专利名称:一种h5n1禽流感病毒样颗粒疫苗的规模化制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域：
，涉及一种新型高致病性H5m禽流感病毒样颗粒 (VLPs)的构建、规模化制备方法。
技术背景
流感是危害人类健康的重要传染病。其病原体属于正粘病毒科流感病毒属，根据病毒核蛋白抗原性不同，分为A、B和C三型。A型流感病毒(Influenza A Virus, IAV)为有囊膜的RNA病毒，基因组由分节段的8个单股负链RNA片段组成。根据病毒粒子表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性不同，A型流感病毒分为16种不同的HA亚型(H1-H16) 禾口 9种不同的亚型NA(N1-N9)。
A型流感病毒宿主范围广泛，具有高度的变异性，被认为是未来流感大流行的最大威胁。人类历史上发生过3次流感大暴发，分别是1918年由Hmi亚型流感病毒引起的西班牙大流感、1957年由H2N2亚型流感病毒引起的香港流感和1968年由H3N2亚型流感病毒引起的亚洲流感。2009年4月由人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒重配产生甲型Hmi 流感病毒，具有新的抗原性和极强的水平传播能力，引起巨大的公共卫生恐慌。所幸的是， 这种新型Hmi流感病毒感染的死亡率较低。
对人类来说，H5N1型流感病毒是一种新型流感病毒，1997年在香港首次从人体分离到H5m毒株。此后，H5m禽流感病毒先后在亚洲、欧洲和非洲的60多个国家引起家禽和野禽的禽流感暴发，随后直接从禽传染到人，导致500多人感染，死亡率约60%。由于人群中先前存在的流感病毒抗体不能中和抵抗该型病毒，增加了该病毒在人群中爆发大流行的可能。尤其令人担忧的是，如果这种高致病性H5m禽流感病毒因抗原变异及与人流感病毒(如新型Hmi流感病毒)之间发生基因重配产生能在人群中迅速传播和引起流感大流行新病毒株时，将会对人类造成可怕的后果。
同其它病毒性疫病一样，人禽流感的预防主要依赖于疫苗免疫接种。现行生产的 H5N1人用禽流感疫苗是采用传统季节性人流感疫苗方法制备的全病毒灭活疫苗或裂解型疫苗。人H5m禽流感疫苗毒株系采用“反向遗传操作技术”，用来源人感染患者H5m病毒分离株的HA和NA编码基因替换季节性Hmi流感病毒基因组中相应基因产生的重配株， 该重配株能编码H5m禽流感病毒的HA和NA抗原，其它编码基因则来源Hmi疫苗株基因组，以降低H5m禽流感病毒的致病性。尽管如此，采用这种重配H5m毒株按传统流感疫苗工艺生产疫苗仍面临许多困难。包括H5m病毒培养与实验操作有严格的生物安全要求， 疫苗生产必须在三级生物安全实验室(BSL3)内操作，对生产人员安全构成威胁，并导致成本升高；病毒灭活不彻底导致的毒力残留给疫苗制品的安全造成巨大风险；因毒力强引起鸡胚致死，难以在鸡胚中高滴度增殖；此外，在H5m禽流感爆发时势必会增加对疫苗总量的要求，而爆发期间会引起鸡的大量死亡，很难获得满足生产能力需求的鸡胚。尤其重要的是，传统流感疫苗生产工艺制备的H5m禽流感疫苗免疫原性较差，疫苗接种难以诱导持久免疫和交叉保护。因此，研发安全、高效的H5m禽流感新型疫苗显得尤为迫切。[0006]近年来发展起来的病毒样颗粒(virus like particles，VLPs)，含有病毒的一个或多个抗原蛋白、具有与病毒粒子相似结构的颗粒，不含有病毒的遗传物质，不能自主复制，没有感染性，能以天然构象和模式递呈抗原，有效刺激细胞和体液免疫，诱导机体产生良好的免疫保护，特别适用于流感病毒新型疫苗的研制。这种新疫苗策略应用于高致病性 H5N1禽流感病毒VLPs疫苗研发，能克服现行H5W人用禽流感疫苗生产各种困难，具有良好的前景和巨大发展潜力。近年来，国内外在流感病毒VUs研制方面进行了许多有益的探索。Latham等Q001)首次利用杆状病毒载体同时表达H3N2流感病毒HA、NA、Ml和M2蛋白，在Sf9细胞中制备出流感病毒VLPs，并证实该VLPs与野生型流感病毒粒子具有类似的结构。Pushko等000 利用重组杆状病毒在Sf9细胞中共表达禽流感病毒H9N2的HA、NA 和Ml蛋白，并自装配成具有血凝和神经氨酸酶活性的VLPs，该VLPs纯化后免疫动物能诱导针对H9N2的特异性抗体应答和抗H9N2病毒强毒致死攻击的免疫保护；Galarza等Q005) 利用杆状病毒表达系统构建了表达H3N2流感病毒HA和Ml的VLPs疫苗，经鼻内滴注或肌肉注射免疫小鼠，可诱导机体产生HA抗体和抵抗同源流感毒株的致死攻击。Bright等Q007) 利用杆状病毒表达系统构建了 H5W流感病毒VLPs，能够诱导小鼠和雪貂抵抗H5W流感病毒的攻击。近来，我们(Tao等，2009)利用杆状病毒表达系统构建了 H5m毒株HA、NA和Ml 蛋白组装的VLPs，能够诱导小鼠产生抵抗人源和禽源H5W亚型病毒攻击的免疫保护。尽管在研制人禽流感VLPs疫苗方面进行了许多有益的探索并取得了诸多成果，但在提高保护性抗原表达量和VLPs规模化制备方面还存在诸多值得改进的地方，致使人用H5W禽流感病毒VLPs疫苗仍未应用临床。
另一方面，美国氰胺公司的J.M.加拉尔萨和T.E.莱瑟姆博士在流感病毒颗粒 (VLP)装配方面也开展了大量探索。在野生型和嵌合流感病毒VUs构建、修饰、颗粒装配和作为药物应用等方面提出了一些新的方法和理念，并已获准我国发明专利
