专利名称:肽去甲酰酶活化的前体药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶催化的治疗活化(ECTATM)疗法领域，特别是对于表达肽去甲酰酶(“PDF”)的微生物具有特异性的ECTA疗法。
背景在本公开中，按第一作者和时间(在括号内)、专利号或公开号注明了各种出版物的来源。在本申请末尾给出完整的参考文献目录。所以，将这些文献的公开并入本公开作参考而更完善地描述本申请涉及的技术领域：
的状况。
酶催化的治疗活化(ECTATM)疗法是一项新的技术，它为靶酶提供了独特的前体药物底物。与常规疗法不同，ECTA前体药物既不抑制又不不可逆地灭活所述靶酶。美国专利No.6,159,706；PCT/US98/16607；PCT/US99/01332；和PCT/US00/20008。
靶酶优先在靶细胞内或者在表达靶酶的环境中(与不存在它的环境相比)，例如在受感染的细胞中将ECTA前体药物转化为毒素。由于所述化合物不需要引导试剂，所以它们可被局部地或系统地直接应用。
ECTA分子在大多数情况下不会自发地产生细胞毒性产物(没有靶酶活化)。它们不被非靶酶明显地活化，因为这样会导致对于无病的或非感染的组织的毒性。表1归纳了ECTA分子和酶激活剂的特性。
表1
在植物、人或农业上重要的动物中的细菌、病毒和真菌感染的情况下，存在于病原生物中但不存在于宿主中的代谢途径是潜在的ECTA靶酶的来源。例如，某些途径以及涉及的酶仅仅见于细菌、真菌和植物中而未见于哺乳动物细胞中。一个实例是“必需”氨基酸-动物不能合成而必须消费食物才能获得的氨基酸的合成。Nelson和Cox(1972)。
另一个实例是肽去甲酰酶(“PDF”，EC 3.5.1.31)，它催化生长的多肽链中N-末端N-甲酰甲硫氨酸的去甲酰作用。Meinnel(1999)。该酶存在于细菌中而且有活性(Meinnel等，1993)，但还没有报导它存在于哺乳动物细胞中。最近在哺乳动物中发现了与细菌PDF序列同源的序列，但不知它们的确切功能。Giglione等(2000a)和(2000b)。
由于该酶在人体中无活性，所以一直将它用作抗细菌药物、通常是PDF抑制剂的靶。二硫酚可通过巯基与活性位点金属离子的配位作用而作为非特异性PDF抑制剂。Rajagopalan等(1997)。就1，2-或1，3-二硫酚来说，发生缓慢的从活性位点提取金属离子。分别形成各自包含两个金属-硫键的稳定的5元或6元环这一事实说明了该作用。
应用一个合理地设计的组合文库来选定一般结构HS-CH2-CH(Ra)-CONH-CH(Rb)-CONH-Rc的基于机制的PDF抑制剂。Wei等(2000)。选自该文库的最佳抑制剂具有一个作为Ra的n-Bu基，Rb＝-(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2，而且Rc是2-萘。该化合物起竞争性PDF抑制剂的作用，Ki是15nM。
Jayasekera等(2000)描述了一系列结构上与抑制大肠埃希氏菌(B.coli)PDF的已知抗胆固醇血的甲状腺丙酸(thyropropic acid)相关的非肽化合物。据报导，放线酰胺素是一种活性在次毫微摩尔K1范围内的有效的PDF抑制剂。Chen等(2000)。
Wei和Pei(2000)描述了5-氟脱氧尿苷的5′-二肽基衍生物在PDF催化的去甲酰作用时释放小分子(5-氟脱氧尿苷(5-F-dUrd))。在由纯化的PDF或大肠埃希氏菌粗溶菌产物催化的底物反应中监测到5-F-dUrd形成。该化合物在应用于大肠埃希氏菌时有一定程度的细胞毒性(IC50＞100μM)。效能不因PDF在细菌(应用PDF超量表达株)中表达的增大而增大。所述化合物对革兰氏阳性微生物稍微更有效(IC50＝50μM)。
Apfel等(2000)、Apfel等(2001a)、Apfel等(2001b)、Clements等(2001)、Durand等(1999)和Chen等(2000)描述了另外的抑制剂。然而，还没有描述过被PDF选择性地和有效地活化成毒素的化合物或作用剂。本发明满足了这个需要并提供了相关的优势。
发明公开因此，在一方面，本发明提供了具有如下结构的前体药物化合物 其中，所述毒素是被酶活化时释放的细胞毒性或抗生素分子，而不是5-F-dUrd；
其中，R1，R2，R4和R5独立地相同或不同并且选自下组氢，取代的或未取代的C5-C14芳基或杂芳基(例如苯基亚甲基，4-羟基苯基亚甲基，咪唑亚甲基等)，以及取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基(例如甲基，乙基，3-羟基丙基，3-氨基丙基，N-甲基-3-氨基乙基，2-甲氧基乙基等)；其中，R3选自下组取代的或未取代的芳基或杂芳基(例如苯基亚甲基，三唑亚甲基，噻吩亚甲基等)，以及取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基(例如乙基，丙基，2-羟基乙基等)和-CH2-CH2-X-CH3，其中，X选自下组O，S，NH，NR6和CH2，其中，R6是低级烷基，例如甲基或乙基；其中，A1和A3独立地相同或不同并且选自下组＝O，＝S，＝NH，＝N-OH，或＝N-R7，其中，R7是氢或C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，A2选自下组＝O，＝S，＝NH，＝N-OH，＝N-R8，或＝C(R9)(R10)，其中，R8，R9和R10独立地相同或不同并且选自氢或C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，B1选自下组-O-，-S-，-NH-或-N(R11)-，其中，R11选自氢和C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，B2不存在或者选自下组-O-，-S-，-N(R12)-或-C(R13)(R14)-，其中，R12，R13和R14独立地相同或不同并且选自下组氢或者取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基(例如甲基，乙基，3-羟基丙基，3-氨基丙基，N-甲基-3-氨基乙基，2-甲氧基乙基等)，其中，当B2是-N(R12)-或-C(R13)(R14)-时，它可另外通过R12，R13或R14连接到R4或R5而形成一个环结构；其中，片段-B2-C(R4)(R5)-C(＝A3)-作为一个整体是脯氨酸或脯氨酸衍生物或类似物；其中，B3不存在或者选自下组-O-，-S-，或-NH-，或-N(R15)-，其中，R15选自氢和C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，B4不存在或者选自下组-O-，-S-，-N(R6)-和-C(R16)(R17)-，其中，R16和R17独立地相同或不同并且选自下组氢或者取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；
其中，“连接基”不存在或是无痕迹的连接基而且可选自下列结构之一 或 其中，n＝2或3，而且R是低级烷基，例如甲基或乙基；其中，Y和Z独立地相同或不同并且选自下组氢，低级烷基，取代的或未取代的低级烯基，取代的或未取代的低级炔基，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂环基，取代的或未取代的低级烷氧基，低级烷基硫基，卤素，氰基，硝基，羧酸根，磺酸根，烷基砜，烷基亚砜和三烷基甲硅烷基。
一方面，其中，R1和R2独立地相同或不同并且选自取代的或未取代的C1～C6低级烷基。在进一步的方面，R1和R2独立地相同或不同并且选自甲基和H。在又一方面，R1和R2各自是H。
一方面，R3是-CH2-CH2-X-CH3，其中，X选自氧、硫或亚甲基。在进一步的方面，R4选自取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1～C6低级烷基和H。在又一方面，R4是甲基或H。还提供了这种化合物，其中，R4和R5独立地相同或不同并且选自H和取代的或未取代的C1～C6烷基。
另一方面，R4和R5独立地相同或不同并且选自H和甲基。在一个备选的实施方案中，R4和R5中的任一个是H或二者都是H。
