一种三维多孔微载体支架及其采用离子型添加剂制备的方法与流程

本发明涉及一种三维多孔微载体支架及其采用离子型添加剂制备的方法，属于微载体材料制备领域。

背景技术：

冷冻干燥法制备三维多孔的组织工程支架材料是近年良好地维持生物大分子的生物活性。在冰胶制备过程中引入添加剂可以通过调控冰晶的生成过程，从而改变支架材料的孔径、硬度等性能。目前已经存在的方法中，使用盐颗粒致孔是增大孔径的方案之一，其主要原理是依靠饱和盐溶液中存在的盐颗粒起到空间占位作用，影响冰晶形成，从而增大孔径。但这种方法存在最重要的问题是，盐颗粒的密度与溶液密度不一致，在交联反应过程中受到重力作用影响会在材料底部聚成，从而导致孔径分布的不均匀。而且盐离子浓度较低时无法存在大量的、具有一定体积的颗粒，而过高的盐离子浓度又会抑制化学交联反应。因此，研究一种致孔添加剂，可以在冰胶预混液中均匀分布，从而得到大孔径的、孔隙均匀分布的支架材料，是组织工程产品发展的当务之急。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种三维多孔微载体支架及其采用离子型添加剂制备的方法。

本发明提供的一种采用离子型添加剂制备三维多孔微载体支架的方法，包括如下步骤：

1)将生物材料与缓冲液混合后，加入离子型致孔添加剂混合，得到完全共溶的预混液；

其中，所述生物材料包括人工合成的生物材料和/或天然生物材料；

2)有机溶剂与非离子型表面活性剂混合，得到所述有机相溶液，并预冷；

3)乳液的配置：在制冷条件下将预混液与固化剂混合，得到水相溶液；将所述水相溶液加入所述有机相溶液中进行乳化，得到w/o型的乳液液滴，然后将其进行低温避光乳化反应，得到乳液；

4)将所述乳液依次除去液体成分、选用滤网将有机相滤除，并筛选出所需粒径范围内粒径的液体微球；

5)将所述液体微球用水润湿，然后进行冷冻，经所述冷冻后进行干燥，得到三维多孔微载体支架。

上述的制备方法中，所述人工合成的生物材料选自聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚赖氨酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少一种。

上述制备过程中，所述缓冲液可选自去离子水、tris缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液中的至少一种。

上述制备过程中，所述天然生物材料选自胶原、蛋白多糖、糖蛋白、明胶、明胶衍生物、甲壳素、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、纤维蛋白原、基质胶、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的至少一种；和/或

所述离子型致孔添加剂选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化钡、硫酸钠、硫酸氢钠、硫酸钾、硫酸氢钾、磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硝酸钠和硝酸钾中的至少一种。

上述的制备方法中，在混合之前，所述缓冲液浓度范围0.005～1m；

所述预混液中，以总量为100％计，单位为g/ml，所述生物材料的质量体积浓度可为0.1％～30％，所述离子型致孔添加剂的质量体积浓度可为0.1％～30％，余量为所述缓冲液；

步骤1)中混合的搅拌速率可为50rmp～300rmp，具体可为300rmp、200rmp～300rmp或100rmp～300rmp。

本发明中，所述生物材料具体可为透明质酸和明胶的混合物或牛骨胶原和甲壳素粉的混合物；所述离子型致孔添加剂具体可为硫酸氢钠或硫酸钾；

所述预混液中，以总量为100％计，单位为g/ml，所述生物材料的质量体积浓度具体可为3.01％、2.0％、2～3.01％、、0.1％～2％、2％～15％或0.1％～20％，所述离子型致孔添加剂的质量体积浓度具体可为0.5％、0.1％～0.5％、0.1％～10％、0.5％～15％或0.1％～20％，余量为所述缓冲液。

上述的制备方法中，步骤5)中，所述冷冻的温度可为0～-196℃，具体可为-80℃、-80～-196℃、0～-80℃、-10～-196℃或-10～-180℃；

所述干燥采用冷冻干燥的方法，所述冷冻干燥的温度可为0～-50℃，时间可为10～96h，具体可为24h、10～24h、24～96h或20～80h。

上述的制备方法中，所述有机溶剂与所述非离子型表面活性剂的体积比可为5～100:1，具体可为100：5、100:8、12.5～20：1、10～20:1、10～50:1或5～75:1；

步骤2)中，所述混合的搅拌速率可为100～3000rpm，具体可为600rpm、700rpm、100～600rpm、600～3000rpm或200～2000rpm，搅拌时间可为10～120min，具体可为20min、60min、10～20min、20～60min、20～120min或10～100min；

