一种纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带及其修饰方法与流程

本发明属于纳米材料学和医疗器械技术领域，具体涉及人工韧带及其修饰方法。

背景技术：

前交叉十字韧带（acl）断裂是一种严重的外科损伤，随着近年参与极限运动和高强度运动的人数的不断增加，acl断裂的病例数也呈现不断增多的趋势。撕裂的acl破坏了膝关节的平衡，严重影响了患者的生活质量。为了恢复病人对膝关节的控制，通常采用人工韧带替换断裂韧带，以重建膝关节的稳定性。用于制作人工韧带的材料，被要求具有高力学强度，无生物毒性，化学惰性等特点，如聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethyleneterephthalate,pet）。然而通常由于其化学惰性，人工韧带不能有效促进骨愈合，从而可能导致患者较长的康复期。

多巴胺（dopamine,da）是一种儿茶酚恩类神经传导物质，用来帮助细胞传送脉冲的化学物质。多巴胺可以在碱性条件下因酚羟基的氧化生成多巴胺-苯醌化合物，该物质经过分子内重排生成白色多巴胺色素（leukodopaminechrome），并进一步被氧化成多巴胺色素（dopaminechrome）。该粉色多巴胺色素进一步氧化和重排生成5,6-双羟基吲哚，从而具备了发生进一步交联反应的条件。5,6-双羟基吲哚一方面与氨基进行迈克尔加成和席夫碱反应，或者通过分子内环化作用生成脱氧吲哚羧酸酯，最终铰链形成聚多巴胺（polydopamine,pda）。

多巴胺自2007年被科学家发现可以在弱碱性水溶液中通过氧化-自聚合过程形成可以强力粘附于材料表面的聚多巴胺层后，引起了各个研究领域的兴趣。聚多巴胺表面包含丰富的羟基及氨基，使其具备了高表面活性。而且近年来发现因多巴胺的聚合反应可以发生在几乎所有的材料表面，故聚多巴胺越来越广泛的被应用在各个表面修饰应用领域。其中因聚多巴胺表现出的优异的生物相容性和水溶性等特点，其越来越多的被应用到生物医药领域。然而传统的多巴胺聚合反应速度慢，本发明利用金属离子与氧化剂参与多巴胺的聚合反应，从而大大加速多巴胺聚合反应过程。

纳米羟基磷灰石作为一种骨结构中一种表成分，人工合成纳米羟基磷灰石(nha)被广泛的应用在诱导骨生长，骨愈合等领域。为了促使人工韧带与骨连接处的骨生长与愈合，利用人工韧带表面已经修饰的聚多巴胺层作为粘合层，将nha粘附在人工韧带上，从而可以制备出羟基磷灰石修饰的人工韧带。

因此，本发明设计了利用添加有金属离子与氧化剂的多巴胺聚合溶液，将多巴胺与人工韧带共同放置于聚合溶液中进行人工韧带的多巴胺聚合反应。利用多巴胺可以在任意表面修饰的特点，以及金属离子与氧化剂能够促进多巴胺聚合反应的特性，在短时间内能够迅速制备出表面修饰有聚多巴胺层的人工韧带。经修饰后的人工韧带可以再与纳米羟基磷灰石反应，从而可以制备出纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出了一种性能优异、制备方便的纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带及其修饰方法。

本发明提出的纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带的修饰方法，具体步骤为：

（1）制备ph值为碱性的反应溶液，用于多巴胺的聚合反应；

（2）在反应容器内加入反应溶液1~50ml，并再加入多巴胺类物质5~1000mg，混合均匀后，最后加入人工韧带；

（3）将反应容器置于旋转混匀仪上，于室温下旋转反应一段时间；期间多巴胺类物质在碱性条件及氧化剂的作用下在人工韧带表面发生自聚合反应，从而制得经聚多巴胺修饰的人工韧带；

（4）将聚多巴胺修饰的人工韧带置于ph为7.4至9的溶液中，再加入纳米羟基磷灰石并超声分散，再加入多巴胺类物质，经旋转混匀仪的不停搅拌，反应一段时间；最终得到纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带。

本发明步骤（1）中，所述碱性反应溶液，为添加有金属离子或过氧化氢的碱性溶液，或同时添加金属离子与过氧化氢的碱性水溶液。具体如在ph值为7.4至9的1~50ml的1mm~1.5m的三羟甲基氨基甲烷盐酸（tris-hcl）缓冲溶液中，加入1~500μl的1m硫酸铜溶液，及1~500μl的过氧化氢溶液。