专利名称野生型和嵌合流感病毒样克隆(VLP)的装配，公开号CN1437655A
。该专利提出了 46项权利要求
，内容涉及流感病毒样颗粒的生产方法、嵌合病毒样颗粒，病毒样颗粒稀释剂或载体，以及药物组合等诸多方面，并列举了 15个实施例。但按照该专利的实施步骤，不能从流感病毒开始操作，生产出病毒样颗粒疫苗制品。该专利涉及的病毒样颗粒生产步骤更不适用于 H5N1禽流感病毒颗粒的规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型高致病性H5m禽流感病毒样颗粒(VLPs)疫苗的规模化制备方法。
为实现上述目的，本发明的规模化制备方法依次包括如下步骤
1)重组质粒rbacmid/HANAMl的构建和提取；
2)将重组质粒rbacmid/HANAMl转染Sf9昆虫细胞杆状病毒，在细胞内装配病毒样颗粒；
3)规模化Sf9细胞培养、重组病毒感染和病毒样颗粒的纯化。
作为一种优选，进一步的技术方案是
所述的重组质粒rbacmid/HANAMl的构建包括重组质粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/ HANAMl的构建及其在宿主菌DHlOMultibacte中重组。[0015]步骤3中所述的病毒样颗粒的纯化采用离心分离技术。
本发明方法利用杆状病毒新型高效表达系统(Multibac)，将编码H5W禽流感病毒株血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和基质蛋白(Ml)的基因克隆到转移载体质粒pFBDM 和pUCDM中，置于杆状病毒晚期启动子plO和pH控制下，外源基因下游连接SV40polyA或 HSVtk polyA加尾信号序列，构成外源基因表达盒；将重组转移载体质粒pFBDM/HANAMl和 pUCDM/HANAMl转化至携带杆状病毒基因组的大肠杆菌DHlOMultibacte中进行T7转座重组和LoxP位点特异性重组，筛选获得重组Bacmid ；将rbacmid DNA转染Sf9昆虫细胞，采用Sf9细胞规模化悬浮培养和重组杆状病毒增殖，结合离心分离技术，纯化得到高致病性 H5N1禽流感病毒样颗粒(VLPs)疫苗。
本发明还提供VLPs制品的分析检定方法和功能评价方法，包括VLPs免疫接种动物诱导产生特异性免疫应答和抗病毒感染攻击的检测方法。
本发明在充分借鉴抗病毒免疫和流感病毒样颗粒疫苗最新研究成果基础上，通过开展蛋白表达、病毒样颗粒生产与纯化步骤优化，建立了一种新型高致病性H5m禽流感病毒样颗粒(VLPs)疫苗的规模化制备方法，该方法适用于大规模制备人用抗高致病性H5m 禽流感新型基因工程VLPs疫苗，安全高效，具有良好的开发和应用前景。
图1表达H5m流感病毒HA、NA和Ml的重组穿梭质粒的构建示意图。
图2表达H5m流感病毒HA、NA和Ml蛋白重组杆状病毒感染Sf9细胞时抗原蛋白表达.A为正常Sf9细胞；B为重组杆状病毒感染的Sf9细胞；C为重组杆状病毒感染的Sf9 细胞中表达HA (抗HA多克隆抗体免疫荧光检测)；D为重组杆状病毒感染Sf9细胞中表达 NA (抗NA多克隆抗体免疫荧光检测)。
图3Westernblot分析重组杆状病毒感染Sf9细胞中HA、NA和Ml蛋白表达情况 (Ant i-HA、Ant i-NA和Ant i-Ml三种多克隆抗体分别检测出对应的蛋白；每种抗体对应图中第1列为未感染重组病毒的Sf9细胞阴性对照，第2列为感染重组病毒的Sf9细胞)。
图4纯化制备的VLPs分析检测.A为Western blot分析VLPs中HA、NA和Ml蛋白组分(第1-4列为不同的样品)；B和C分别为VLPs电子显微镜低倍和高倍观察分析照片。
图5VLPs免疫接种小鼠诱导的特异性抗HA和抗NA抗体㈧和H5W特异性病毒中和抗体(B)效价分析。
图6VLPs免疫接种小鼠诱导抗H5W禽流感病毒致死攻击的免疫保护.A为免疫接种小鼠和非免疫小鼠体重变化；B为免疫接种小鼠和非免疫小鼠抗强毒株致死攻击的存活率比较。
图7VLPs免疫接种小鼠产生抗异源H5W禽流感病毒非致死攻击的免疫保护检测.A为免疫接种小鼠和非免疫小鼠攻毒感染后肺病毒滴度比较；B和C为免疫接种小鼠和非免疫小鼠攻毒感染后肺组织病理变化比较(C显示非免疫接种小鼠肺组织明显的病理损伤；B显示VLPs免疫接种小鼠显著降低的组织病理损伤)；D为正常小鼠肺组织学观察。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例。进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明的具体实验条件和方法， 通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
^MM 1H5N 1禽、流感病毒病毒样颗粒(VLPs)疮苗 射如聿与检测丨
1.引物的设计合成
根据WHO推荐的H5W人禽流感病毒疫苗株
A/reassortant/NIBRG-14 (H5N1)(A/Viet Nam/1194/200 Puerto Rico/8/1934) 基因组序列中血凝素HA编码序列(Genbank No. GQ4M861)、神经氨酸酶NA序列(Genbank No. GQ454862)和基质蛋白M序列(Genbank No. GQ4M867)，分别设计合成三对特异性引物， 分别扩增HA、NA和Ml基因；设计一条A型流感病毒通用引物用于cDNA合成；各引物由上海生工生物工程技术有限公司合成；各引物的序列和编号如下
