专利名称：稳定化的人体蛋白制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定的、非免疫原性的、生理上易于相容的、溶解或冻干的人体蛋白、特别是促红细胞生成素的盖伦制剂(galenicalpreparations)及其制备方法。
人体蛋白是人体特有的蛋白质。它仅以少量存在，例如组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(tpA)、链激酶、尿激酶、干扰素、各种集落刺激因子(CSF)和促红细胞生成素(EPO)。本发明将以优选用于这些制剂的EPO为例进行更详细的说明。
促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白，它刺激骨髓中血红蛋白或红细胞的形成。该脂蛋白主要在肾中形成，而见于血清中的量很小。在生理条件下，部分在尿中排泄。
在肾机能不全的情况下，EPO的缺乏还将导致肾贫血。这种情况下一次或多次使用生理量的EPO，即几个微克的EPO，可重新刺激红细胞的形成。由于人体已经对微小的剂量变化反应很敏感，因此，用药必须是严格可重复的。EPO通常以水溶液的形式肌肉注射或静脉注射或通过鼻粘膜喷雾给药。
但是，已知EPO在水溶液中不稳定，不论是最初从人尿中得到的产品(Mijakeetal.，J.Biol.Chem.，25，5558-5564/1977)，还是同时利用基因技术生产的产品(WO85-02610)，即使在贮存在-80℃的情况下，也有较大部分活性丢失。这两种已知产品在糖化方式及活性上稍有不同，与血清中所含EPO的直接比较迄今还不明了。
这些活性的丢失一方面是由于EPO受到贮存它的安瓿表面的痕量重金属、大气中的氧气等的催化作用所破坏，另一方面是由于EPO分子在血管壁上沉积，而可能发生部分变性。如上所述，由于每个剂量单位只有几微克，因此甚至在短时间贮存后，由于吸附而造成的活性丧失也是不可忽视的。
因此，欧洲专利说明书第0，178，567号描述了通过加入大分子化合物如人或牛血清清蛋白、卵磷脂、葡聚糖、纤维素、聚乙二醇等来抑制EPO在血管壁上的沉积，这样，在20℃贮存约2小时后EPO活性回收75～98%，而不加大分子化合物时活性只回收16%。然而，这里仅测定了放射标记(14C)的回收，所以这些实验并不能说明EPO对分解的稳定性。
然而，根据我们的发现，用这样的试剂不能达到长期稳定化，即在小鼠实验中EPO的效力大大降低，而且注射这些试剂时可引起免疫原性反应。
此外，从欧洲专利说明书第0，178，665号可了解到某些特别适用于冻干的EPO制剂的已知“稳定剂”。除了聚合物聚乙二醇4000、明胶、葡聚糖40，其中还提到各种糖及糖醇、氨基酸、无机盐及硫醇化合物。也提到可将这些物质与人血清清蛋白、明胶和葡聚糖结合在一起使用。该参考文献中只测定了冻干产品经两个月贮存后放射性的回收量。其回收活性为87-99%，不加任何物质时为60%。由于冻干制剂在制备后直接用作标准品，所以未说明在生产制剂的情况下，有多高的活性丧失。在小鼠试验中也显示这些制剂的效力丧失很高。
因此，问题是要找到一种易于相容的、可稳定贮存的EPO制剂，即，要保证体内效力，又不能吸附于安瓿和注射器壁上，而且能方便地配成注射剂。
据此，本发明提供了一个可相容的、贮存稳定的人体蛋白制剂，该制剂含有一种人体蛋白、一种生理上易于相容的缓冲液，也可含有络合剂、等渗调节剂、氯化钙和其它常用的注射用物质，其中以注射剂形式存在时，每升含5-50g尿素、1-50g氨基酸、0.5-5g非离子型湿润剂。
我们的研究已表明个别物质不具有或只在很小的程度上具有这些优良特性。
产生稳定化作用的决定性条件是加入尿素和各种氨基酸。尿素的用量为5-50g/l，最好是10-15g/l。所用的氨基酸可以是甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸和L-苏氨酸。各种氨基酸的混合物似乎都有一种特别有利的作用。氨基酸的用量为0.5-50g/l，最好是1-20g/l，而总量最好是5-25g/l。