一方面，所述肽去甲酰酶ECTA化合物具有N-甲酰-Met-Leu-连接基-原毒性基团(prototoxophore)的结构。
一方面，所述化合物具有结构 化合物#2一方面，所述化合物具有结构 一方面，所述化合物具有结构
一方面，所述化合物具有结构 一方面，所述化合物具有结构 一方面，所述化合物具有结构 当毒素不存在时，化合物是NB3145。
一方面，所述化合物具有结构
当毒素不存在时，化合物是NB3162。
一方面，所述化合物具有结构 当毒素不存在时，化合物是NB3177。
一方面，所述化合物具有结构 当毒素不存在时，化合物是NB3144。
一方面，所述化合物具有结构
当毒素不存在时，化合物是NB3165。
本发明还提供了一种抑制表达PDF的微生物的生长的方法，该方法通过使所述微生物与有效量的上述化合物接触。该方法抑制了下列革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的生长，例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、产气肠杆菌(B.aerogenes)和阴沟肠杆菌(B.cloacae)。该方法可在体外、离体和体内实施。还提供了一种减轻受试验者中被PDF表达微生物感染的症状的方法，该方法通过对受试验者给予或送递有效量的上述化合物。本文定义的“受试验者”包括哺乳动物，例如人患者。
本发明还提供了一种组合物，它包含上述前体药物化合物，单独的或与其它化合物或其它作用剂(已知的或有待发现的)组合，以及一种载体。一方面，所述载体是另一种分子或惰性物质，例如板或柱。在一个备选的实施方案中，所述载体是药物上可接受的载体。药物上可接受的载体是本领域已知的和上文简要描述的。
附图简述附图提供了本发明化合物的PDF激活反应图解。
实施本发明的方式如本文应用的某些术语可能具有下列定义。
单数形式“一个/一种”和“所述”包括其复数形式，除非文中另外清楚地说明。例如，术语“一个细胞”包括很多个细胞，包括它们的混合物。
术语“包含/包括”旨在表示组合物和方法包括引述的要素，但不排除其它要素。当用来定义组合物和方法时，“基本由…构成”将表示排除对所述组合体有任何实质意义的其它要素。所以，一种基本由本文定义的要素构成的组合物应当不排除来自分离和纯化方法的痕量杂质和药物上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲的盐水、防腐剂等。“由…构成”将表示排除不止其它组分的痕量要素以及用于给予本发明组合物的实质方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案属于本发明的范围。
“低级烷基、炔基或烯基”表示直链的、支化的或环状的基，除非另有定义，它们包含1～10个碳原子(C1-C10)，或者含C1-C6或C1-C4的基。
如本文应用的术语“前体药物”表示这种药物活性剂或物质的母体或衍生物形式，即，与药物代谢物相比对靶细胞的细胞毒性更小，并且可被酶促活化或转化为更有活性的形式。
一种“组合物”旨在表示下列物质的组合活性剂和另一种化合物或组合物，所述另一种化合物或组合物是惰性的(例如一个表面、一种涂料、一种可检测到的作用剂或标记或者一种药物上可接受的载体)或是活性的，例如辅剂或消毒剂。
一种“药物组合物”旨在包含下列物质的组合一种活性剂和一种载体，所述载体是惰性的或活性的，使所述组合物适合体外、体内或离体诊断或治疗应用。
术语“预防有效量”表示在预防受试验者感染或植物侵染方面有效的量。
术语“药物上可接受的载体”和“生物上可接受的载体”表示一种与本发明化合物一起对宿主或患者给药的载体或辅剂，而且当以足以送递有效量的化合物的剂量给予时，它不破坏所述化合物的药理活性并且无毒。合适的载体实例包括液相载体，例如无菌的或水性的溶液，以及下文描述的那些。药物上可接受的载体实例包括任何标准的药物载体，例如磷酸盐缓冲的盐水溶液，水，以及乳液，例如水包油或油包水乳液，以及各种类型的润湿剂。所述组合物还可包含稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和辅剂的实例可参见，Martin，REMINGTON′S PHARM.SCI.，第15版(Mack Publ.Co.，Easton(1975))。
“取代基”表示一个替代与被取代的基中碳或氮连接的一个或多个氢的基。取代基的实例包括烷基、亚烷基、烷基羧基、烷氧基、烯基、烯基羧基、烯基氧基、芳基、芳氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、-OH、酰胺、甲酰胺、羧基、磺酰、＝O、＝S、-NO2、卤素、卤代烷基、稠合的饱和的或不饱和的任选取代的环、-S(O)R、-SO3R、-SR、-NRR′、-OH、-CN、-C(O)R、-OC(O)R、-NHC(O)R、-(CH2)nCO2R或-(CH2)nCONRR′，其中，n是0～4，而且其中，R和R′独立地是H、烷基、芳基或烷基芳基。取代基还包括用任选取代的杂原子代替碳原子和一个或多个相关的氢原子。
术语“处理”表示下列任何情况患者中特定障碍的症状的减轻，与特定障碍相关的可查明的检测的改善，或者微生物数量的减少。本领域技术人员能通过注意微生物载荷的减少或与感染相关的症状的减轻来确定何时宿主已被“处理”了。
术语“药物上可接受的盐、前体药物或衍生物”涉及本发明化合物的任何药物上可接受的盐、酯、醚、酯的盐、溶剂合物(例如乙醇盐)或其它衍生物，当它被给予接受者时能提供(直接或间接地)本发明的化合物或其活性代谢物或残基。特别有益的衍生物和前体药物是那些，即，当将这样的化合物给予哺乳动物时(例如使经口给予的化合物更容易被吸收入血液)可增大本发明化合物的生物利用率或者增强送递母体化合物到生物的隔室(例如脑或淋巴系统)。
本发明化合物的盐可得自无机的或有机的酸和碱。酸的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸，例如草酸，虽然它们自身不是药物上可接受的，但可用于制备适用作获得本发明的化合物和它们的药物上可接受的酸加合盐的中间体的盐。碱的实例包括碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨、式NW4+的化合物，其中，W是C1-4烷基，以及THAM(2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇)。
盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、氟庚酸盐(flucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、巴莫酸盐(palmoate)、果胶酯酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐(phenylproprionate)、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。盐的其它实例包括本发明化合物的阴离子与合适的阳离子例如Na+、Li+、NH4+和NW4+(其中，W是C1-4烷基)化合的盐。
为治疗应用，本发明化合物的盐将是药物上可接受的。然而，非药物上可接受的酸和碱的盐也可用于例如制备或纯化药物上可接受的化合物或用于减少植物中的微生物侵染。
术语“无痕迹的连接基”表示单个分子的两部分之间的间隔基或连接基，于是，当该分子两部分之间一个特定的键被切断时，仍然与该分子的第二部分连接的连接基消失而没有留下它自己的痕迹。参见例如，F.M.H.de Groot等(2000)J.Med.Chem.433093～3102。
术语“有效量”旨在包括治疗上或预防有效的量。该术语表示作为单一疗法或与其它作用剂组合在处理或预防患者的感染或植物中的侵染中有效的量。
对微生物的“抑制生长”表示通过与所述作用剂接触，与没有和这种作用剂接触的相同物质的对比微生物比较，这种微生物的增殖速率减小了。
“受试验者”是任何生物，它是或可能是PDF表达微生物的直接或间接宿主，包括植物和动物，例如鱼，禽类，或者哺乳动物(优选是人)。鱼包括但不限于，玩赏动物和水产动物。禽类包括但不限于，宠物、运动动物(sport animals)和家畜。哺乳动物包括但不限于，鼠类、猿猴、人类、家畜、运动动物和宠物。