1) HA基因PCR扩增引物
上游引物Pl (SEQ ID NO. 1)
5 ‘ -TACCCGGGGCCAGCATGGAGAAAATAGT-3‘
下游引物P2 (SEQ ID NO. 2)
5 ‘ -GGCTAGCTTAAATGCAAATTCTGC-3‘
(扩增产物5'端含有XmaI位点，3'端含有NheI位点)
2) NA基因PCR扩增引物
上游引物P3 (SEQ ID NO. 3)
5 ‘ -TGCCCGGGGCCACCATGAATCCAAATCA-3‘
下游引物P4 (SEQ ID N0. 4)
5' -CGCTAGCCTACTTGTCAATGGTG-3‘
(扩增产物5'端含有XmaI位点，3'端含有NheI位点)
3) M基因PCR扩增引物
上游引物P5 (SEQ ID N0. 5)
5 ‘ -TGTCGACGCCACCATGAGTCTTCTAACC-3‘
下游引物P6 (SEQ ID N0. 6)
5 ‘ -GCTAAGCTTTCACTTGAATCGCTGCAT-3‘
(扩增产物5'端含有MlI位点，3'端含有HindIII位点)
4)A型流感病毒通用逆转录引物(SEQ ID N0. 7)
5 ‘ -AGCAAAAGCAGG-3‘
2. H5N1禽流感病毒人用疫苗种毒株(NIBRG-14)总RNA提取及cDNA合成
取100 μ 1NIBRG-14 (Η5Ν1)病毒鸡胚尿囊液，用总RNA提取试剂盒(一步法总RNA 抽提试剂盒，BSC51S1，上海华舜生物工程有限公司产品)，按试剂盒操作说明书介绍的方法提取病毒总RNA。提取的RNA溶于16 μ 1 DEPC处理过的水中，加入1 μ 1通用逆转录引物 (SEQ ID NO. 7)，70°C反应5min，迅速冰浴5min，加入逆转录混合液5Χ逆转录酶缓冲液 (RT Buffer) 5 μ 1，ClNTI3S(IOyM)O. 5 μ 1，RNA 酶抑制剂(RNsin)O. 5 μ 1, M-MLVl μ L· 在 PCR热循环仪上进行以下反应42°C 60min,95°C 5min，置冰浴，产物即为病毒基因组cDNA，冻存备用。
3. PCR 扩增
以步骤2合成的H5m禽流感病毒cDNA为模板，PCR分别扩增HA，NA和Ml基因， 扩增反应体系和具体反应条件如下
1) HA基因扩增
cDNA 模板2 μ 1
Pl (10 μ Μ)1 μ 1
Ρ2(10μΜ)1 μ 1
ΝΤΡ(ΙΟμΜ)1 μ 1
10XPCR 缓冲液5 μ 1
pfu DNA 聚合酶(5U/μ 1)1 μ 1
ddH2039 μ 1
用移液器将上述组分混勻，在PCR热循环仪上进行以下反应95°C变性5min，再 950C 30Sec,52°C 30Sec,72°C 20(^ec 进行 30 个循环。72°C IOmin0
2) NA基因扩增
cDNA 模板2 μ 1
Ρ3(10μΜ)1 μ 1
Ρ4(10μΜ)1 μ 1
ΝΤΡ(ΙΟμΜ)1 μ 1
10 X PCR 缓冲液5μ1
pfu DNA 聚合酶(5U/ μ 1)1 μ 1
ddH2039 μ 1
用移液器将上述组分混勻，在PCR热循环仪上进行以下反应95°C变性5min，再 950C 30Sec,52°C 30Sec,72°C 17(^ec 进行 30 个循环。72°C反应 IOmin0
3) Ml基因扩增
cDNA 模板2 μ 1
Ρ5(10μΜ)1 μ 1
Ρ6(10μΜ)1 μ 1
ΝΤΡ(ΙΟμΜ)1 μ 1
10 X PCR 缓冲液5μ1
pfu DNA 聚合酶(5U/ μ 1)1 μ 1
ddH2039 μ 1
用移液器将上述组分混勻，在PCR热循环仪上进行以下反应95°C变性5min，再 950C 30Sec,52°C 30Sec,72°C 12(^ec 进行 30 个循环。72°C IOmin
4.含HA、NA和Ml基因重组转移质粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/HANAMl构建
1)用限制性核酸内切酶Xma I和Nhe I双酶消化pFBDM 载体(Redbiotec公司产品)，然后用Xma I和Nhe I双酶消化步骤3. 1) PCR扩增的HA产物，琼脂糖凝胶电泳，DNA 回收试剂盒(W5211，上海华舜生物工程有限公司产品，下同)分别回收DNA片段(按试剂盒说明书操作)，以1 3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑起重组子阳性克隆接种5毫升LB培养基中37°C培养过夜，质粒纯化试剂盒(Omiga公司产品，下同)提取质粒 DNA (按试剂盒说明书操作)，经酶切分析和核苷酸测序验证，获得重组质粒pFBDM/HA。
2)用限制性核酸内切酶Ml I和HindIII双酶分别消化pFBDM/HA载体和步骤 3.3)PCR扩增的Ml产物，琼脂糖凝胶电泳，DNA回收试剂盒回收DNA片段，以1 3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑起重组子阳性克隆接种5毫升LB培养基中37 V培养过夜，提取质粒(操作步骤同4. 1)，获得重组质粒pFBDM/HAMl。