再者，一种生理上可相容的低浓度(约每升20-100mM)的缓冲液对于注射液是不可缺少的。它可将EPO溶液的pH值调到6.5-7.4，最好是7.0-7.2。除了磷酸缓冲液以外，还可使用甘氨酸、碳酸、柠檬酸等缓冲液，在这种情况下，除了钠离子以外，钾离子或氨离子也可用作平衡离子。这些氨基酸的存在，额外地产生一种缓冲作用。
加入少量的洗涤剂，可以大大降低EPO在安瓿或注射器壁上的粘附。由于该制剂主要用于注射，所以这些洗涤剂必须是生理上相容的，尤其是静脉内相容的。已证明适宜浓度为0.05-5g/l，尤其是0.1-0.5g/l。非离子型润湿剂如各种聚多醇(Polymacrogol)型润湿剂，特别是聚乙烯脱水山梨醇月桂酸酯(吐温20或80)和脱水山梨醇三油酸酯(Span 35或80)和油酸甘油聚醇醚(Labrafil )均适用于这一目的，但也可以同样方式应用其它相容物质。
为了减少重金属离子对EPO的影响(在配制过程中几乎不可避免地带入这类金属离子)，已进一步证明在该溶液中加入0.01-5g/l的可溶性钙盐也是有效的，最好是加入0.02-0.2g/l的氯化钙。还可使用其它生理上相容的络合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸、次氮基三乙酸和泛酸。
注射剂的溶剂可用纯水，为了产生等渗溶液，还可加入0.5-10g/l的氯化钠或相应的物质如甘露醇、山梨醇等。
为了生产本发明的制剂，将所有的助剂物质都溶于所需量的水中，混入活性最好为100，000-200，000单位/mg蛋白的EPO制剂，然后无菌过滤到适当的安瓿中，在低温下冷冻并小心冻干。所得制剂于0℃在氮气下可贮存2年，在室温下可贮存1年。再溶于水时，几秒钟即可溶解而不产生混浊，并能直接进行静脉或肌肉注射，亦可用等渗液如氯化钠水溶液稀释后输注。
冷冻步骤有其特殊的重要性。所选用的助剂物质在特性和数量上应使得所要冷冻的溶液的低共熔点在-50℃-30℃。借助于计算机控制的最优化程序，确定了冷冻干燥的三个阶段的最适条件冷冻时间-40℃下12-14小时。
主干燥盐水温度+10℃，压力10-1毫巴，时间48-60小时。
后干燥盐水温度+20℃，压力10-3毫巴，时间4-6小时。
因此，须借助△P测量装置及导电性测量手段确定何时结束主干燥，以使所要冻干的产品不至于被加热过快，从而避免冷冻溶液的熔化及由此产生的活性丧失。
这样，对所用助剂物质的选择须使欲冻干的材料能形成均一结构的冰体，冻干期间得到一多孔结构(饼)，这个结构可能最适于此冰体的升华，特别是在主干燥快结束时。如上所述，后干燥仅在+20℃下进行4-6小时。这一小心处理很重要，因为如若不然，所要冻干的物质就会丧失活性。
根据KarlFischer的检测，这样冻干的产品一般约有2-5%的含水量。这一残余水含量取决于制剂中所用的助剂物质的特性和数量。
亦可将稳定化的EPO的水溶液直接装入安瓿，并可以不冻干，制成可直接取用的形式。然而却因此而降低了贮存稳定性，相比之下，冻干品则可在0℃下贮存约一年，在室温下可贮存几个月。
以下实施例用于说明本发明。
实施例12000单位促红细胞生成素注射用干物质(一批35，000瓶)在一个配有搅拌装置的无菌的100升V2A双罩锅中溶解以下助剂物质尿素700.0g氯化钠70.0g
吐温207.0g一水合磷酸二氢钠38.4g二水合磷酸氢二钠350.0g二水合氯化钙8.4g甘氨酸105.0gL-亮氨酸140.0gL-异亮氨酸140.0gL-苏氨酸35.0gL-谷氨酸35.0gL-苯丙氨酸70.0g注射用水加至70.0l在30升此助剂溶液中加入214.3ml的EPO滴度为每毫升140，000单位的促红细胞生成素原液，然后使终体积达到35升并搅拌。用剩余的助剂溶液冲洗所用的过滤系统。这批溶液在0.2μm孔径的滤膜上无菌过滤。在无菌条件下将无菌过滤的溶液分装到1ml的注射瓶中，并按下述规则在冰冻干燥装置中冻干冷冻时间-40℃下12-14小时。
主干燥盐水温度+10℃，压力10-1毫巴，时间48-60小时。
后干燥盐水温度+20℃，压力10-3毫巴，时间4-6小时。
于是便得到一大体积的、开孔的注射用干物质，它在冰箱中至少可稳定贮存两年，在室温下可贮存一年，并可在几秒钟内溶于2毫升注射用水中，不混浊，无颗粒。
实施例2