实例包括但不限于，无脊椎动物，脊椎动物，例如禽类或哺乳动物，例如人类患者。哺乳动物包括但不限于，鼠类、猿猴、人类、家畜、运动动物和宠物。
PDF是一种研究得很彻底的酶。已知它的结晶结构，Chan等(1997)。该酶是在大肠埃希氏菌BL21(DE3)细胞中表达的，Rajagopalan等(1997)。论文的作者利用基于基因序列的文献数据设计的引物通过PCR分离了大肠埃希氏菌def基因。纯化后的酶由于被大气中的氧迅速氧化催化位点Fe2+而不稳定，Rajagopalan等(1998)。已报导了适当处理该酶以免灭活的条件，Rajagopalan等(1997)。重要的是，含有Zn2+和Ni2+的PDF′s是稳定的，允许在体外评价所述酶的催化性质。有关于PDF的简单的连续比色分析，Wei和Pei(1997)。它利用N-甲酰甲硫氨酰亮氨酸对-硝基苯胺作为底物。跟着PDF反应发生的偶联氨肽酶反应释放可通过分光光度法在405nm处检测的对-硝基苯胺。
PDF是一种完美的ECTA靶酶。它在细菌中有活性而在人宿主中无活性。它具有宽的底物特异性。去甲酰作用释放甲硫氨酸的游离氨基(或在底物的P1位耐受的另一氨基酸，例如正亮氨酸)，它可进行后续的亲核进攻。利用合理地设计的二肽，游离氨基能进攻二肽的最适位置的羰基，于是形成来自所述二肽的环状分子(二酮哌嗪，DKP)并释放一种毒素。可优化所述二肽以增强DKP形成。图中给出了提出的反应的图解。这里，X可以是硫(甲硫氨酸)或-CH2-(正亮氨酸)。R1和R2都是可基于关于PDF发布的SAR数据选定的脂族基，Hu等(1998)。
所以，一方面，本发明提供了具有如下结构的前体药物 其中，所述毒素是被酶活化时释放的细胞毒性或抗生素分子，而不是5-F-dUrd；其中，R1，R2，R4和R5独立地相同或不同并且选自下组氢，取代的或未取代的C5-C14芳基或杂芳基(例如苯基亚甲基，4-羟基苯基亚甲基，咪唑亚甲基等)，以及取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基(例如甲基，乙基，3-羟基丙基，3-氨基丙基，N-甲基-3-氨基乙基，2-甲氧基乙基等)；其中，R3选自下组取代的或未取代的芳基或杂芳基(例如苯基亚甲基，三唑亚甲基，噻吩亚甲基等)，以及取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基(例如乙基，丙基，2-羟基乙基等)和-CH2-CH2-X-CH3，其中，X选自下组O，S，NH，MR6和CH2，其中，R6是低级烷基，例如甲基或乙基；其中，A1和A3独立地相同或不同并且选自下组＝O，＝S，＝NH，＝N-OH，或＝N-R7，其中，R7是氢或C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，A2选自下组＝O，＝S，＝NH，＝N-OH，＝N-R8，或＝C(R9)(R10)，其中，R8，R9和R10独立地相同或不同并且选自氢或C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，B1选自下组-O-，-S-，-NH-或-N(R11)-，其中，R11选自氢和C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，B2不存在或者选自下组-O-，-S-，-N(R12)-或-C(R13)(R14)-，其中，R12，R13和R14独立地相同或不同并且选自下组氢或者取代的或未取代的、饱和的或不饱和的G1-C6烷基(例如甲基，乙基，3-羟基丙基，3-氨基丙基，N-甲基-3-氨基乙基，2-甲氧基乙基等)，其中，当B2是-N(R12)-或-C(R13)(R14)-时，它可另外通过R12，R13或R14连接到R4或R5而形成一个环结构；其中，片段-B2-C(R4)(R5)-C(＝A3)-作为一个整体是脯氨酸或脯氨酸衍生物或类似物；其中，B3不存在或者选自下组-O-，-S-，或-NH-，或-N(R15)-，其中，R15选自氢和C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，B4不存在或者选自下组-O-，-S-，-N(R6)-或-C(R16)(R17)-，其中，R16和R17独立地相同或不同并且选自下组氢或者取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，“连接基”不存在或是无痕迹的连接基而且可选自下列结构之一 其中，n＝2或3，而且R是低级烷基，例如甲基或乙基；其中，Y和Z独立地相同或不同并且选自下组氢，低级烷基，取代的或未取代的低级烯基，取代的或未取代的低级炔基，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂环基，取代的或未取代的低级烷氧基，低级烷基硫基，卤素，氰基，硝基，羧酸根合，磺酸根合，烷基砜，烷基亚砜和三烷基甲硅烷基。
一方面，其中，R1和R2独立地相同或不同并且选自取代的或未取代的C1一C6低级烷基。在进一步的方面，R1和R2独立地相同或不同并且选自甲基和H。在又一方面，R1和R2各自是H。
一方面，R3是-CH2-CH2-X-CH3，其中，X选自氧、硫或亚甲基。在进一步的方面，R4选自取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1～C6低级烷基和H。在又一方面，R4是甲基或H。一方面，R4和R5独立地相同或不同并且选自H和取代的或未取代的C1～C6烷基。
另一方面，R4和R5独立地相同或不同并且选自H和甲基。在一个备选的实施方案中，R4和R5中的任一个是H或二者都是H。
毒素的实例包括但不限于，蒽环、长春花生物碱、丝裂霉素、博来霉素、青霉素、头孢菌素、苯唑西林、carbopenems、四环素、氯霉素、大环内酯类、环丝氨酸、氟喹诺酮、糖肽、氨基糖苷、肽抗生素、噁唑烷酮、喹诺酮、磺酰胺、细胞毒性核苷、蝶啶类、氮芥、多卤代联苯、diynenes、鬼臼毒素、taxoids、多柔比星、洋红霉素、柔红霉素、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、泊非霉素、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、鬼臼毒素、依托泊苷、磷酸依托泊苷、美法仑、长春地辛、长春碱、长春新碱、异长春碱、环氧长春碱、双(2-氯乙基)胺、trichlorcarban、三氯N-碳酰苯胺、三溴N-水杨酰替苯胺、磺胺甲噁唑、氯霉素、环丝氨酸、甲氧苄啶、氯己定、六氯酚、芬替克洛、5-氯-2-(2，4-二氯苯氧基)酚、4-氯-2-(2，4-二氯苯氧基)酚、3-氯-2-(2，4-二氯苯氧基)酚、6-氯-2-(2，4-二氯苯氧基)酚、5-氯-2-(3，4-二氯苯氧基)酚、5-氯-2-(2，5-二氯苯氧基)酚、5-氯-2-(3，5-二氯苯氧基)酚、2，2′-二羟基联苯醚、卤代2-羟基二苯酮、2-巯基吡啶-N-氧化物、combretastatin、喜树碱、apoptolidene、顺铂、epothilone、halichondrin、hemiasterlin、4-氨-5-羟甲-2-甲硫基嘧啶、thapsigargin、氯喹、4-羟基环磷酰胺、依托泊苷、秋水仙碱、美法仑、槲皮素、金雀异黄素、制表菌素、N-(4-氨基丁基)-5-氯-2-萘磺酰胺(naphtalen-sulfonamide)、吡啶基噁唑-2-酮、异喹啉基噁唑酮-2-酮、维拉帕米、奎宁、奎尼丁和氯喹。
一方面，所述化合物具有结构 化合物#2一方面，所述化合物具有结构
一方面，所述化合物具有结构 一方面，所述化合物具有结构 一方面，所述化合物具有结构
一方面，所述化合物具有结构 当毒素不存在时，该化合物是NB3145。
一方面，所述化合物具有结构 当毒素不存在时，该化合物是NB3162。
一方面，所述化合物具有结构
当毒素不存在时，该化合物是NB3177。
一方面，所述化合物具有结构 当毒素不存在时，化合物是NB3144。
一方面，所述化合物具有结构 当毒素不存在时，该化合物是NB3165。