3)用限制性核酸内切酶Xma I和Nhe I双酶分别消化pFBDM载体和步骤3. 2PCR 扩增的NA物，琼脂糖凝胶电泳，DNA回收试剂盒回收DNA片段，以1 3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑起重组子阳性克隆接种5毫升LB培养基中37°C培养过夜，提取质粒(操作步骤同4. 1)，获得重组质粒pFBDM/NA。
4)用RneI和AvrII消化pFBDM/HAMl，凝胶电泳分离，DNA回收试剂盒纯化HAMl融合片段；用SpeI和NruI消化pFBDM/NA凝胶纯化得线性化的pFBDM/NA，把线性化的pFBDM/ NA和MHAWl 3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌DH5ci，从相应的抗性平板上挑斑。 并用菌落PCR鉴定出阳性克隆。从5毫升大肠杆DH5ci菌培养物中37°C培养过夜，提取质粒DNA，提取质粒(操作步骤同4. 1)，获得重组转移质粒pFBDM/HANAMl。
5)用PmeI和AvrII酶切pFBDM/HANAMl，凝胶电泳分离，DNA回收试剂盒纯化 HANAMl融合片段；用PmeI和AvrII酶切pUCDM，凝胶电泳分离，DNA回收试剂盒纯化线性化质粒PU⑶M，pUCDM与HANAMl融合片段按1 3的比例混合连接。连接产物转化大肠杆菌BW23474，从相应的抗性平板上挑斑。并用菌落PCR鉴定出阳性克隆。从5毫升大肠杆BW23474菌培养物中37°C培养过夜，提取质粒(操作步骤同4. 1)，获得重组转移质粒 pUCDM/HANAMl。
5.重组Bacmid的获得
1)制备感受态大肠杆菌DH10Multibac&e
采用CaCl2法制备大肠杆菌DHlOMultibacte (Redbiotec公司产品)感受态细胞。 具体地，取1. 5ml培养至对数生长期菌液至2ml离心管中，冰浴IOmin ；4°C，4200rpm离心 5min ；弃去上清，加入Iml预冷0. IM CaCl2溶液重悬细胞，冰浴IOmin ；4°C，4200rpm离心 5min，弃去上清，加入100 μ 1预冷0. IM CaCl2溶液重悬细胞；4°C保存过夜，次日用于转化连接产物；或者加入DMSO，-70°C长期保存备用。
2)重组质粒在宿主菌DHlOMultibacte中重组
将纯化的重组质粒pFBDM/HANAMl转化DH10Multibac&e，按照 MultibacExpression System说明书操作。具体地，取1 μ 1重组质粒pHANAMl加入 100 μ IDHlOMultibactte感受态细胞中，轻轻混勻，冰浴30min ；42°C，热激45sec ；冰浴^iiin ； 加入二抗的LB培养基(卡那霉素50 μ g/ml和四环素10 μ g/ml) ,37V, 200rpm培养4h ；将转化DHlOMultibactte培养菌液10倍梯度稀释，每梯度取200 μ 1涂布含有X_gal (100 μ g/ ml)和IPTG (40 μ g/ml)的三抗平板(含卡那霉素50 μ g/ml，四环素10 μ g/ml，庆大霉素 7口8/1111)，371静置培养36-4 1。挑取白色菌落，继续在含有X_gal和IPTG三抗平板(含卡那霉素50 μ g/ml,四环素10 μ g/ml，庆大霉素7 μ g/ml)上画线两次，挑取白色菌落，获得含重组Bacmid克隆。[0093]双表达盒重组Bacmid制备将纯化的重组转移质粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/ HANAMl 共转化 DHlOMultibacte，按照 Multibac Expression System 说明书操作。具体地， 取 2-4 μ g 重组质粒 pHANAMl 和 2-4 μ g pUCDM/HANAMl 加入 100 μ IDHlOMultibaccre 感受态细胞中，轻轻混勻，冰浴30min ；42°C，热激45sec ；冰浴aiiin ；加入二抗LB培养基(含卡那霉素 50μ g/ml，四环素 10μ g/ml)，37°C，200rpm 培养 4h ；将转化 DHlO Multibacte 培养菌液10倍梯度稀释，每梯度取200μ 1涂布含有X-gal(100yg/ml)和IPTG (40 μ g/ml)的四抗平板上(卡那霉素50 μ g/ml，四环素10 μ g/ml，庆大霉素7 μ g/ml，氯霉素25 μ g/ml)，37°C 静置培养36-4他。挑取白色菌落，继续在含有X-gal和IPTG的四抗平板上画线两次，挑取白色菌落，获得含重组Bacmid的克隆。
3)重组 Bacmid(rbacmid)提取
经抗性和蓝白斑筛选获得纯rbacmid菌落，挑取纯培养工程菌落，接种5ml液体LB，37°C培养；14000g离心lmin，收集菌体；弃去上清，沉淀用0. 3ml溶液I，重悬；力口入0. 3ml溶液II，轻轻混勻，室温静置5min ；慢慢加入0. 3ml 3M乙酸钾，混勻，冰上静置 5min ； 14000g,离心IOmin ；将上清转移到新的离心管，再加入0. 8ml异丙醇，混勻，冰上放置 IOmin ；4°C，14000g离心15min ；用70%的乙醇洗两次，室温放置让乙醇挥发；TE(pH7. 4)溶解，_20°C保存备用。获得穿梭质粒rbacmid/HANAMl。
4)rbacmid 鉴定