200单位促红细胞生成素冻干物(一批35，000瓶)促红细胞生成素46.7ml(7百万单位)氯化钠100.0g吐温2010.0g一水合磷酸二氢钠155.0g二水合磷酸氢二钠500.0g二水合氯化钙10.0g尿素1000.0gL-亮氨酸150.0gL-苏氨酸120.0gL-苯丙氨酸165.0g注射用水加至70.0l将助剂物质溶于70升注射用水中，然后分成两份，每份35升。第一份同所需量的EPO活性物质混合，第二份用于冲洗所用的过滤系统。这批溶液在0.2μm孔径的滤膜上无菌过滤。在无菌条件下将无菌过滤的溶液分装到1ml注射瓶内并按和实施例1同样的原则冻干，从而得到白色、多孔的冻干物，它可很容易地溶解于2ml水中，并可在冰箱中贮存二年或在室温下贮存一年而没有明显的活性丧失。
实施例31000单位促红细胞生成素冻干物(一批35，000瓶)促红细胞生成素233.33ml
(35百万单位)氯化钠100.0g吐温2012.0g一水合磷酸二氢钾140.0g二水合磷酸氢二钾450.0g二水合氯化钙10.0g尿素700.0g甘氨酸1050.0gL-亮氨酸92.0gL-谷氨酸103.0gL-苯丙氨酸115.5g注射用水加至70.0l将助剂物质溶于70升注射用水中，然后分成两份，每份35升。第一份同所需量的EPO活性物质混合，第二份用于冲洗所用的过滤系统。在孔径为0.2μm的滤膜上无菌过滤该批溶液。在无菌条件下将无菌过滤的溶液分装到1ml注射瓶中，并按和实施例1同样的原则冻干。于是得到白色、多孔的冻干物，它可很容易地溶于2ml水中，并可在冰箱中贮存二年或在室温下贮存一年而无明显的活性丧失。
实施例4500单位促红细胞生成素冻干物(一批35，000瓶)促红细胞生成素116.67ml(17.5百万单位)氯化钠70.0g
吐温207.0g单水合磷酸二氢钠38.5g二水合磷酸氢二钠490.0g二水合氯化钙5.6g尿素840.0gL-亮氨酸92.4gL-谷氨酸105.0gL-苯丙氨酸119.0g注射用水加至70.0l将助剂物质溶于70升注射用水中，然后分成两份，每份35升。第一份同所需量的EPO活性物质混合，第二份用于冲洗所用的过滤系统。在孔径为0.2μm的滤膜上无菌过滤该批溶液。在无菌条件下将无菌过滤的溶液分装到1ml注射瓶中，并按与实施例1相同的原则冻干，从而得到白色、多孔的冻干物，它可很容易地溶解于2ml水中，并可在冰箱中贮存二年或在室温下贮存一年而无明显的活性丧失。
实施例5750单位促红细胞生成素冻干物(一批35，000瓶)促红细胞生成素175.0ml(26.25百万单位)氯化钠100.0g吐温2012.0g一水合磷酸二氢钠140.0g二水合磷酸氢二钠450.0g
二水合氯化钙10.0g甘氨酸1250.0gL-异亮氨酸98.0gL-谷氨酸130.0gL-苯丙氨酸145.0g注射用水加至70.0l将助剂物质溶于70升注射用水中，然后分成两份，每份35升。第一份同所需量的EPO活性物质混合，第二份用于冲洗所用的过滤系统。在孔径为0.2μm的滤膜上无菌过滤该批溶液。在无菌条件下将无菌过滤的溶液分装到1ml注射瓶内，并按与实施例1相同的原则冻干，从而得到白色、多孔的冻干物，它可很容易地溶解于2ml水中，并可在冰箱中贮存二年或在室温下贮存一年而无明显的活性丧失。
实施例6为了测试各种稳定剂的效力，将以尿素为主要稳定剂、每毫升含1000单位EPO的标准制剂与聚乙烯吡咯烷酮/蛋白或不同的氨基酸混合并冻干该产品。下列表1概括了所得结果。
将冻干品在35℃或0℃下贮存6周后，按G.Krystal(Exp.Hematol.，11，649-660，1983)的小鼠脾脏试验法检测EPO的稳定性如下连续两天对体重约20g的B6C3F1雌性小鼠(Zentralinstitut für Versuchstierkunde，Hannover)注射60mg/Kg的盐酸苯肼。再过三天后，切除脾脏，将脾细胞悬浮于无菌的完全培养基(Dulbecco Modified Eagle′s Medium+584.0mg/lL-谷氨酸+0.1m Mole/l2-巯基乙醇+20%胎牛血清)中，并稀释到4×106个有核细胞/毫升。将悬浮液分置到微量滴定板上(0.2ml/孔)，该悬浮液中事先已加入适当浓度的溶于BSA缓冲液的测试物或EPO标准品。保温后(22小时，37℃，空气+15%CO2)，加入20μl 1μCi/小孔的3H-甲基胸苷溶液，于37℃下再保温2小时。然后，借助细胞收集器将内容物移出并用蒸馏水洗涤。用β-闪烁计数器测定3H-胸苷的掺入量并参照标准制剂进行评价。
使用了“P009-EPO”标准品(GeneticsInstitute，Cambridge，Massachusetts，USA)作为工作标准品，它含有112单位EPO/ml和503ng蛋白/ml，与WHO的EPO参照标准(“InternationalReferencePreparationofErythropoietin，Human，UrinaryforBioassay(2ndI.R.P.，1971年发表)”)相一致。该标准品浓度范围为10-100毫单位/ml。
先将欲测定EPO活性的冻干品溶于每个安瓿中的2ml注射用水中，然后如工作标准品一样用BSA缓冲液(8.75g氯化钠/1.95g二水合氯化钙，1.00gBSA(Calbiochem公司的牛血清清蛋白)，注射用水加至1升)进一步稀释。3H-甲基胸苷(比活性2Ci/mmole)购自New England Nuclear公司。
实施例7按与实施例6同样的方法，将稍加改变的原始制剂与尿素及各种氨基酸或其混合物混合。作为对照，还检测了两种含甘露醇的制剂，它们相当于欧洲专利说明书0，178，665号所述的制剂。所得结果概括于下列表2。
表 1
<p>
权利要求
1.生产一种可相容的、贮存稳定的人体蛋白制剂的方法，该制剂含有一种人体蛋白、一种生理上可相容的缓冲液，也可含有络合剂、等渗调节剂、氯化钙及其它常用的注射用物质，其特征在于，先制备每升含5-50mg尿素、1-50g氨基酸及0.05-5g非离子型润湿剂的溶液，然后向该溶液中加入常规助剂物质，再混入人体蛋白。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中的氨基酸是含有甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸和/或L-苏氨酸的混合物。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，其中用聚乙烯脱水山梨糖醇月桂酸酯作润湿剂。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，制剂是以冻干形式生产的。
5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于，制剂是以可注射的液体形式生产的。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，每一注射剂量单位为1-5ml，各含有100-1百万单位的人体蛋白。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，其中的人体蛋白是促红细胞生成素。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，每个注射剂量单位为1-5ml，各含有100-20，000单位的促红细胞生成素。
9.根据权利要求7的方法，其特征在于，首先将所有助剂物质溶于水中，然后向其中加入促红细胞生成素，将该混合物无菌过滤到安瓿中，并在-20℃以下小心冻干。
10.根据权利要求7的方法，其特征在于，首先将所有助剂物质溶于水中，然后向其中加入促红细胞生成素，将该混合物分装到安瓿内。
11.根据权利要求1制备一种可相容的、贮存稳定的人体蛋白制剂的方法，基本上如上文所描述并举例说明的。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法制备的可相容的、贮存稳定的人体蛋白制剂。
全文摘要
提供了一种制备可相容的、贮存稳定的人体蛋白制剂的方法，该制剂含有一种人体蛋白、一种生理上可相容的缓冲液，也可含有络合剂、等渗调节剂、氯化钙及其它用于注射的物质，该方法中，首先制备每升含5—50mg尿素、1—50g氨基酸及0.05—5g非离子型润湿剂的溶液，向该溶液中加入常规助剂物质，然后混入人体蛋白。
文档编号A61K38/00GK1031801SQ8810646
公开日1989年3月22日 申请日期1988年9月5日 优先权日1987年9月5日
发明者海因里希·伍格, 沃纳·格鲁伯, 汉斯-于尔格·马克尔, 弗里茨·戴马 申请人:曼海姆泊灵格股份公司