本发明还提供了一种抑制PDF表达微生物的生长的方法，该方法通过使微生物与有效量的上述化合物接触。检测PDF表达的方法是本领域已知的，参见例如Wei和Pei(1997)。该方法特别适用于抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的生长，例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和下表2中标识的那些。进一步提供了一种减轻受试验者中感染的症状的方法，其中，所述感染是由PDF表达微生物引起的，该方法通过对受试验者给予或送递有效量的上述化合物。本发明还提供了一种处理由PDF表达微生物引起的感染的方法，该方法通过对受试验者给予或送递有效量的上述化合物。前文定义了“受试验者”，它包括哺乳动物，例如人患者。下表2中提供了PDF表达微生物的实例以及由这些微生物的感染引起的相应疾病和症状。
表2
本发明还提供了一种组合物，它包含上述前体药物化合物，单独的或与其它化合物或其它作用剂(已知的或有待发现的)组合，以及一种载体。一个实施方案，所述载体是药物上可接受的载体。
前体药物抗生素的临床应用将可能根据建立良好的指南。剂量将可能与已经用于大多数其它抗生素的那些相似。估计前体药物的剂量在100mg～1gm范围内，每8小时给药一次，或者一天一次，给药1或2周，或者直到患者对感染的生物体检测是阴性。
一方面，本发明包括一种处理或保护植物以防PDF表达微生物引起的感染的方法，该方法通过应用有效量的底物前体药物。
为了使用于处理植物的化合物达到良好的分散和粘附，可能有利的是用促进分散和粘附的组分配制所述化合物。合适的配方将是本领域技术人员已知的。
本发明还提供了一种处理或保护植物以防表达PDF的微生物感染的方法，该方法通过对叶、根或者植物或根周围的土壤应用有效量的前体药物化合物。可将这些分离的化合物与已知农药或杀虫剂结合。
本发明范围内的化合物当用来处理或保护植物以防PDF表达微生物引起的感染时，它们可作为可润湿的粉末、颗粒等配制，或者可被微囊包封于合适的载体等中。其它制品的实例包括但不限于，可溶性粉末、可润湿的颗粒、干流动性物质、含水的流动性物质、可润湿的分散性颗粒、可乳化的浓缩物和水分散液。其它合适的制品将是本领域技术人员已知的。
本发明还提供了一种对鱼给予预防或处理PDF表达微生物引起的感染有效量的所述前体药物化合物的方法。可通过将所述化合物掺入鱼的食物来源而给予化合物。也可将化合物加到鱼生活的水中或盛有鱼的水中。最后，可作为合适的药物制剂对鱼给予所述化合物。其它合适的制剂将是本领域技术人员已知的。
进一步提供了一种生产本发明的前体药物的方法。通常，该方法需要下列步骤
将一个合理地设计的组合文库用来选定基于机制的PDF抑制剂，Wei等(2000)。选自该文库的最佳抑制剂具有结构HS-CH2-CH[(CH2)3-CH3]-CONH-CH[-(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]-CONH-R，其中，R是2-萘。该化合物起竞争性PDF抑制剂的作用，它的Ki是15nM。
关于上述图，X可以是硫(甲硫氨酸)或-CH2-(正亮氨酸)。R1～R5和B1～B3都如前文的定义。反应条件和关于缩写的全称可见于下文的试验本发明提供了一种鉴定抑制表达PDF的生物生长的潜在治疗剂的方法，该方法通过将包含PDF表达微生物的样品与有效量的备选前体药物化合物接触。在一个单独的样品中，将同一种微生物与有效量的本发明的前体药物接触。如果所述作用剂具有比得上本文所述的前体药物的抗增殖能力，备选物就适用于抑制PDF表达微生物的生长或杀伤它。
将所述前体药物与样品在有利于由PDF活化该前体药物的条件下接触，然后分析样品生长抑制作用或微生物的死亡。备选地，可测试样品以确定底物上是否存在PDF的反应副产物。将不同量的底物与表达PDF的微生物接触达使PDF从细胞释放毒素有效的时间，将细菌裂解并应用本领域已知的方法(例如HPLC)分析被分析物以鉴定反应产物。
使不同浓度的潜在作用剂与样品接触以确定作用剂的最佳有效浓度。于是，一方面，本发明涉及发现和使用是PDF的选择性底物的作用剂。
本发明还提供了包含本文所述前体药物和进行筛选所需的指示的试剂盒。
可在体外、离体或体内实施本发明的方法。在例如大鼠或小鼠的动物中体内实施本发明的方法提供了一个可在临床测试治疗剂或前体药物以前应用的方便的动物模型系统。在该系统中，各自与未处理的、感染的动物相比，如果微生物负荷减少了或者感染的症状减轻了，潜在的前体药物将是成功的。它还可适用于具有未被感染的细胞或动物的单独的阴性对比组，它们提供了比较的基础。
当在体内实施时，对动物施用或送递有效量的备选前体药物。如本文应用的术语，为了体内和离体目的而“施用”表示提供给受试验者有效量的有效地减少微生物负荷的备选前体药物。在这些情况下，所述作用剂或前体药物可与药物上可接受的载体一起施用。本发明的作用剂、前体药物和组合物可用于药物的制备和通过按常规方法施用而用来处理人和其它动物，例如处于药物组合物中的活性组分。
施用药物组合物的方法是本领域普通技术人员已知的，并且包括但不限于，微量注射、静脉内或肠胃外施用。所述组合物旨在表面、经口或局部施用以及静脉内、皮下或肌内施用。施药可在处理过程中连续地或间隙地进行。确定最有效的施用方法和剂量的方法是本领域技术人员已知的而且将随用于治疗的前体药物、治疗目的、被处理的微生物、感染的严重性和受处理的对象而变。可进行一次或多次施药，剂量水平和模式由处理医师选定。例如，可对已经患有抗生素抗性细菌感染的受试验者施用所述组合物。在该情况下，施用有效的“治疗量”组合物以防止继续的和至少部分地阻止微生物生长和增殖并减轻与感染相关的症状。
然而，可将所述前体药物施用给易受感染或处于发生感染的危险中的受试验者或个体。在这些实施方案中，施用“预防有效量”的组合物以保持细胞存活率和功能在接近感染前水平的水平。
可以呈一次剂量、在处理过程中连续地或间隙地进行体内施药。确定最有效的施药方法和剂量的方法是本领域技术人员已知的而且将随用于治疗的组合物、治疗目的、被处理的靶细胞和受处理的对象而变。可进行一次或多次施药，剂量水平和模式由处理医师选定。下文可见适当剂量的制剂和施用作用剂的方法。
所述药物组合物可通过经口、经鼻、肠胃外或通过吸入疗法施用，而且可呈片剂、锭剂、粒剂、胶囊、丸剂、安瓿、栓剂或气溶胶形式。它们还可呈活性组分在水性或非水稀释剂中的悬浮液、溶液和乳液，糖浆剂，粒化物或散剂形式。除了本发明的作用剂以外，所述药物组合物还可包含其它药物活性化合物或多种本发明的化合物。
更具体地说，可通过任何合适的途径施用在本文也称为活性组分的本发明的作用剂进行治疗，这些途径包括经口，经直肠，经鼻，局部(包括经皮、气溶胶、经颊和舌下)，经阴道，肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和经皮)和肺部。还应懂得，这些途径将随接受者的状况和年龄、以及受处理的疾病而变。
理想的是，应当施用所述作用剂以达到活性化合物在疾病位点的峰值浓度。这可通过例如下列方法实现静脉内注射作用剂，任选用盐水，或者经口施用，例如作为含有活性组分的片剂、胶囊或糖浆剂。可通过连续输注保持所需的作用剂血液水平以提供活性组分在疾病组织内的治疗量。预期利用有效的组合以提供治疗组合，该组合需要比单独应用各个单独治疗化合物或药物时可能需要的更低的各组分作用剂总剂量，于是减小副作用。
虽然有可能单独施用作用剂，但优选作为药剂呈递它，该药剂包含至少一种如前文规定的活性组分，连同一种或多种它的药物上可接受的载体且任选包含其它治疗剂。每种载体在与制剂中的其它组分相容的含义中必须是“可接受的”而且对患者无害。
制剂包括适合经口，经直肠，经鼻，局部(包括经皮、经颊和舌下)，经阴道，肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和经皮)和肺部施用的那些。所述制剂可就便呈单元剂型提供并且可通过药物领域已知的任何方法制备。这样的方法包括将活性组分与组成一种或多种配合剂的载体结合这一步骤。通常，制剂可这样制备将活性组分与液态载体或粉碎的固态载体或二者均匀地、致密地混合，然后如果需要的话将产品加工成型。
适合口服的本发明的制剂可作为独立的单元提供，例如作为胶囊、扁囊剂或片剂，它们各自含有预定量的活性组分；作为散剂或粒剂；作为水性或非水液体中的溶液或悬浮液；或者作为水包油乳液或油包水乳液。活性组分还可呈大丸剂、药糖剂或糊剂提供。