所述预冷的温度可为0～-80℃，具体可为-30℃、-40℃、0～-40℃、-30～-40℃、-40～-80℃或-20～-70℃，时间可为2～24h，具体为7h、16h或7～16h；

步骤2)中还包括所述有机溶液混合之前进行预冷步骤2)中所采用的配置装置。

上述的制备方法中，步骤3)中，所述制冷条件的温度可为0～-196℃；采用低温制冷机实现，所述低温制冷机选用的制冷剂为液氮、乙醇、三氯乙烷、异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙二醇、丙二醇、异丁烷、正己烷、氯仿、四氢呋喃、溴己烷和乙腈中的至少一种；

所述预混液与所述固化剂的体积比可为200～10000:1，具体可为200:1、200～1000:1、200～5000:1或200～7500:1；

所述水相溶液与所述有机相溶液的体积比可为1:5～40，具体可为1:15、20:1、1:15～20、1:10～30或1:5～30；

步骤3)中，所述乳化的搅拌速率可为30～1000rpm，具体可为1000rpm、750～1000rpm、500～1000rpm或200～1000rpm，温度可为0℃～80℃，具体可为室温(如25℃)，时间为10～60min，具体可为20min、30min、20～30min、10～20min、10～30min、10～40min或10～50min；

所述低温避光乳化反应的转速可为10～2000rmp，具体可为80rpm、10～80rmp、80～2000rmp、10～1000rmp或10～1500rmp，温度可为-80℃～0℃，具体可为-30℃、-15℃、-30℃～-15℃、-80℃～-30℃或-80℃～-15℃，反应时间可为2～48h，具体可为16h、20h、24h、2～16h、16～20h、16～24h、10～30h或5～40h。

本发明中，所述室温为本领域公知的常识，具体可为10～30℃。

上述的制备方法中，所述有机溶剂选自氢氟醚、四氯化碳、石油醚、环己烷、液态石蜡、食用油、大豆油、橄榄油、氯仿(又名三氯甲烷)、二氯甲烷、四氯化碳和四氯乙烯中的至少一种，具体可为三氯甲烷和石油醚以体积比1:1混合；

所述非离子型表面活性剂选自失水山梨醇脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯、月桂酸酯、烷基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚、司班、po-500、单油酸酯和土温中的至少一种；具体一个实施例中采用吐温20；

所述固化剂选自二乙烯基苯、二异氰酸酯，n-羟基琥珀酰亚胺n,n-亚甲基双丙烯酰胺，甲醛、戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、氯化钙、四甲基乙二胺、硫酸铵、京尼平和转谷酰胺酶中的至少一种。

上述的制备方法中，采用抽滤筛分清洗装置除去所述液体成分；

所述滤网的孔径可为1μm～1000μm，具体可为50μm、5μm～1000μm、1μm～5μm、50μm～250μm或50～500μm；

步骤4)中还包括将所述液体微球用清洗剂进行清洗，去除微载体材料的表面有机相的步骤；

所述清洗剂选自丙酮、无水硫酸铜、氯化钙、硫酸钠、无水乙醇、医用酒精、氢氟醚、烷基苯磺酸钠、脂肪醇硫酸钠、三聚磷酸钠和去离子水中的至少一种。

本发明还提供了上述的制备方法制备得到的所述多孔微载体。

上述的三维多孔微载体中，所述多孔微载体的孔径可为20～500微米，具体可为50～500微米，孔隙率可为85～95％。

本发明具有以下优点：

本发明采用的离子型致孔添加剂为可溶性离子化合物，采用的离子型致孔剂是在完全和溶液交融，不产生不相容相的情况调节孔径，且交联后无需去除离子型致孔剂就可以实现孔径调节，使得增大孔径的同时孔径更加均一；添加方式为互溶添加，溶液中未饱和；添加可溶性离子化合物利用冰晶制孔的反应温度为0～-196℃，制备方法简单，能调节三维多孔微载体的孔径。

附图说明

图1为本发明实施例1中制备的三维多孔微载体时致孔剂使用前和使用后的多孔微载体电镜对比图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、

(1)水相溶液配制：

1)涉及的水溶液包含：人工合成的生物材料和/或天然生物材料、离子型致孔添加剂以及固化剂

称量一定量的牛骨胶原、甲壳素粉末，以总量为100％计，单位为g/ml，按质量体积分数1％胶原粉末+1％甲壳素使用去离子水充分溶解。称量离子型致孔添加剂硫酸氢钠，加入预混液中搅拌(速率为300rmp)，配置成终浓度0.5％w/v。