由于rbacmid基因组大，不能直接进行酶切鉴定，采用引物特异性PCR扩增和产物测序加以验证。按步骤5. 3)提取重组bacmid作为模板，用引物P1(SEQID NO. 1)与P2 (SEQ ID N0.2)、P3(SEQ ID NO. 3)与 P4(SEQ ID N0.4)、P5(SEQ IDNO. 5)与 P6 (SEQ ID NO. 6)分别进行PCR，扩增出HA、NA和Ml基因，琼脂糖凝胶电泳分离，DNA试剂盒纯化各种PCR产物， 测序验证正确的克隆用于拯救重组杆状病毒。
6.重组杆状病毒的拯救
1) Sf9昆虫细胞培养
采用贴壁方式培养Sf9细胞拯救重组杆状病毒。从液氮罐取出1支Sf9种子细胞， 37°C水浴快速解冻，转移细胞悬液至15ml无菌离心管，加入27°C预温的Grace' s培养液 (含10%胎牛血清)中，轻轻混勻，IOOOrpm离心5min，弃上清，细胞用10ml Grace' s培养液(含10%胎牛血清)悬浮，接种到T25细胞培养瓶，置27°C静置培养4-6天至细胞单层形成。
2)重组杆状病毒的产生
采用Lipofectamine2000 (invitrogen 公司产品)将穿梭质粒 rbacmid/HANAMl 转染至Sf9细胞，拯救重组杆状病毒。转染过程参照产品说明书进行，具体步骤如下取生长状态良好的Sf9细胞，用0. 25%的胰酶消化，按每孔2-4 X IO5个细胞的浓度铺于6孔板(6 孔板，Corning公司产品)，待细胞80%-90%密度单层；用96 μ 1 Grace' s (无血清)稀释 4 μ g 重组 bacmid DNA,轻轻混勾；取 8 μ ILipofectamine 力口入 92 μ 1 Grace ‘ s (无血清)， 轻轻混勻；静置15min，将重组质粒混合物缓慢加入到脂质体混合物中，轻轻混勻，27°C，孵育30min ；期间用无血清Grace' s培养液洗涤细胞，向细胞孔内加入800 μ 1 Grace‘ s (无血清)；将脂质体-质粒混合物滴加到细胞孔中，轻轻混勻，27°C，培养箱孵育他后，吸去转染混合物，换用含2 %胎牛血清的Grace ‘ s培养基，继续培养4_6天，将细胞冻融1次，4°C 500g离心lOmin，收集细胞培养上清，获得表达禽流感HA、NA和Ml蛋白的重组杆状病
ο
3)重组杆状病毒的克隆纯化
采用有限稀释法纯化杆状病毒。具体方法如下在96孔板中，按5X IO5细胞/ml 的量铺板50 μ 1，他；待细胞贴壁后，吸弃培养基，用PBS洗两遍；将病毒液加入Grace ‘ s 培养基(无血清)至100 μ 1稀释到10_7，吸取1μ 1病毒液加入到细胞孔中，Ih ；弃去培养基，加Grace' s培养基胎牛血清)100 μ 1，27°C孵育72h ；挑取一孔中仅有一个细胞被感染的单个细胞；按5 X IO5细胞/ml的量铺板50 μ 1于96孔板中，将前面挑取的单个感染细胞放入该96孔板细胞孔中培养，27°C孵育72h，收取上清；按5X IO5细胞/ml的量铺板200 μ 1，上一步骤收取的上清转移到M孔细胞板中，扩大培养，直至得到滴度较高的重组杆状病毒。此时得到的病毒再按上述步骤操作一次，即可得到纯化的重组杆状病毒。
7.重组杆状病毒的鉴定
1) PCR鉴定重组杆状病毒
按基因组DNA提取试剂盒说明书(Solarbio，Beingjing Solarbio 2008)提取重组杆状病毒基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳，检测制备的DNA完整性和浓度。以所制备的 DNA 为模板，用引物 Pl (SEQ ID NO. 1)与 P2 (SEQ ID NO. 2)、P3 (SEQ IDN0. 3)与 P4(SEQ ID NO. 4)、P5(SEQ ID NO. 5)与 P6 (SEQ ID NO. 6)分别进行 PCR，扩增出 HA、NA 和 Ml 基因，测序验证。
2)间接免疫荧光染色检测重组杆状病毒感染Sf9细胞中目的蛋白表达
取生长状态良好的Sf9细胞单层，用0.25%胰酶消化，用Grace' s培养液 (8-10%胎牛血清)制成IX IO5细胞悬液，接种于6孔板(lml/孔)，27°C静置培养48h。 取200 μ 1重组杆状病毒液，用6ml无血清Grace ‘ s稀释，加入生长Sf9细胞的6孔板中(0.5ml/孔)，不加病毒稀释液的孔为阴性对照；27°C静置lh。吸弃病毒液，换成含2% 胎牛血清Grace' s培养液，27 °C继续培养48h。弃去培养液，PBS洗涤细胞1次；加入 200μ 1-20°C预冷丙酮/甲醇混合液(1 1，vol/vol)，室温固定IOmin ；吸弃丙酮/甲醇混合液，PBST洗涤细胞2次，5min/次；加入稀释的抗-HA或抗-NA多克隆抗体(1 800稀释)QOO μ 1/孔)，37°C作用Ih ；吸弃抗体混合液，PBST洗涤3次，5min/次；加入FITC标记的羊抗兔IgG(l 200) (31460,Pierce公司产品)，37°C避光作用Ih ；吸弃标记抗体混合液，PBST洗涤3次，5min/次；在荧光显微镜下观察实验结果。
结果显示，感染重组杆状病毒的Sf9细胞中能表达H5m禽流感病毒HA和NA蛋白。
3) Western Blotting重组杆状病毒感染Sf9细胞中HA、NA和Ml蛋白质表达
用抗-HA、抗-NA、抗-Ml多克隆抗体或三者的混合组分为一抗，Westernblotting 分析相应蛋白表达。具体步骤包括
(1)样品处理重组杆状病毒感染Sf9细胞(T75细胞培养瓶)7 后，收获细胞培养上清和细胞，上清液真空冻干，加入200 μ 1 PBS重悬。细胞用细胞刮收集，200 μ 1 PBS重悬细胞。取200 μ 1细胞重悬液和上清液(冻干粉重悬液体积)，分别加入等体积样品缓冲液 (Loading buffer)混勻，水浴锅煮沸5分钟，冷却备用。