片剂可通过压制或模压制备，任选与一种或多种配合剂一起压制。压制片剂可这样制备，即，在合适的机械中将呈自由流动形式(例如粉末或颗粒)的活性组分压制，所述活性组分任选与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可通过在合适的机械中将用惰性液态稀释剂润湿的粉状化合物的混合物进行模压制备。可任选将片剂包衣或划痕而且可这样配制以致提供其中的活性组分的缓慢或控制的释放，应用例如不同比率的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放分布。片剂可任选具有肠衣，从而提供在部分肠道而不是在胃中的释放。
适合在口中局部施药的制剂包括锭剂，它包含处于调味的基料中的活性组分，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；在惰性基料例如明胶和甘油，或者蔗糖和阿拉伯胶中包含活性组分的软锭剂；以及在合适的液态载体中包含活性组分的漱口剂。
本发明供局部施药的药物组合物可作为软膏、乳膏、悬浮液、洗剂、散剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油配制。备选地，制剂可能包括贴剂或敷料，例如浸渍了活性组分和任选一种或多种赋形剂或稀释剂的绷带或橡皮膏。
如果需要的话，乳膏基料的水相可能包括例如，至少约30％w/w的多元醇，即，具有两个或两个以上羟基的醇，例如丙二醇、1，3-丁二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇及其混合物。局部制剂可能需要包含一种增强作用剂通过皮肤或其它受感染部位的吸收或渗透的化合物。这类经皮渗透增强剂的实例包括二甲亚砜和相关的类似物。
本发明乳液的油相可按已知方式从已知组分构成。虽然该相可能仅仅包含一种乳化剂，但希望它包含至少一种乳化剂与一种脂肪或一种油或者与一种脂肪和一种油二者的混合物。优选地，同时包含一种亲水性乳化剂与起稳定剂作用的亲脂性乳化剂。在一个变化形式中，它包含油和脂肪二者。同时，含有或不含稳定剂的乳化剂构成所谓的乳化蜡，而且该蜡与油和/或脂肪一起构成所谓的乳化软膏基料，它形成乳膏制剂的油性分散相。
适用于本发明制剂中的乳化剂和乳液稳定剂包括Tween 60、Span80、十六醇十八醇混合物、十四醇、甘油单硬脂酸酯和十二烷基硫酸钠。
制剂的合适的油或脂肪的选择基于实现所需的美容性质，因为活性化合物在药物乳液制剂中可能应用的大多数油中的溶解度很低。所以，乳膏应当优选是一种不含油脂的、无污染的和可洗的产品，它具有合适的稠度以免从管或其它容器中渗漏。可应用直链或支链的、一元或二元烷基酯，例如二异己二酸酯(di-isoadipate)、硬脂酸异十六酯、椰子油脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己酯或者被称为Crodamol CAP的支链酯混合物。这些物质可根据所需性质单独用或组合用。备选地，可应用高熔点脂质，例如白色软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。
适合对眼局部施药的制剂还包括滴眼剂，其中，活性组分溶于或悬浮于合适的载体(特别是用于作用剂的水性溶剂)中。
适合经直肠给药的制剂可作为具有合适的基料的栓剂提供，它包含例如可可脂或水杨酸酯。
适合阴道施药的制剂可作为阴道栓、塞子、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂提供，它们除了包含所述作用剂以外，还包含本领域认为适当的载体。
适合经鼻给药的制剂(其中，载体是固体)包括粗粉末，它具有例如在约20～约500微米范围内的粒径，将它作为干粉给药或者放入吸入装置中从靠近鼻子的粉末容器通过鼻通道迅速吸入。其中，载体是给药液体的合适的制剂(例如鼻喷雾剂、滴鼻剂)或者通过喷雾器给药的气溶胶包括作用剂的水溶液或油溶液。
适合肠胃外给药的制剂包括水性和非水的等渗无菌注射液，它们可能包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，它们使制剂与预期的受体血液等渗；以及可能包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水的无菌悬浮液，以及被设计成将化合物靶向血液组分或者一个或多个器官的脂质体或其它微粒体系。所述制剂可呈单元剂量或多剂量密闭的容器(例如安瓿和小瓶)提供，而且可在冷冻干燥的(冻干的)条件下贮存，只需就在应用前添加无菌液态载体，例如注射用水。临时的注射溶液和悬浮液可从以前所述类型的无菌粉末、颗粒和片制备。
有意义的单元剂量制剂包括那些，即，它们包含如前文引述的作用剂的日剂量或单元、日亚剂量，或者它们的适当部分。
应懂得，除了前文具体提到的以外，本发明的制剂还可能包含本领域常见的关于所述类型制剂的其它作用剂，例如，适合口服的那些可能包含这样的作用剂，例如甜味剂、增稠剂和调味剂。还希望本发明的作用剂、组合物和方法与其它合适的组合物和疗法结合。
本发明的这些作用剂和上述化合物及其衍生物可用于制备用于本文描述的方法中的药剂。
在前体药物的临床应用中，抗生素将可能遵守既定的指南。剂量可能与已经用于大多数其它抗生素的相似。估计前体药物的剂量将在100mg～1gm范围内，每8小时给药一次，或一天一次，给药一或二周，或者直到患者关于感染的生物检验呈阴性。
如下实施例旨在阐述、而不是限制本发明。
实施例1-化合物#1和#2的合成图解 BOC-N-叔丁氧羰基；BOP-苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)六氟磷酸鏻；TEA-三乙胺；THF-四氢呋喃；RT-室温；TFA-三氟乙酸化合物1的合成在0℃下的氩气氛中将N-Boc亮氨酸(1.0g，4.32mmol)、三氯生(1.25g，4.32mmol)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)六氟磷酸鏻(1.91g，4.32mmol)和三乙胺(1.33g，12.9mmol)在无水THF(25ml)中的溶液搅拌4小时。添加水(20ml)，用乙酸乙酯(2×30ml)萃取反应混合物。用水、盐水洗涤合并的有机层，在Na2SO4上干燥。蒸发溶剂并利用硅胶柱色谱法纯化，用2％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱液，提供了化合物-1，为无色胶质(1.66g，75％)。
1H NMR(CDCl3，500MHz)0.91(d，2H，J＝Hz)，1.43(s，9H)，1.51-1.60(m，2H)，1.69-1.73(m，1H)，4.43-4.48(m，1H)，4.83(d，1H，J＝Hz)，6.80(d，1H，J＝Hz)，6.86(d，1H，J＝Hz)，7.14-7.26(m，2H)，7.26(s，1H)，7.43(d，1H，J＝Hz)。
化合物#2的合成将化合物-1(0.25g，0.5mmol)在无水苯甲醚(0.055g，0.5mmol)中的溶液冷却到0℃，在15分钟期间缓慢地添加TFA(0.56g，5.0mmol)。拆去冰浴并且继续搅拌又3小时。然后在减压下除去全部挥发性物质而给出一种胶质。添加无水THF并在氩气氛中冷却到0℃。添加苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)六氟磷酸鏻(0.25g，0.57mmol)、N-甲酰甲硫氨酸(0.1g，0.57mmol)和三乙胺(0.21g，2.1mmol)。薄层色谱法表明在0℃下0.5小时后反应完全。用水、盐水洗涤反应混合物，在Na2SO4上干燥。利用硅胶柱色谱法纯化而提供了化合物#2，为无色稠胶层。
1H NMR(CDCl3，500MHz)0.88(d，3H，J＝Hz)，0.91(d，J＝Hz)，1.50-1.56(m，1H)，1.60-1.71(m，2H)，1.95-2.02(m，1H)，2.09(s，3H)，2.50(m，1H)，2.58(m，1H)，4.65-4.70(m，1H)，4.74(q，1H，J＝Hz)，6.48(d，1H)，6.78-6.85(m，2H)，7.15-7.25(m，3H)，7.44(s，1H)，8.17(s，1H)。
