时间点样品进行分析，并且对结果取平均值。

在给定时间点在给定孔中的蛋白质总量通过将该时间点的蛋白质浓度乘以测量的体积(假设密度为1g/ml)来计算。到该时间点为止从每种水凝胶释放到每个孔中的累积d1是通过将每个时间点该孔中d1的总量相加来计算的。图4b中显示了直至给定时间点为止从缀合物c2-2中释放的蛋白质的累积百分比。释放的d1的累积百分比是通过将给定时间点释放的累积d1除以初始水凝胶样品中存在的总d1并且乘以100来计算的。如从图4b中明显看出，d1从载体的释放是缓慢的，但是持续了一个月的时间。

在时间点t孔中的蛋白质浓度：

[p](t)

在时间点t孔中的总体积：

v(t)

在时间点t孔中蛋白质的总质量：

m(p)孔(t)＝[p](t)×v(t)

直至时间点t从水凝胶中释放的蛋白质的累积质量：

实例8

水凝胶的比较性组织耐受性

此研究检查了在患有膝骨关节炎的lewis大鼠中单次关节内注射后，经11周的时间，水凝胶是否引发严重的炎症反应或任何其他不良事件。测试品是h1a、h9a和用于治疗骨关节炎膝盖痛的透明质酸基可注射溶液(赛诺菲公司(sanofi))。

h9a的制备

如针对h1a描述的制备h9a的透明质酸基水凝胶颗粒(上文，使用交联剂xl-9-1)，其中在第一次挤出之后，将一半体积的1×pbs添加到颗粒中。通过移除柱塞并且回填所需体积的h1a/h9a，将h1a/h9a的水凝胶颗粒分配到附带30g针头的0.5ml胰岛素注射器中用于给药。通过对注射器的轻柔操作去除气泡。

是购买的并且按接收时使用。

关节内注射

对雄性lewis大鼠(lew/orlrjjanvier)的一个膝盖进行半月板撕裂手术。手术后约7天，由于关节稳定性导致发生膝骨关节炎时，在麻醉下在手术后的膝关节中关节内注射25μl的测试品或生理盐水(表19)。一只初试(未手术)大鼠作为对照。给药后持续1-2小时记录生活观察结果，并且此后每天至少一次持续一周。在直到尸检的接下来几周内，每周记录一次生活观察结果。每周测量体重。

关节内注射后第4、6、8或11周对大鼠实施安乐死。通过打开膝关节并用25μl盐水冲洗来收集来自注射的膝关节的滑液。在尸检期间记录宏观异常。从所有动物收集操作/注射的右膝盖，固定在10％中性缓冲的福尔马林中，包埋在石蜡中并且切片。由病理学家对苏木素和伊红以及番红/快绿染色的膝关节切片进行评估。

结果和结论

当在大鼠膝关节中关节内注射时，在11周内水凝胶未导致任何不良事件。在早期时间点，在滑膜下间隙中存在水凝胶、滑膜细胞向关节间隙出泡以及滑膜和滑膜下细胞的增殖是短暂的，并且对于ha水凝胶缀合物明显少于后者已经上市并且经常用于治疗骨关节炎膝关节疼痛(赛诺菲公司)。

实例9

体内药物释放研究

此研究检查了在大鼠膝关节中关节内注射后d1从水凝胶药物缀物c2-2的体内释放特性。

c2-2的制备

如在实施例6中所述的制备水凝胶药物缀合物c2-2。c2-2中的d1浓度是19.0mg/g，相当于0.475/关节的d1剂量。

关节内注射

在麻醉下对9只初试雄性lewis大鼠(lew/orlrjjanvier；9周龄)的两个膝关节各自注射25μl的c2-2。在表20中指示的时间点收集血液/血清。在时间点在关节内注射后第24、72和168小时，对3只大鼠各自实施安乐死。从左膝关节收集滑液和关节软骨，从右膝收集整个关节组织。

表20

通过向闭合的膝关节中关节内注射20μl盐水，移动关节并且在打开膝关节后直接收集液体来收集膝关节的滑液。之后，将另外20μl注射到打开的膝关节内并且收集。用另外的20μl盐水重复灌洗，从而得到60μl的总灌洗体积。取样后立即将装有滑液的预称重的小瓶离心，以保证水凝胶颗粒位于管底。之后，在将主小瓶储存于-80℃下之前，从预称重的小瓶中取出5μl。将分离出的5μl滑液保留为备用样品，以允许在不进行透明质酸酶处理的情况下进行分析，并且也储存在-80℃下。通过eclia测定法定量血清和滑液中的d1浓度。该方法是基于使用固定在msd板上的抗angptl3单克隆抗体(诺华公司(novartis)，iprot109046)捕获d1。使用生物素化的抗angptl3多克隆抗体(r&d系统公司(r&dsystems)，baf3829)检测捕获的d1，随后与链霉亲和素-sulfotag一起孵育。将滑液样品在分析之前用透明质酸酶(1500u/ml)预处理并且在4℃下以450rpm振荡孵育过夜，或者在不进行透明质酸酶预处理的情况下保存在-80℃下。

结果和结论

如图5中所示，与在1周时不再可检测到的在d1速释配制品的情况下观察到的短且高的全身性暴露相比，c2-2水凝胶以非常低的水平提供了长达1周的长时间血清暴露。c2-2水凝胶关节内注射还导致滑液中持续至少一周的持续高d1水平，其通过透明质酸酶处理以从滑液中的残余水凝胶中释放d1。在不进行透明质酸酶预处理的情况下在滑液中检测到的游离d1水平要低得多，但持续至少一周也是可检测到的。

这些结果表明，c2-2水凝胶延长了d1向滑液中的释放持续至少一周。