(2)蛋白质组分SDS-PAGE电泳分离采用5%浓缩胶、10%分离胶进行电泳。具体按《分子克隆，实验手册》进行。为便于比较，电泳加样时使用相同体积的各样品。[0115](3)转膜与抗体反应待电泳结束，取出凝胶并用清水洗涤。同时用转膜缓冲液浸泡硝酸纤维膜(NC)和滤纸5min，按阴极-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-阳极顺序铺设凝胶和NC膜，放入电泳槽，88V电压低温条件下电泳池。取出NC膜用1 X PBST (% Tween-20的PBS)洗涤5min，加入含5%脱脂奶粉的PBST封闭缓冲液(blocking buffer)， 37°C孵育池。PBST洗涤NC膜3次，每次lOmin。加入兔抗HA、抗NA和Ml多克隆抗体混合物(1 500PBST稀释)，37°C孵育2h。PBST充分洗涤NC膜3-5次，每次lOmin。加入HRP 标记羊抗兔IgG抗体(31460，Pierce公司产品，PBST 1 3000稀释)，37°C孵育lh, PBST 充分洗涤NC膜3-5次，每次lOmin。加入DAB显色液(具体配方见《分子克隆，实验手册》)， 室温避光显色5-lOmin，清水洗NC膜观察记录结果。
结果显示，本发明制备的重组杆状病毒能同时表达HA、NA和Ml蛋白(图3)
8.重组杆状病毒增殖和滴度测定
1)重组杆状病毒的增殖
取0. Iml经克隆化的重组杆状病毒液稀释至5ml (含8-10 %胎牛血清的 Grace' s)，接种70-80%的Sf9细胞单层上(T25瓶)，轻轻混勻，27°C静置培养48_72h，冻融细胞1次，细胞裂解液转移至15ml离心管中，4°C，500g离心lOmin，收获上清液，记录重组病毒代次，-70°C或液氮中冻存备用。
2)病毒滴度测定
取生长良好的Sf9细胞，0.25%胰酶消化，加入Grace' s培养液悬浮细胞，使浓度稀释至5X IO5细胞/ml，按Iml/孔接种6孔板，27°C，静置培养48_72h。
待Sf9细胞长至70-80%单层，用无血清无抗生素的Grace' s培养基轻轻冲洗细胞，取重组病毒原液用无血清无抗生素的Grace ‘ s培养基10倍梯度稀释，加入到Sf9细胞单层上(lml/孔)，每个稀释度做2个平行孔；27°C，静置吸附Ih ；吸弃病毒液，换成含甲基纤维素的Grace' s培养基(8_10%胎牛血清)，27°C，静置培养4_6天，观察空斑形成。
每个细胞孔用200 μ 1福尔马林固定30min，加入的结晶紫(5(^1/孔)，室温染色lh，清水轻轻冲洗后，再加入中性红复染30min ；冲洗、晾干后计数空斑；计算病毒效价 pfu/mlο
3)重组杆状病毒基因组遗传稳定性测定
重组杆状病毒按MOI = 3接种70-80%单层Sf9细胞，27°C，静置培养4-6天，收获病毒液；按相同方法连续传代20代次以上，收获各代次病毒液，分装，冻存-70°C或液氮中， 备用。
分别取第5代、第10代、第15代和第20代的病毒液，提取病毒基因组，按基因组 DNA提取试剂盒说明书(Solarbio，Beingjing Solarbio 2008)进行，采用特异性引物PCR 扩增HA、NA基因片段，测序分析两个基因的核苷酸序列。
结果显示，重组杆状病毒在Sf9细胞上连续传代20代次，抗原蛋白编码基因HA和 NA未发生突变。
实施例2H5m禽流感病毒病毒样颗粒(VLPs)疫苗的规模化制备及检定
1. Sf9昆虫细胞培养条件优化与规模化细胞悬浮培养
1)重组杆状病毒最佳接种浓度优化
取生长状态良好的Sf9细胞，0. 25%胰酶消化，接种到6孔板中，细胞形成约80%单层，分别以MOI = 0. 01、0. 1、1、3、5和10几种不同稀释度接种第三代重组杆状病毒，吸附 Ih后，更换新鲜Grace' s培养液胎牛血清)，于27°C静置培养，分别于接种病毒后2、 3、4、5、6和7天各收获病毒液。
按步骤8. 2的方法测定各MOI感染剂量在不同增殖时间后的病毒滴定，确定重组杆状病毒的最佳感染剂量和增殖培养时间。
结果表明，在Sf9细胞中，重组杆状病毒最佳接种浓度为MOI = 3或MOI = 5;接种病毒72-120h后获得最高病毒滴度。
2)细胞初始接种密度确定
取生长状态良好的Sf9细胞，用0.25%胰酶消化，用Grace' s (8_10%胎牛血清) 配制成5 X 105/ml细胞悬液，按IOml/瓶接种在T75细胞培养瓶，每批接种10-20瓶，27°C 静置培养4-6天，待细胞长满单层，吸弃Grace ‘ s培养液，用0. 25 %胰酶消化后，加入新鲜 Grace' s培养液(含8-10%胎牛血清)悬浮细胞；
取0. Iml细胞悬液，用PBS (pH7. 4)稀释至lml，加入等体积4%台盼蓝染色液，室温染色5-lOmin，轻轻混勻，滴注细胞计数板中显微镜下计数细胞密度。
按2-4X IO5细胞/ml的密度，将Sf9细胞接种到转瓶中，根据细胞总数加入200-1000ml培养基和终浓度10U/ml的肝素钠(商品肝素钠粉剂的活性单位 150-190U/lmg)，27°C，28rpm悬浮培养细胞。每日无菌条件下吸取Iml悬浮培养液，加入等体积4%台盼蓝染色液染色5-lOmin，显微镜下计数，计算细胞密度和存活率。结果显示， Sf9细胞悬浮培养42-%h密度达2X IO6细胞/ml、细胞存活率在90%以上，此时进行重组病毒接种。
2.病毒样颗粒的纯化
1)待悬浮细胞扩增至浓度约为2X106细胞/ml、细胞存活率在90%以上时，按MOI =3的剂量接种重组杆状病毒rBV-HANAMl，于27°C，28rpm继续悬浮培养72h。
2)收取接种了重组杆状病毒的Sf9细胞培养物，转移至50_250ml离心管中进行差速离心，即:4°C, IOOg 离心 5min, 500g 离心 5min, IOOOg 离心 5min, 1500g 离心 5min, 2000g 离心lOmin，最后4000g离心30min，收取上清。
3)取50_250ml Beckman离心管(离心管大小视样品量选取)2-6只，离心管底部铺30%蔗糖溶液10ml，将步骤2. 2)制备的培养上清液缓缓加入到离心管蔗糖层上，4°C， 40，OOOg，离心3-4h ；弃去上清液，用l_2ml预冷的无菌PBS重悬沉淀物。
4)取10_50ml Beckman离心管2_6只，向离心管底部加入浓度梯度20% -60% 蔗糖溶液，每个蔗糖梯度溶液加3-細1，用Iml注射器吸取各蔗糖梯度溶液，深入离心管底部，由低浓度加到高浓度，将步骤2. 3)制备的样品混合物小心加入到蔗糖溶液顶层，4°C， 100, 000g，离心12-14h ；用注射器分别收集各蔗糖层样品，采用Western blot、血凝试验分别检测样品中HA、NA、Ml蛋白表达和VLPs血凝活性；采用磷钨酸溶液染色，电镜观察VLPs 结构。
3.病毒样颗粒的检定
Dffestern blot检测SF9细胞系中病毒蛋白(HA，NA和Ml)的表达方法同实施例 1步骤7. 4。
2)血凝活性测定[0146]取96孔V型血凝板，向第二列至第十二列孔加入生理盐水(5(^1/孔)，在第一孔内加入50 μ 1纯化的VLPs样品液，在第二列孔内加入50 μ 1纯化的VLPs样品液，混合数次，吸出50μ 1加入至第三列孔，混勻，依次系列倍比稀释至第十一列，混勻后弃去50μ 1混合液，第十二列孔作为阴性对照。每孔加入50μ 1 的鸡红细胞悬液，轻轻混勻，室温静置 10-30min，至阴性对照孔红细胞完全沉淀时开始观察结果。
以测定管出现红细胞完全凝集的抗原最高稀释倍数作为该样品的凝集效价。结果显示，经蔗糖梯度离心分离纯化的H5W禽流感VUs血凝效价为1 32-1 64。
3)病毒样颗粒的电子显微镜检测
取纯化的VLPs样品液1-2滴，滴加在铜网支持膜上，作用Imin后用滤纸沿铜网边缘吸干，向样品铜网上滴加1-2滴2%磷钨酸染色液(蒸馏水配制，pH 6. 8)，室温染色 lmin，滤纸沿铜网边缘吸干，将制备好的负染色样品置透射电子显微镜下观测，记录结果。
电镜观察结果显示，本发明描述技术获得的H5m禽流感病毒VUs呈典型的流感病毒颗粒结构(图4B、4C)。
^MM 3H5N1禽、流感病毒病毒样颗粒(VLPs)疮苗的功能检测丨
为了评价H5W禽流感病毒VLPs疫苗的安全性和免疫效力，本发明采用BALB/c小鼠为动物模型。
1. H5N1禽流感病毒VLPs疫苗安全性评价
取5-6周龄健康雌性BALB/c小鼠20只，随机分成2组，每组10只，A组小鼠肌肉注射H5m禽流感病毒VLPs疫苗(剂量每只小鼠10 μ g/100 μ 1)，B组小鼠肌肉注射100 μ 1 无菌PBS作为阴性对照。
小鼠注射后观察21天，测量体重变化，分别于5、7、9、14和21天，尾部采血，计数
白细胞数量。
结果显示，VLPs接种组和PBS对照组小鼠体重变化和各采血时间点白细胞数量无
显著差异。
2. H5W禽流感病毒VLPs疫苗效力评价
1) VLPs疫苗小鼠免疫接种
取5-6周龄健康雌性BALB/c小鼠45只，随机分成3组(A、B、C组)，每组15只， 疫苗接种前小鼠断尾采血，分离血清用于抗体检测。a、B组为实验组，分别用本发明所描述 H5N1VLPS疫苗采用后腿肌内注射方法免疫接种，剂量为10 μ g/100 μ 1的VLPs (总蛋白含量)；C组小鼠肌肉注射ΙΟΟμΙ PBS作为阴性对照。每组小鼠免疫三次，间隔14天。
第三次免疫后第7天，每组选取5只，断尾取血以分离血清备用。 2) VLPs疫苗小鼠体液免疫应答检测
(1)间接ELISA法测定小鼠血清中HA抗体效价。具体步骤包括
包被用被缓冲液(0. 05Μ PH 9. 6的碳酸盐缓冲液)将重组HA蛋白(本实验室制备保存)稀释至5yg/ml，包被96孔ELISA酶标板(Corning公司产品，下同)每孔100 μ 1， 4°C包被过夜；
封闭将包被HA抗原的ELISA酶标板用PBS-T (PBS含0. 1 % Tween-20, pH 7. 5，下同)洗涤5次，每次5min ；加入100 μ 1封闭液(含3% BSA的PBST)，37°C封闭60min ；PBST 洗涤5次后。[0165]加待检血清小鼠血清用含BSA的PBST作1 100梯度稀释，将稀释血清加入ELISA酶标板各孔中(100 μ 1/每孔)，37°C孵育60min ；PBST洗涤5次。
加酶标二抗二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体(31432Pierce公司产品)，用含BSA的PBSIMtl 5000稀释，加入ELISA板各孔中(100 μ 1/每孔)，37°C作用60min ；PBST洗涤5次。
加入显示底物溶液向酶标板各孔中加入显色底溶液(含0. 045% H2O2，0. 4mg/ml o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD)的磷酸-柠檬酸盐缓冲液)，每孔 100 μ 1， 37°C避光显色15min ；每孔加入2M H2S0450 μ 1终止反应。
OD492值测定在酶标仪上波长492nm处测定每孔内光密度吸收值(0D㈣)
结果表明，本发明制备的VLPs疫苗免疫接种小鼠能诱导机体产生高水平特异性 HA抗体(图5A)。
(2)血凝抑制实验测定免疫接种小鼠血清中和抗体效价
将待检血清与受体破坏酶(RDE)按1 4比例混合，37°C作用14h，再56°C作用Ih 以灭活RDE ；将处理好的待检血清用生理盐水做系列倍比稀释，加入到血凝板各孔中，每孔 25 μ 1 ；然后向每孔加入25 μ 1含有8个血凝单位的灭活A/VietNam/1194R(H5Nl)病毒液， 混勻，室温静置30min，向每孔加入50 μ 1 1 %鸡红细胞悬液，混勻，室温静置30-60min，观察实验结果。血凝效价定义为能够100%抑制红细胞凝集的血清稀释度。
结果表明，本发明制备的VLPs疫苗免疫接种小鼠能有效诱导机体产生H5W禽流感病毒中和抗体(图5B)。
3) VLPs疫苗接种小鼠抗H5W禽流感病毒攻击感染的免疫保护
(1)疫苗接种诱导机体抗H5W同源强毒株致死攻击感染的保护效力
VLPs疫苗第三次加强免疫后第14天，称量小鼠体重，然后用乙醚麻醉小鼠，滴鼻接种A/Viet Nam/1194R(H5N1)病毒液50 μ 1 (IOLD5tl)；攻毒后每天观察记录小鼠发病和存活情况，每天称量小鼠体重，观察至攻毒感染后第14天，计算体重变化。
实验结果显示，注射PBS阴性对照组小鼠体重从攻毒后第2天开始降低，持续直至所有小鼠死亡；VLPs免疫组小鼠的体重从攻毒感染后第4天开始降低，第6天体重开始恢复，第10天体重恢复到初始水平；观察至攻毒感染后第14天所有小鼠存活(图6Α、6Β)。表明VLPs免疫接种能够诱导小鼠抵抗同源H5W禽流感病毒攻击的免疫保护。
(2)疫苗接种诱导机体抗H5W异源毒株攻击感染的保护效力
VLPs疫苗第三次加强免疫后第14天，称量小鼠体重，用乙醚麻醉小鼠，滴鼻接种 A/Hubei/489(H5N1)病毒液50 μ 1 (IO3EID5tl)。攻毒感染后第6天，取5只小鼠，断颈处死，无菌取出全肺，加入Iml PBS研磨勻浆，3000rpm离心lOmin，收集上清液，接种9-10日龄SPF 鸡胚，观察记录鸡胚死亡数，采用Reed-Muench法计算病毒效价。另取5只小鼠，断颈处死， 取全肺置于10%福尔马林固定lOmin，石蜡包埋、切片，HE染色分析肺组织病理变化。
结果显示，VLPs疫苗免疫组小鼠肺组织病毒效价为2. 07士0. 811gEID50/肺，接种 PBS阴性对照组小鼠肺组织病毒效价为6. 9士0. 681gEID50/肺(图7A)；与对照组小鼠相比，VLPs疫苗免疫组小鼠肺组织显示更轻微的病理损伤(图7D)，表明VLPs疫苗接种能诱导机体抵抗H5W禽流感病毒攻击感染的免疫保护，抑制病毒在小鼠肺组织内复制和加速病毒清除。
权利要求
1.一种H5m禽流感病毒样颗粒疫苗的规模化制备方法，其特征在于依次包括如下步骤1)重组质粒rbacmid/HANAMl的构建和提取；所述的重组质粒rbacmid/HANAMl的构建包括重组质粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/HANAMl的构建及其在宿主菌DHlOMultibactte中重组，其中pFBDM/HANAMl是将H5m禽流感病毒HA、NA和Ml基因克隆到pFBDM 载体中制备， pUCDM/HANAMl是将H5m禽流感病毒HA、NA和Ml基因克隆到pUCDM载体中制备；2)将重组质粒rbacmid/HANAMl转染Sf9昆虫细胞拯救重组杆状病毒，在Sf9细胞内装配病毒样颗粒；3)规模化Sf9细胞培养、重组病毒感染和病毒样颗粒的纯化。
2.如权利要求
1所述的H5W禽流感病毒样颗粒疫苗的规模化制备方法，其特征在于 步骤3中所述的病毒样颗粒的纯化采用离心分离技术。
3.如权利要求
1所述的H5W禽流感病毒样颗粒疫苗的规模化制备方法，其特征在于 在Sf9细胞培养中，接种浓度为MOI = 3或MOI = 5。
4.如权利要求
1所述的H5W禽流感病毒样颗粒疫苗的规模化制备方法，其特征在于 在Sf9细胞培养中，增殖培养时间为72-120h。
5.如权利要求
1所述的H5W禽流感病毒样颗粒疫苗的规模化制备方法，其特征在于 在Sf9细胞培养中，细胞初始接种密度为2 X IO6细胞/ml。
专利摘要
本发明提供了一种新型H5N1禽流感病毒样颗粒疫苗的规模化制备方法。依次包括如下步骤1)重组质粒rbacmid/HANAM1的构建和提取；2)将重组质粒rbacmid/HANAM1转染Sf9昆虫细胞拯救重组杆状病毒，在Sf9细胞内装配病毒样颗粒；3)规模化Sf9细胞培养、重组病毒感染和病毒样颗粒的纯化。该方法适用于大规模制备人用抗高致病性H5N1禽流感VLPs疫苗，安全高效，具有良好的开发和应用前景。
文档编号C12N7/01GKCN101947317 B发布类型授权 专利申请号CN 201010293705
公开日2012年5月30日 申请日期2010年9月27日
发明者朱丹丹, 潘兹书, 璩骁, 陶攀 申请人:武汉大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),