(2)有机相溶液配置：

量取三氯甲烷和石油醚以体积比1:1混合均匀，转速700rpm混合1小时，再加入终浓度5％v/v(ml/ml)吐温20，继续700rpm搅拌1小时。转到-30℃制冷机中充分降温预冷10小时。

(3)乳液制备：

1)将乙醇加入低温制冷机，利用低温制冷机冷却至-40摄氏度；

2)水相内加入0.5％v/v(ml/ml)甲醛溶液，在搅拌器上转速600rpm搅拌20分钟，得到水相。

3)充分预冷的有机相溶液由齿轮泵通入低温反应搅拌器，搅拌器搅拌速率500rpm；

4)将水相预混液加入搅拌器，有机相：水相体积比＝20:1，发生乳化(乳化温度室温，具体为25℃)，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴，

5)乳化过程完成后，开启低温乳化反应器，调节转速100rpm；

6)-15℃避光反应16小时；

(4)微载体收集与清洗：

1)收集乳液，使用抽滤筛分清洗装置除去液体成分，可以选用孔径50μm的滤网将有机相滤除。并根据不同的用途

出所需粒径范围内粒径的三维多孔微载体。由此，可以进一步提高所需的三维多孔微载体的均一性，可收获50～500μm范围内，

2)清洗乳液：将收集的微载体用清洗剂进行清洗，去除微载体材料的表面有机相。使用充分预冷的丙酮与去离子水9:1混合(温度0℃预冷8h)，充分淋洗收集的材料。共淋洗5次。

(5)干燥与筛选：

将经过清洗后的均一的三维多孔微载体润湿在少量水中，并转移至-80摄氏度的冷冻装置或冷冻液中进行冷冻，冷冻后转移至冻干机内-40℃冷冻干燥24小时。得到的三维多孔微载体上微孔的孔径为50～500微米，孔隙率可以达到85～95％。

通过图1中结果可知，本发明通过引入离子型添加剂，可以实现冷冻干燥法制备支架材料的过程中，大程度、均一地调控孔径结构。相对于传统制备方法，本方法操作简便、毒性低、无副产物，得到的材料孔径大、孔隙率高、连通性强。有良好的生物医用前景。

实施例2、

(1)预混溶液配制：

称量一定量的透明质酸、明胶粉末，以总量为100％计，单位为g/ml，按质量体积分数0.01％透明质酸粉末+3％明胶粉末使用去离子水充分溶解。称量离子型致孔添加剂硫酸钾，加入预混液中搅拌(速率为300rmp)，配制成终浓度0.5％。

(2)有机相溶液配置：

量取四氯化碳和石油醚以体积比1:4混合均匀，转速1000rpm混合1小时，再加入终浓度8％v/v吐温80，继续700rpm搅拌1小时。充分冷却后转移到-30℃制冷机中充分降温预冷16小时。

(3)乳液制备：

1)将乙醇加入低温制冷机，利用低温制冷机冷却至-30摄氏度；

2)水相内加入0.5％v/v(ml/ml)甲醛溶液，在搅拌器上转速600rpm搅拌10分钟，得到水相。

3)充分预冷的有机相溶液由齿轮泵通入低温反应搅拌器，搅拌器搅拌速率500rpm；

4)将水相预混液加入搅拌器，有机相：水相体积比＝15:1，发生乳化(乳化温度室温，具体为25℃)，搅拌速率1000rpm，充分搅拌20min生成w/o型乳液液滴，

5)乳化过程完成后，开启低温乳化反应器，调节转速80rpm；

6)-30℃低温避光反应24小时；

(4)微载体收集与清洗：

1)收集乳液，使用抽滤筛分清洗装置除去液体成分，可以选用孔径50um的滤网将有机相滤除。并根据不同的用途

出所需粒径范围内粒径的三维多孔微载体。由此，可以进一步提高所需的三维多孔微载体的均一性，可收获50～500μm范围内，

2)清洗乳液：将收集的微载体用清洗剂进行清洗，去除微载体材料的表面有机相。使用充分预冷的丙酮与医用酒精3:1混合(温度0℃预冷8h)，充分淋洗收集的材料。共淋洗5次。最后用去离子水淋洗一次。

(5)干燥与筛选：

将经过清洗后的均一的三维多孔微载体润湿在少量水中，并转移至-80摄氏度的冷冻装置或冷冻液中进行冷冻，冷冻后转移至冻干机内-40℃冷冻干燥24小时。得到的三维多孔微载体上微孔的孔径为50～500微米，孔隙率可以达到85～95％。

对比例1、

与本发明实施例1中方法相同，不同的是不使用致孔剂，得到致孔剂使用前的多孔微载体，结果如图1中三维多孔微载体时致孔剂使用前的多孔微载体电镜图所示。