实施例2-一般合成方案方案1
方案-2
方案-3 其中，在所有上述合成方案中，X和Y独立地相同或不同并且选自下组氢、低级烷基、取代的或未取代的低级烯基、取代的或未取代的低级炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂环基、取代的或未取代的低级烷氧基、低级烷硫基、卤素、氰基、硝基、羧酸根合、磺酸根合、烷基砜、烷基亚砜和三烷基甲硅烷基。
在上述一般合成方案和如下具体实施例中，应用了下列缩写PyBOP是苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基六氟磷酸鏻；DMF是N，N-二甲基甲酰胺；NaHCO3是碳酸氢钠；RP-HPLC是反相高效液相色谱；TLC是薄层色谱；HCl是盐酸；TFA是三氟乙酸；而且DIEA是N，N-二异丙基乙胺。
利用上述一般方法，制备了如下特定的化合物。
实施例3(r)-吡咯烷-1，2-二羧酸2-叔丁酯-1-4-甲酰-2，6-二甲基苯基)酯(方案2，化合物2)的制备 将Py-BOP(6.8g，13.0mmol)加到N-叔丁氧羰基-D-脯氨酸(2.34g，10.9mmol)和3，5-二甲基-4-羟基苯甲醛(1.96g，13.0mmol)在无水DMF(12mL)的溶液中，搅拌到溶解。在搅拌下添加N，N-二异丙基乙胺(7.6mL，43.0mmol)和4-二甲氨基吡啶(122mg，1mmol)。将形成的溶液搅拌2.5小时。用乙醚(100mL)覆盖反应混合物并用水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。在无水硫酸钠上干燥乙醚层，过滤，真空浓缩。通过柱色谱法在硅胶上纯化形成的红色油，用二氯甲烷作为洗脱剂。回收清亮的淡黄色油(1.16g，31％)。1H NMR(CDCl3，500MHz)9.92(s，1H)，7.59(s，2H)，4.63-4.66(m，1H)，3.45-3.62(m，2H)，2.25(s，6H)，1.99-2.42(m，4H)，1.48(s，9H)。
实施例42-(s)-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(方案2中的中间体)的制备 将1，3-二环己基碳二亚胺(2.48g，12.0mmol)加到N-甲酰-L-甲硫氨酸(1.77g，10.0mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(1.38g，12.0mmol)在无水THF(20mL)的冰冷溶液中。在冰浴中搅拌溶液，于是迅速地形成晶体。将反应物放入冷藏箱中一夜(约14小时)。通过过滤除去晶体沉淀物(大概是二环己基脲副产物)。用二氯甲烷稀释滤液，并通过过滤除去形成的固体。在真空下使滤液转化为固体。将这些固体溶于乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。在无水硫酸钠上干燥乙酸乙酯层，过滤，再在真空下转化为油。粗油(2.8g，理论的102％)不用进一步纯化而直接用。
实施例51-(s)-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰)-吡咯烷-2-羧酸-4-甲酰-2，6-二甲基-苯酯(方案2，化合物3)的制备 将三氟乙酸(5.0mL)加到化合物5(1.16g，3.33mmol)的无水二氯甲烷(5.0mL)溶液中。在氮气氛中将形成的溶液搅拌30分钟。将溶液真空浓缩而除去过量的TFA，然后重溶于二氯甲烷(7mL)。在该溶液中添加化合物4(0.91g，3.31mmol)和DIEA(1.2mL，6.88mmol)。在室温下氮气中将反应混合物搅拌3小时。用乙酸乙酯溶解反应混合物，然后用HCl水溶液(0.1M)、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。在无水硫酸钠上干燥乙酸乙酯层，过滤，再在真空下浓缩至干。回收清亮的油(1.09g，81％产率)。1H NMR(CDCl3，500MHz)9.91(s，1H)，8.18(s，1H)，7.58(s，2H)，6.49(d，J＝8.29Hz，1H)，5.08-5.11(m，1H)，4.78(dd，J ＝ 3.5，8.8Hz，1H)，3.91-3.94(m，1H)，3.69-3.73(m，1H)，2.53-2.58(m，2H)，2.41-2.46(m，1H)，2.25(s，6H)，2.15-2.29(m，2H)，2.11(s，3H)，2.08-2.16(m，2H)，1.89-1.95(m，1H)。
实施例61-(s)-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰)-吡咯烷-2-羧酸-4-羟甲基-2，6-二甲基-苯酯(方案2，化合物4)的制备 将硼氢化钠(50mg，1.3mmol)加到化合物3(1.08g，2.7mmol)的无水THF(10mL)溶液中。将形成的悬浮液搅拌20分钟，随后TLC分析表明醛的完全还原。用乙酸乙酯(100mL)覆盖混合物并用HCl水溶液(0.1M，15mL)猝灭。分离有机层，用HCl水溶液(0.1M，15mL)、饱和NaHCO3水溶液(15mL)和盐水洗涤。在无水硫酸钠上干燥有机层，过滤，再真空浓缩至干。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，用乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱而给出白色固体(165mg，15％产率)，1H NMR(CDCl3，500MHz)8.19(s，1H)，7.07(s，2H)，6.44(d，J＝7.9Hz，1H)，5.05-5.10(m，1H)，4.84(dd，J＝4.9，8.5Hz，1H)，4.61(br.s，2H)，3.84-3.88(m，1H)，3.80-3.84(m，1H)，2.54-2.57(m，2H)，2.43-2.48(m，1H)，2.18(s，6H)，2.06-2.46(m，5H)，2.05(s，3H)，1.89-1.94(m，1H)。
实施例71-乙基-6-氟-7-(4-{4-[1-(s)-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰)-吡咯烷-2-羰基氧基]-3，5-二甲基-苄氧羰基}-哌嗪-1-基)-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-羧酸(方案2，化合物5)的制备
在氩气氛中将化合物2(20mg，0.049mmol)和1，1-碳酰二咪唑(36mg，0.22mmol)在无水DMF中的溶液搅拌3小时。将形成的清亮黄色溶液在冰浴上骤冷，用水(3μL，0.17mmol)猝灭并搅拌90分钟。暖至室温后，添加诺氟沙星(19mg，0.060mmol)和碳酸氢钠(17mg，0.20mmol)而形成悬浮液。搅拌150分钟后，该悬浮液逐渐地(但不完全地)清亮。用乙酸乙酯(10mL)溶解反应混合物并用10％柠檬酸溶液(2×4mL)和饱和盐水(4mL)洗涤。在无水硫酸镁上干燥上述乙酸乙酯溶液，过滤，在真空下浓缩至干。通过制备性RP-HPLC(20～60％乙腈)纯化形成的清亮油(29mg)，给出黄色粉末产物(10.3mg，27％产率)。1H NMR(CDCl3，500MHz)12.95(br.s，1H)，8.68(s，1H)，8.20(s，1H)，8.09(d，J＝12.5Hz，1H)，7.08(s，2H)，6.83(d，J＝6.57Hz，1H)，6.52(d，J＝8.3Hz，1H)，5.05-5.10(m，3H)，4.84(dd，J＝4.9，8.5Hz，1H)，4.31(q，J＝7.2Hz，2H)，3.86-3.90(m，1H)，3.80-3.84(m，1H)，3.74(br.s，4H)，3.28(br.s，4H)，2.54-2.57(m，2H)，2.44-2.46(m，1H)，2.19(br.s，6H)，2.05(s，3H)，2.02-2.3(m，4H)，1.89-1.95(m，1H)，1.58(t，J＝7.2Hz，3H).