本发明步骤（2）中，所述多巴胺类物质包含但不局限于以下物质：盐酸多巴胺，5-羟基多巴胺盐酸盐，6-羟基多巴胺盐酸盐等。

本发明步骤（3）中，调节旋转混匀仪的转速，反应溶液的颜色由灰色或黄色，反应10分钟~48小时，溶液最终变为黄色或黑色，人工韧带表面变为灰色或者黑色，说明人工韧带表面已经修饰了聚多巴胺。

本发明步骤步骤（4）中，所述多巴胺类物质包含但不局限于以下物质：盐酸多巴胺，5-羟基多巴胺盐酸盐，6-羟基多巴胺盐酸盐等。

本发明步骤（4）中，调节旋转混匀仪的转速，使纳米羟基磷灰石均匀的附着在人工韧带表面的聚多巴胺上，反应5分钟~48小时，反应完毕后，人工韧带表面呈现灰黑色或灰色，说明人工韧带表面已经修饰了纳米羟基磷灰石。

经本发明方法修饰的人工韧带，其表面均匀分布有聚多巴胺，并修饰有纳米羟基磷灰石；人工韧带的力学性能未受影响。该聚多巴胺和纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带用于韧带置换手术，其具备与原材料相同的力学性能，但能够促进细胞附着生长，从而拓展人工韧带的性能。

附图说明

图1制备纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带的流程示意图。

图2为pet韧带与聚多巴胺修饰的pet韧带的细胞附着生长对比图。其中，(a)为激光共聚焦图像，(b)为cck8实验结果。

图3为pet韧带与纳米羟基磷灰石修饰的pet韧带的扫描电子显微镜图。其中，(a)为pet韧带，(b)为pet@nha韧带。

具体实施方式

下面通过具体实施例，进一步描述本发明。

实施例1

（1）反应溶液的配置

利用三羟甲基氨基甲烷（tris）、盐酸溶液（hcl）和水，配置成ph为8.5的浓度为5mm的tris-hcl缓冲溶液。取该缓冲液10ml，加入5μl的1m硫酸铜（cuso4）溶液、100μl的30%过氧化氢（h2o2）溶液，混合均匀，制成反应溶液。

（2）聚多巴胺修饰的人工韧带的制备

在上述缓冲液（约10.1ml）中加入20mg的盐酸多巴胺，混合均匀，溶液呈现褐色，再将长度为5mm的人工韧带放入其中，将反应容器密封后置于旋转混匀仪上混匀反应5分钟，制得聚多巴胺（pda）修饰的人工韧带。

获得pda修饰的人工韧带后，用去离子水清洗三遍，去除多余的未反应的盐酸多巴胺以及溶液中的聚多巴胺。

（3）纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带的制备

在ph为7.4的水溶液中约10ml中，加入5mg纳米羟基磷灰石与20mg盐酸多巴胺，超声分散均匀，之后加入经聚多巴胺修饰的人工韧带，密封容器，将容器置于旋转混匀仪上混匀反应5分钟，制备得纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带。

（4）对pet与pda修饰后的pet韧带(pet@pda韧带)进行力学性能与细胞附着生长实验

实验结果显示pet韧带的抗拉强度为44.6mpa，pet@pda的抗拉强度为44.3mpa，表明上述修饰过程没有对pet的力学性能有明显影响。用nih3t3成纤细胞与pet韧带与pet@pda韧带共同孵育，并用cck8细胞增殖检测方法检测增殖结果，结果显示成纤细胞更倾向于在pda修饰的pet韧带表面生长，培养72小时后其细胞相对活性相较纯pet韧带提高约13.1%。

实施例2

（1）反应溶液的配置

利用三羟甲基氨基甲烷（tris）、盐酸溶液（hcl）和水，配置成ph值为7.4的浓度为50mm的tris-hcl缓冲溶液。取该缓冲液50ml，加入125μl的1m硝酸铁（fe2(no3)2）溶液、1000μl的30%过氧化氢（h2o2）溶液，混合均匀，制成反应溶液。

（2）聚多巴胺修饰的人工韧带的制备

在上述缓冲液（约51.1ml）中加入2000mg的5-羟基多巴胺盐酸盐，混合均匀，溶液呈现褐色，再将长度为5cm的人工韧带放入其中，将反应容器密封后置于旋转混匀仪上混匀反应4小时，制得聚多巴胺修饰的人工韧带。

获得pda修饰的人工韧带后，用去离子水清洗三遍，去除多余的未反应的5-羟基多巴胺盐酸盐以及溶液中的聚多巴胺。

（3）纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带的制备

在ph为8.0的水溶液中约50ml中，加入3000mg纳米羟基磷灰石，超声分散均匀，加入5mg6-羟基多巴胺盐酸盐，之后加入经聚多巴胺修饰的人工韧带，密封容器，将容器置于旋转混匀仪上混匀反应5小时，制备得纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带。

（4）对pet与pda修饰后的pet韧带(pet@pda韧带)进行力学性能与细胞附着生长实验

实验结果显示pet韧带的抗拉强度为44.6mpa，pet@pda的抗拉强度为44.4mpa，表明上述修饰过程没有对pet的力学性能有明显影响。用nih3t3成纤细胞与pet韧带与pet@pda韧带共同孵育，并用cck8细胞增殖检测方法检测增殖结果，结果显示成纤细胞更倾向于在pda修饰的pet韧带表面生长，培养72小时后其细胞相对活性相较纯pet韧带提高约14.7%。

实施例3

（1）反应溶液的配置

利用磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸钠、盐酸溶液（hcl）、氢氧化钠溶液（naoh）和水，配置成ph值为8的浓度为100mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs缓冲液）。取该缓冲液50ml，加入100μl的1m硫酸铜（cuso4）溶液，混合均匀，制成反应溶液。

（2）聚多巴胺修饰的人工韧带的制备

在上述缓冲液（约50ml）中加入5000mg的6-羟基多巴胺盐酸盐，混合均匀，溶液呈现褐色，再将长度为10cm的人工韧带放入其中，将反应容器密封后置于旋转混匀仪上混匀反应24小时，制得聚多巴胺修饰的人工韧带。

获得pda修饰的人工韧带后，用去离子水清洗三遍，去除多余的未反应的6-羟基多巴胺盐酸盐以及溶液中的聚多巴胺。

（3）纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带的制备

在ph为9的水溶液中约50ml中，加入1000mg纳米羟基磷灰石，超声分散均匀，再加入100mg5-羟基多巴胺盐酸盐，之后加入经聚多巴胺修饰的人工韧带，密封容器，将容器置于旋转混匀仪上混匀反应24小时，制备得纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带。

（4）对pet与pda修饰后的pet韧带(pet@pda韧带)进行力学性能与细胞附着生长实验

实验结果显示pet韧带的抗拉强度为44.6mpa，pet@pda的抗拉强度为46.0mpa，表明上述修饰过程没有对pet的力学性能有明显影响。用nih3t3成纤细胞与pet韧带与pet@pda韧带共同孵育，并用cck8细胞增殖检测方法检测增殖结果，结果显示成纤细胞更倾向于在pda修饰的pet韧带表面生长，培养72小时后其细胞相对活性相较纯pet韧带提高约11.7%。

实施例4

（1）反应溶液的配置

利用硼酸，硼砂和水，配置成ph值为9的浓度为1m的磷酸盐缓冲溶液。取该缓冲液25ml，加入500μl的30%过氧化氢（h2o2）溶液，混合均匀，制成反应溶液。

（2）聚多巴胺修饰的人工韧带的制备

在上述缓冲液（约50ml）中加入10000mg的6-羟基多巴胺盐酸盐，混合均匀，溶液呈现褐色，再将长度为30cm的人工韧带放入其中，将反应容器密封后置于旋转混匀仪上混匀反应48小时，制得被聚多巴胺修饰的人工韧带。

获得pda修饰的人工韧带后，用去离子水清洗三遍，去除多余的未反应的6-羟基多巴胺盐酸盐以及溶液中的聚多巴胺。

（3）纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带的制备

在ph为7.4的水溶液中约50ml中，加入10000mg纳米羟基磷灰石，超声分散均匀，再加入500mg6-羟基多巴胺盐酸盐，之后加入经聚多巴胺修饰的人工韧带，密封容器，将容器置于旋转混匀仪上混匀反应48小时，制备得纳米羟基磷灰石修饰的人工韧带。

（4）对pet与pda修饰后的pet韧带(pet@pda韧带)进行力学性能与细胞附着生长实验

实验结果显示pet韧带的抗拉强度为44.6mpa，pet@pda的抗拉强度为44.0mpa，表明上述修饰过程没有对pet的力学性能有明显影响。用nih3t3成纤细胞与pet韧带与pet@pda韧带共同孵育，并用cck8细胞增殖检测方法检测增殖结果，结果显示成纤细胞更倾向于在pda修饰的pet韧带表面生长，培养72小时后其细胞相对活性相较纯pet韧带提高约14.7%。