实施例82-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-乙基-戊酸4-氯甲基-苯酯的制备(方案3) 在冰浴中冷却化合物X(0.2gr，0.55mmol)在无水二氯甲烷中的溶液再在氩气氛下添加PCl5(0.11gr，0.55mmol)。反应完毕后，添加NaHCO3水溶液并搅拌10min。分离有机层，用水、盐水洗涤后干燥(Na2SO4)。蒸发挥发物后提供了化合物XX，没有进一步纯化而将它用于下一步反应。
1H NMR(CDCl3，500MHz)1.00-1.03(m，6H)，1.72-1.86(m，3H)，2.02-2.15(m，2H)，2.1(s，3H)，2.53-2.66(m，2H)，4.57(s，2H)，4.75-4.81(m，2H)，6.46-6.47(m，1H)，6.73-6.77(m，1H)，7.07-7.10(m，2H)，7.38-7.41(m，2H)，8.20(s，1H).
实施例92-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊酸4-甲酰-苯酯(方案1，化合物2)的制备 1H NMR(CDCl3，500MHz)1.01-1.02(m，6H)，1.46(s，9H)，1.64-1.68(m，1H)，1.76-1.83(m，2H)，4.52-4.54(m，1H)，4.92-4.94(d，2H，J＝7.6Hz)，7.28-7.29(d，2H，J＝8.48Hz)，7.91-7.93(d，2H，J＝8.48Hz)，9.99(s，1H).
实施例102-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-甲基-戊酸4-羟甲基-苯酯(方案1，化合物4) 1H NMR(CDCl3，500MHz)0.99-1.03(m，6H)，1.71-1.87(m，3H)，2.02-2.15(m，2H)，2.11(s，3H)，2.53-2.66(m，2H)，4.68(s，2H)，4.76-4.79(m，2H)，6.46-6.47(m，1H)，6.70-6.74(m，1H)，7.06-7.08(m，2H)，7.36-7.39(m，2H)，8.19(s，1H).
实施例112-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-甲基-戊酸4-(1-羟基-1，2-二氢-吡啶-2-基硫基甲基)-苯酯(NB3024)的制备 1H NMR(CDCl3，500MHz)0.98-1.02(m，6H)，1.71-1.84(m，3H)，2.02-2.21(m，2H)，2.14(s，3H)，2.60-2.66(m，2H)，4.15(s，2H)，4.75-4.78(m，2H)，6.48-6.50(m，1H)，6.70-6.74(m，1H)，7.06-7.08(m，3H)，7.12(d，1H，J＝7.7 Hz)，7.21-7.24(m，1H)7.36-7.39(m，2H)，8.19(s，1H)，8.26(d，1H，J＝6.36Hz).
实施例122-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-甲基-戊酸2，6-二溴-4-羟甲基-苯酯(NB3144)的制备 1H NMR(CDCl3，500MHz)0.99-1.03(m，6H)，1.71-1.87(m，3H)，2.02-2.15(m，2H)，2.11(s，3H)，2.53-2.66(m，2H)，4.68(s，2H)，4.76-4.79(m，2H)，6.41-6.46(m，1H)，6.61-6.63(d，1H，J＝8.69)，7.58(s，2H)，8.21(s，1H).
实施例132-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-甲基-戊酸5′-羟甲基-[1，1′；3′，1″]三联苯-2′-基酯(NB3145)的制备 1H NMR(CDCl3，500MHz)0.70-0.75(m，6H)，1.71-1.87(m，3H)，2.01-2.16(m，2H)，2.13(s，3H)，2.53-2.66(m，2H)，4.45-4.53(m，2H)，4.78(s，2H)，6.08-6.10(d，1H)，6.27-6.27(d，1H，J＝8.69)，7.33-7.40(m，12H)，8.12(s，1H).
实施例142-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-甲基-戊酸2-溴-4-羟甲基-6-甲氧基-苯酯(NB3162)的制备 1H NMR(CDCl3，500MHz)1.00-1.02(m，6H)，1.60-1.77(m，2H)，1.80-1.86(m，1H)，1.95-2.12(m，2H)，2.11(s，3H)，2.61-2.66(m，2H)，3.82(s，3H)，4.66(s，2H)，4.74-4.78(m，1H)，4.93-4.98(m，1H)，6.41-6.45(m，1H)，6.60(d，1H，J＝8.45)，6.94(s，1H)，7.16(s，1H)，8.20(s，1H).
实施例152-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-甲基-戊酸4-羟甲基-2，6-二甲基-苯酯(NB3165)的制备
1H NMR(CDCl3，500MHz)1.02-1.03(m，6H)，1.72-1.93(m，3H)，2.01-2.17(m，2H)，2.11(s，3H)，2.15(s，6H)，2.65(t，2H，J＝6.99Hz)，4.62(s，2H)，4.76-4.86(m，2H)，6.40(d，1H，J＝7.83Hz)，6.65(d，1H，J＝7.82Hz)，7.09(s，2H)，8.20(s，1H)实施例161-乙基-6-氟-7-(4-{4-[2-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-甲基-戊酰氧基]-苄氧基羰基}哌嗪-1-基)-4-氧代-1，4-二氢-喹啉-3-羧酸(NB3057)的制备 1H NMR(CDCl3，500MHz)0.99-1.03(m，6H)，1.55(m，3H)，1.71-1.87(m，3H)，2.02-2.15(m，2H)，2.11(s，3H)，2.53-2.66(m，2H)，3.27(brs，4H)，3.78(brs，4H)，4.30(q，2H，J＝7.19，14.44Hz)，4.76-4.80(m，2H)，5.15(s，2H)，6.46-6.47(m，1H)，6.71-6.72(m，1H)，6.83(d，1H，J＝6.87Hz)，7.08-7.10(m，2H)，7.38-7.41(m，2H)，8.10(d，1H，J＝12.64Hz)，8.21(s，1H)，8.68(s，1H).
实施例171-环丙基-6-氟-4-氧代-7-哌嗪-1-基-1，4-二氢-喹啉-3-羧酸4-[2-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-甲基-戊酰氧基]-苄酯(NB3068)的制备 1H NMR(DMSO-d6)，500MHz)0.89-0.91(m，3H0，0.94-0.96(m，3H)，1.10-1.12(m，2H)，1.25-1.26(m，2H，1.70-1.75(m，4H)，2.02-2.15(m，2H)，2.11(s，3H)，3.44(brs，4H)，3.78(brs，4H)，3.42-3.44(m，1H)，4.50-4.55(m，2H)，5.27(s，2H)，7.08-7.10(m，2H)，7.47-7.49(m，1H)，7.53-7.55(m，1H)，7.85(d，1H，J＝12HZ)，8.02(s，1H)，8.35(t，1H，J＝12.64Hz)，8.50(s，1H)，8.62-8.68(m，1H)，8.79(s，2H).
实施例182-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-甲基-戊酸2-溴-6-呋喃-2-基-4-羟甲基-苯酯(NB3177)的制备 1H NMR(CDCl3，500MHz)0.93-1.02(m，6H)，1.75-1.87(m，3H)，2.04-2.15(m，2H)，2.17(s，3H)，2.50-2.56(m，2H)，4.71(s，2H)，4.71-4.77(m，2H)，5.04-5.08(m，1H)，6.39-6.43(m，1H)，6.49(s，1H)，6.62(d，1H，J＝9.08Hz)，6.71-6.80(m，1H)，7.50-7.55(m，2H)，7.71(s，1H)，8.21(s，1H).
实施例192-(2-甲酰氨基-4-甲硫基-丁酰氨基)-4-甲基-戊酸4-{[二-(2-氯-乙基)-甲氨酰氧基]-甲基}-苯酯(NB3103)的制备
1H NMR(CDCl3，500MHz)0.99-1.03(m，6H)，1.71-1.84(m，3H)，2.02-2.21(m，2H)，2.11(s，3H)，2.64-2.67(m，2H)，3.57-3.77(m，8H)，4.76-4.81(m，2H)，5.13(s，2H)，6.42-6.44(m，1H)，6.70(d，1H，J＝8.1Hz)，7.08-7.13(m，2H)，7.35-7.38(m，2H)8.20(s，1H)实施例20-敏感性测试将NCCLS(临床实验室标准国家委员会)测定抗微生物化合物的MIC的方法改良后用于高处理量筛选。所有试验化合物的储备液都根据溶解度而在水或DMSO中配制。在最高浓度下，DMSO含量不应当超过0.5％。简单地说，在一个384孔微量滴定板中从最高浓度进行试验化合物的二十次2倍系列稀释。用培养液中的试验细菌接种每孔到约1～1.5×106个细胞/ml的最终浓度。利用微量滴定板读出器(Tecan SpectraFluorPlus)通过600nm处的光密度增大测定了细菌生长。将MIC定义为在细菌生长所需的适当温度下温育16～18小时后细菌生长(相当于可见的生长)受抑制时的最低浓度。关于化合物#2的结果示于表3(细菌)和表4。
表3
表4
大肠埃希氏菌/TEM-表达TEM-1β-内酰胺酶的大肠埃希氏菌；MRSA-甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌；MSSA-甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌。
用化合物#2如上述那样处理哺乳动物细胞。接触16小时后所述化合物对哺乳动物细胞没有毒性(IC50约为30μm)。
应用上文提供的检测，将化合物#2的效能与三氯生的进行了比较。结果示于表5中。
表5
实施例21NB3057和NB3068抗关键细菌病原体的活性表6比较了NB3057和NB3068与诺氟沙星和环丙沙星抗几种细菌病原体的MIC。
表6
实施例22各种化合物的血浆稳定性的检测表7示出了几种PDF ECTA化合物在PBS、Mueller Hinton培养液、小鼠血浆和人血浆中的血浆稳定性。
表7
应懂得，虽然结合上述实施方案描述了本发明，但前文的描述和实施例旨在阐述而不是限制本发明的范围。属于本发明范围的其它方面、优点和修饰对本发明所属领域技术人员而言是显而易见的。
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PCT/US99/01332，“Enzyme Catalyzed Therapeutic Agents”(酶催化的治疗剂).
PCT/US00/20008，“Enzyme Catalyzed Therapeutic AgentCompounds”(酶催化的治疗剂化合物).
权利要求
1.一种具有如下结构的化合物 其中，R1，R2，R4和R5独立地相同或不同并且选自下组氢，取代的或未取代的C5-C14芳基或杂芳基(例如苯基亚甲基，4-羟基苯基亚甲基，咪唑亚甲基等)，以及取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基(例如甲基，乙基，3-羟基丙基，3-氨基丙基，N-甲基-3-氨基乙基，2-甲氧基乙基等)；其中，R3选自下组取代的或未取代的芳基或杂芳基(例如苯基亚甲基，三唑亚甲基，噻吩亚甲基等)，以及取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基(例如乙基，丙基，2-羟基乙基等)和-CH2-CH2-X-CH3，其中，X选自下组O，S，NH，NR6和CH2，其中，R6是低级烷基，例如甲基或乙基；其中，A1和A3独立地相同或不同并且选自下组＝O，＝S，＝NH，＝N-OH，或＝N-R7，其中，R7是氢或C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，A2选自下组＝O，＝S，＝NH，＝N-OH，＝N-R8，或＝C(R9)(R10)，其中，R8，R9和R10独立地相同或不同并且选自氢或C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，B1选自下组-O-，-S-，-NH-或-N(R11)-，其中，R11选自氢和C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，B2不存在或者选自下组-O-，-S-，-N(R12)-或-C(R13)(R14)-，其中，R12，R13和R14独立地相同或不同并且选自下组氢或者取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基(例如甲基，乙基，3-羟基丙基，3-氨基丙基，N-甲基-3-氨基乙基，2-甲氧基乙基等)，其中，当B2是-N(R12)-或-C(R13)(R14)-时，它可另外通过R12，R13或R14连接到R4或R5而形成一个环结构；其中，片段-B2-C(R4)(R5)-C(＝A3)-作为一个整体是脯氨酸或脯氨酸衍生物或类似物；其中，B3不存在或者选自下组-O-，-S-，或-NH-，或-N(R15)-，其中，R15选自氢和C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，B4不存在或者选自下组-O-，-S-，-N(R6)-和-C(R16)(R17)-，其中，R16和R17独立地相同或不同并且选自下组氢或者取代的或未取代的、饱和的或不饱和的C1-C6烷基，例如甲基，乙基或甲氧基甲基；其中，“连接基”不存在或是无痕迹的连接基；而且其中，“毒素”是通过激活酶激活时有毒性的作用剂，但须所述毒素不是5-氟脱氧尿苷，或其任何衍生物或类似物。
2.权利要求
1的化合物，其中，R1和R2都是氢。
3.权利要求
2的化合物，其中，R3是-CH2-CH2-X-CH3，其中，X选自氧、硫或甲基。
4.权利要求
3的化合物，其中，X是硫或氧。
5.权利要求
4的化合物，其中，A1和A2都是氧。
6.权利要求
5的化合物，其中，B1是-NH。
7.权利要求
1的化合物，其中，所述连接基选自C6H4-CH2-和-C6H4-CH2-X1-C(＝X2)-，其中，X1和X2独立地相同或不同并且选自-O-、-S-和-N(Ra)，而且其中Ra是氢或低级烷基；以及-(CH2)n-NRb-(C＝O)-，其中n＝2或3，而且Rb是氢或低级烷基。
8.权利要求
7的化合物，其中，B4不存在。
9.权利要求
8的化合物，其中，所述毒素选自下组2-巯基吡啶-N-氧化物、环丙沙星、诺氟沙星、氮芥及其衍生物、类似物和药物上可接受的盐。
10.权利要求
9的化合物，其中，B2是-NH，B3是-O-，R4是2-甲基丙基，而且R5是氢。
11.权利要求
9的化合物，其中，所述毒素是诺氟沙星或其衍生物、类似物或药物上可接受的盐。
12.权利要求
1的化合物，其中，所述化合物被纯化了。
13.一种组合物，它包含权利要求
1的化合物和一种载体。
14.权利要求
13的组合物，其中，所述载体是一种药物上可接受的载体。
15.一种抑制微生物生长的方法，它包括，使所述微生物与有效量的权利要求
1的化合物接触。
16.一种处理受试验者的方法，它包括，给予该受试验者有效量的权利要求
1的化合物。
17.一种鉴定潜在的治疗剂的方法，它包括(a)使一种微生物与权利要求
1的化合物在有利于该化合物结合入所述微生物的条件下接触；以及(b)对照未处理的微生物样品分析微生物的增殖量。
专利摘要
本发明提供了一种抑制表达肽去甲酰酶的微生物生长的方法，它通过使所述微生物与有效量的本文描述的化合物接触。该方法抑制了革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的生长，例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌。该方法可在体外、离体和体内实施。进一步提供了一种缓解受试验者中受肽去甲酰酶表达微生物感染的症状的方法，它通过对受试验者施用或送递有效量的上述化合物。
文档编号C12Q1/18GKCN1662238SQ03813847
公开日2005年8月31日 申请日期2003年4月17日
发明者M·V·谢尔盖耶娃, V·R·多帕拉普迪 申请人:塞米得肿瘤学美国公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan