专利名称：超活性的生长激素释放因子类似物的制作方法
生长激素是一种对有机体的发育有广泛影响的，由动物的垂体分泌的分泌蛋白质。已经证明人工控制的生长激素水平有着显著的治疗学效用。已经表明补充人生长激素对于治疗人的生长激素缺乏和其相关疾病是有效的。除了这种应用，研究已经揭示出生长激素的新的重要特性，即进一步提供控制生长激素水平的能力。例如最近的临床研究表明，补充生长激素可有效地延缓人的衰老。已经表明升高动物体中的生长激素水平导致增加肌肉群。这种近期研究结果的应用表明，能够得到高产量的瘦肉产品或得到更大和/或更强的动物。
当生长激素由垂体自然产生时，由第二种蛋白，生长激素释放因子(GRF)控制生长激素向血液中分泌。这种激素也就是本领域专业人员熟知的体激泌素，生长激素释放激素(GHRH)，和生长释放激素(GRH)。因而有两种解决提高生长激素的循环水平这一问题的方法(1)直接增加人生长激素在有机体中的水平或(2)增进有机体产生生长激素的自然倾向。第二种方案通过补充GRF而实现目的，已经证明GRF可以提高生长激素在体内的循环水平。Rivier，等人(1982)Nature300276。已经广泛地研究了GRF(和其各种结构类似物)对生长激素生产的影响。直接补充GRF的第一障碍是其在体内的寿命短。Frohman，L.A.，等人(1986)J.Clin.Invest.78906。更有效和/或更长效的GRF分子对于发展有效的人类治疗药品或畜牧业试剂才是令人满意的。
用多种方法修饰GRF的结构以产生长效的和/或更有效的GRF类似物。已经证明，从N-末端起的前29个氨基酸足够保持整个GRF的活性。Speiss，等人，(1982)Biochemistry21，6037。一个对策是在GRF分子的各个区域掺入新的D-氨基酸残基。Lance，V.A.，等人.(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.119265;Coy，D.H.，等人(1986)Peptides8(suppl.1)，49.另一方案是通过在N-末端区掺入肽键isoteres，修饰GRF的主肽链。Tourwe，D.(1985)Janssen.Chim.Acta.3，3，Hocart，S.J.，等人，(1990)J.Med.Chem.33 1954-58。
本发明提供具有增加了有效性和具有能提供技术上优于以前报道的GRF类似物的其它特性的GRF类似物。本发明的化合物较佳的是兽医用，特别是用于牛、猪、羊，家禽和鱼。
为了说明本文所公开和要求的本发明的目的，现将下列术语定义如下。
Ala-丙氨酸，类似物-与另一种结构相似的一种化合物。当用于指多肽时，它涉及一级、二级或三级结构。
Arg-精氨酸Asn-天冬酰胺Asp-天冬氨酸碱基对(bp)-涉及DNA或RNA。当存在于DNA分子上时，缩写A，C，G和T分别对应(脱氧)腺嘌呤核苷酸，(脱氧)胞嘧啶核苷酸，(脱氧)鸟嘌呤核苷酸和(脱氧)胸腺嘧啶核苷酸的5′-单磷酸形式。当在RNA分子上时，缩写U，C，G和T分别对应尿嘧啶，胞嘧啶，鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的5′-单磷酸形式。在双链DNA中，碱基对是指A与T或C与G的对应关系。在DNA/RNA，这种异源双链核酸分子上，碱基对的对应关系是T与U或C与G。
Cys-半胱氨酸或通过二硫键与另外半个胱氨酸残基共价结合的半个胱氨酸残基。
DNA-脱氧核糖核酸EDTA-乙二胺四乙酸的缩写。
ED50-半数有效剂量的缩写。
功能类似物-是指与该分子或化合物的天然存在的结构形式相比具有相似的功能特性但其结构经过修饰的一种分子。一种功能类似物包括与亲代分子具有相似的功能特性和反应活性的亲代分子片段(或附加物)Gln-谷氨酰胺。
Glu-氨基酸谷氨酸Gly-甘氨酸GRF PEPTIDE-一种由27到76氨基酸残基组成的，能启动生长激素从垂体释放及合成的多肽。GRF PEPTIDEs包括公开在US Patent Nos.4，517，181，4，518，586，4，528，190，4，529，595，4，563，352，4，585，756，4，595，676，4，605，643，4，620，976，4，626，523，4，628，043和4，689，318中的天然的或合成的其功能类似物;全部学说作为对比文献引入。术语GRF PEPTIDE包括其非毒性盐。
His-组氨酸Hse-高丝氨酸Ile-异亮氨酸Leu-亮氨酸Lys-赖氨酸Met-甲硫氨酸或它的脱甲基化类似物mRNA-信使RNAMWCO-截止分子量的缩写Orn-鸟氨酸Phe-苯基丙氨酸质粒-一种染色体外自我复制的遗传因子PMSF-氟化苯甲基硫酰基的简写。
Pro-脯氨酸阅读框架-核苷酸序列，由转译机构tRNA和核糖体以及相关的因子以三联体密码形式进行阅读而转译该序列。每个三联体密码对应一个特定的氨基酸。由于每个三联体密码是分离的并且长度相同，因此，编码序列一定是3的倍数，一个碱基对的插入或缺失(叫做移码突变)可以导致由同样的DNA片段编码不同的两种蛋白质。为了防止这种情况，对应特定多肽的三联体一定是从起始密码开始就以3的倍数排列，即保持正确的“阅读框架”。
重组DNA克隆载体-任何自主复制因子，包括，但不限于，质粒和噬菌体，由能够或已经加上一个或多个其他DNA片段的一个DNA分子组成。
重组DNA表达载体-任何插入了启动子的重组DNA克隆载体。
复制子-控制并允许质粒或其它载体自主复制的DNA序列。
RNA-核糖核酸RP-HPLC-反相高效液体色谱法的简写。
Ser-丝氨酸Thr-苏氨酸转录-将包含在DNA序列中的信息转移到互补RNA序列的过程。
转译-将信使RNA中的遗传信息用于指定和指导多肽链合成的过程。
Tris-三羟甲基氨基甲烷的缩写。
Trp-色氨酸Tyr-酪氨酸Val-缬氨酸载体-一种在基因操作中用于细胞转化的复制子，该复制子携带与合适的蛋白质分子对应的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与适当的控制序列结合时，便使被转化的宿主细胞具有特定的性质。由于质粒、病毒、和噬菌体本身就是复制子，因此，它们都是合适的载体。使用限制酶和连接酶，通过切割和连接来源不同的DNA分子即可构建人工载体。本文中使用的“载体”这一术语包括重组DNA克隆载体和重组DNA表达载体。
附图中标明的限制位点和功能图谱是本文所述重组DNA载体的合适代表例。限制位点的资料是不完全的;因此，在载体上存在的给定类型的限制性位点数目比附图中标明的更多。
图1质粒PHS190的限制位点和功能图谱。
图2质粒PHS500的限制位点和功能图谱。
图3质粒PHS452的限制位点和功能图谱。
图4表明用对-甲基马尿酰PGRF(2-76)OH给药，在阉猪中的生长激素水平升高。
图5表示用对-甲基马尿酰PGRF(2-76)OH给药后对泌尿排泄的脲氮水平的影响本发明提供由下式代表的合成的GRF肽类似物(GRF PEPTIDES)X1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A12Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-LeuGln-A25-Ile-A27-A28-Arg-Y-Z-T其中A9＝Ser，Ala，Leu，Thr或AsnA12＝Arg或LysA15＝Gly，Ala，Thr或LeuA21＝Arg或LysA22＝Ala或LeuA25＝Asp或GluA27＝Met，Ser，Arg，Leu，或正亮氨酸，
A28＝Ser或Asn，Y＝0，或1到15个氨基酸的氨基酸序列，Z＝0或1到32个氨基酸的氨基酸序列，及T＝由分子式-COORa，-CRaO，-CONHNHRa，-CON(Ra)(Rb)或CH2ORa，表示的羧基末端基团，其中，Ra和Rb单独地是低级烷、氢，Hse(内酯)，HseOH或HseN(Rc)(Rd)其中，Rc和Rd单独地是氢或低级烷，X1是由分子式
代表的酰基，其中R1＝氢，甲基，乙基，羟乙基，苯基，或者取代的苯基，是由卤，低烷，低烷氧基，羟基、硝基，氨基取代的，乙酰氨基，三氟甲基，-CH2-OH或磺氨，或者一个含一个或多个N，O，或S的5或6员杂环，a＝0，1，2，或3，b＝0或1c＝0或1
d＝0到12A＝0，O或SB＝羰基、磺酰基和亚磺酰基;
R2＝H，CH3，CH2OH，对-羟苄基或
e＝0到5，R3＝甲基、乙基、羟乙基、氨基、羟基、苯基，或者用卤、烷基、烷氧基、羟基、硝基、氨基取代的苯基，乙酰氨基，或磺氨，或一个包含一个或多个N，O，或S的5或6员杂环取代，及其药物学上可接受的非毒性盐。
在式1的说明中，术语“低烷基”涉及如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，异丁基和叔-丁基这样的C1-C4烷基，“低烷氧基”涉及甲氧基，乙氧基，正-丙氧基，叔-丁氧基等等基团;“卤基”涉及氟、氯、溴、碘基团。“取代苯基”涉及苯基被一个或两个相同或不同的选自卤、低烷基、低烷氧基、羟基、硝基、氨基、乙酰氨基或亚磺酰氨基取代后的基团，这样的基团如4-氯苯基，3-碘苯基，2-氟苯基，4-甲基苯基，3-氯-4-甲基苯基，3-溴苯基，4-乙基苯基，3-乙氧基苯基，2-甲氧基苯基，4-异丙氧基苯基，4-羟苯基，3，4-二羟苯基，2，4-二羟苯基，4-硝基苯基，3-氨基苯基，3-氯-4-羟苯基，2-乙酰氨基苯基，4-亚磺酰氨基苯基，3，4-二甲氧基苯基，2-氟-4-氨苯基等;“含一个或多个N，O或S的5或6员杂环”涉及的5员杂环如吡咯，噻吩，呋喃，咪唑，噁唑，噁二唑，噻唑，1，3，4-噻二唑， asoxazole等等;6员杂环如吡啶，嘧吩，吡喃，二氢吡喃，噻嗪，噻喃，三嗪和类似的6员杂环。这种5-和6-员杂环可以带如低烷基、低烷氧基、羟基、氨基或卤这样的取代基团。
式1中X1代表的酰基的例子包括对-氯马尿酰基，对-甲基马尿酰基，对-硝基马尿酰基，马尿酰基，对-羟马尿酰基，3-苯甲酰基丙酰基，正-邻二甲酰甘氨酰基，N-苯基丙二酰胺基，对-甲基-N-苯基丙二酰胺基，或，对-氟马尿酰基。
正如上文提到的，本发明优选的化合物是动物GRF肽的衍生物和变型。
与式1化合物的氨基酸残基有关的“A20”，“A21”等符号，表示以天然形式及在文献中出现时，从蛋白质的氨基末端依次编号时相应的特定氨基酸号码。对已进行充分定性的蛋白质氨基酸残基进行这样的统一编码是本领域专业人员熟知的。符合“des-Tyrl-GRF”意味着天然GRF分子缺失N-末端的酪氨酸残基，这种表示方法对本领域专业人员也是广泛熟知的。给余下的氨基酸残基编码不是必要的，并且可能导致混乱。在上述例子中，显然，在自然产生的蛋白质中第二位上的氨基酸就是氨基末端残基，但它的符号是以例如Ala2表示。下面将列出不同种GRF的通用的氨基酸符号。
本发明优选的肽包括一种由式1代表的猪GRF(PGRF)变型体，其中A9＝Asn，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Leu，和A28＝Ser。
本发明另一优选的肽包括一种由式1代表的牛GRF(bGRF)的变型体，其中，A9＝Asn，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Leu，A28＝Asn。
本发明再一优选的肽包括一种由式1代表的人GRF(hGRF)的变型体，其中，A9＝Ser，A12＝Lys，A15＝Gly，A21＝Lys，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Met，和A28＝Ser。
本发明优选的肽包括式1的化合物，其中，Y是成熟GRF PEPTIDE的30-43氨基酸序列。本发明优选的化合物包括式1的化合物，其中，Y是天然存在的需要分析的特定GRF种类即PGRF，bGRF，hGRF等的30-43氨基酸序列。特别优选的Y肽包括下列氨基酸序列Gln-Gln-Gly-Glu-A34-A35-Gln-Glu-A38-A39-A40-Arg-A42-Arg-Leu其中A34＝Asp或SerA38＝Arg或GlnA39＝Gly或ArgA40＝Ala或SerA42＝Ala，Val或Phe如果上述GRF的特定形式是牛GRF，Glu Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu ArgGly Ala Arg Ala Arg Leu
则一种特别优选的Y肽包括上述氨基酸序列。
如果上述GRF的特定形式是猪GRF，Gln Gln Gly Glu ·Arg Asn Gln Glu GlnGly Ala Arg Val Arg Leu则一种特别优选的Y肽包括上述氨基酸序列。
如果上述GRF的特定形式是人GRF，Glu Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg GlyAla Arg Ala Arg Leu则一种特别优选的Y肽包括上述氨基酸序列，如果Z包括GRF前体PEPTIDES的44-76氨基酸序列，则是本发明的优选肽。来自正在研究中的特殊种的天然GRF的44-76氨基酸序列是特别优选的。
由Z代表的最优选形式的肽成分包括特殊种的天然GRF的44-76氨基酸序列，其中，该序列中，由精氨酸残基取代赖氨酸残基，且亮氨酸取代甲硫氨酸。例如如果Z包括氨基酸序列，Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly，该序列是猪的GRF的一种变型体，且如果分析的GRF是猪的时，该序列是优选的，即为一个GRF PEPTIDE的最佳氨基酸序列。
如果Z含有氨基酸序列Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly，该序列是上述牛GRF的一种变型体，且如果上述的GRF是来自牛时，则是优选的。该序列即是一个GRF PEPTIDE的最佳氨基酸序列。
如果分析的GRF来自人时，则式1最优选的Z序列为零时是优选的。
本发明优选的化合物是含有式1的化合物，其中Y和/或Z肽足够长以便在E.coli中进行高水平表达。
本发明进一步优选的化合物包括GRF PEPTIDES，该GRF PEPTIDES中的无，一个或不仅一个有游离氨基的氨基酸用化学方法修饰。根据本发明目的，“用化学方法修饰”的定义是氨基酸的游离氨基与烷基或羟烷基的衍生作用。修饰的程度由反应长度或试剂量控制。所有有一个游离氨基的氨基酸都用化学方法修饰则是优选的。只有一个游离氨基用化学方法修饰的GRF PEPTIDE是特别优选的。上述化合物无赖氨酸或甲硫氨酸残基。通过用精氨酸取代赖氨酸和用亮氨酸取代甲硫氨酸，将含赖氨酸和/或甲硫氨酸的化合物转变为仅在N-末端有一游离氨基的化合物。
首先合成在N-末端有一游离氨基的GRF PEPTIDES，然后，用合适的X1酸或其活性衍生物酰化N-末端，从而构建本发明的GRF化合物。可以用固相肽合成法或重组方法制造GRF PEPTIDES。两种方法均在美国专利4，617，149中进行了描述，全部引入本文作为参考。如果高产率是令人满意的，则重组方法是优选方法。固相化学合成多肽的原理是本领域专业人员熟知的并且可以从本领域的普通课本中找到，如Dugas，H.和Penney，C.，Bioorganic Chemistry(1981)Springerverlag，New York，Pgs 54-92。GRF类似物的固相合成方法的描述可以从欧洲专利，申请No.85302975.9，公开号为0161852，
公开日1985，11月21日中找到，全部内容引入本文作为参考。
在本发明优选的实施例中，通过重组DNA技术可以合成GRF PEPTIDE。如何构建一个编码给定氨基酸序列的全合成或半合成的DNA序列，对于本领域专业人员是熟知的。Brown，等人，Methods in Enzymology 68109(1979)。为了转译得到需要的多肽，通过使用合适的限制性内切酶，将遗传工程法合成的DNA序列插入到任何适当的重组DNA表达载体中。由所用的母本表达载体的限制性内切酶裂解图决定所用的特殊内切酶。必须将GRF PEPTIDE编码序列与表达载体启动子和核糖体结合位点一起进行定位以形成正确的阅读框架，其中的两者在要表达GRF PEPTIDE的宿主细胞中具有功能。用于在特定重组环境中实现高水平表达的特定密码子也是本领域熟知的。参见W.Fiers，等人.(1976)Nature 260500，和美国专利No.4，356，270。
用于在E.coli宿主细胞中表达的优选载体是来源于E.coli质粒PHS190，它含有TcR基团，λcI857阻遏物和λpL启动子。PHS190的限制位点和功能图谱参见附图的图1。质粒PHS190寄存在Northern RegionalResearch Laboratories，登记号为NRRL B-18410(保存日期1988年9月9日)。
本发明的合成基因序列编码结构为Met1-Ala2-PGRF(3-76)OH，Met1-Ala2-bGRF(3-76)OH和Met1-Ala2-hGRF(3-76)OH的猪、牛和人的GRF类似物。对其他各种如马、鸭、鼠、豚鼠，猪，毛丝鼠，鸡和其它动物有效的GRF类似物可用合成基因得到，该合成基因编码与这些分子的已知氨基酸序列相适应的GRF肽并且用与本文例举的牛和猪GRF肽相类似的方法将这些肽进行修饰。
E.coli固有的甲二磺酰氨肽酶(MAP)的作用是除去上述化合物本身的N-末端甲硫氨酸，以生产所需的PGRF(2-76)OH，bGRF(2-76)OH和hGRF(2-76)OH肽。通过用X1酸或一种其活性衍生物酰化氨基末端氨基，从而将这些(2-76)OH GRF PEPTIDES转变成本发明的化合物(式1)。但是，表达出的肽是融合蛋白形式在分子生物学中是经常的。在这种情况下，生产的GRF PEPTIDE是融合蛋白并且然后从该结构中切割出GRF PEPTIDE，为此，人们必须设计一种编码序列，以便在所产生的融合结构中，GRF PEPTIDE和异源肽之间产生蛋白酶的(如羧肽酶)或化学(如，溴化氰)断裂位点。将外源异源肽从融合蛋白结构中断裂出的生产融合旦白的技术是本领域专业人员熟知的。参见，如美国专利No.4，366，246和4，425，437。在确定一种适当的蛋白水解酶时，优选的是将融合蛋白的氨基酸主链设计成除在所需肽和外源肽之间的界面外，在所需的多肽(即GRF PEPTIDE)中没有任何附加的断裂位点。这样可以避免所需GRF PEPTIDE可能的降解。各种化学和酶试剂的氨基酸序列特异性是本领域专业人员熟知的。参见，如Proteolytic EnzymesA Practical Approach，Benyon，R，J，和Bond，J.S.eds(1989)Oxford University Press，Oxford，England，UK.
如本文举例的本发明优选的实例中，为了在编码链的5′末端有一个XbaI位点并在编码链的3′末端有一个Bam HI位点，而构建一个编码所研究GRF PEPTIDE的合成的DNA序列。为了得到载体DNA，除去PHS190的EcoRI位点。用EcoRI消化PHS190载体，将延伸出的末端填平，并重新连接质粒。随后，用BamHI和XbaI消化，产生载体DNA。再将合成的GRF PEPTIDE编码序列插入到载体DNA中并将载体重新连接。
将连接好的表达载体转化到细菌(如E.coli)或哺乳动物宿主细胞中，所述的宿主细胞适于所使用的特定的表达载体，而得到能表达对本发明适用的GRF PEPTIDE重组细胞。适用于细菌和哺乳动物表达条件的合适的表达载体可在本领域内熟知的实验室手册中找到。如Current Protocols in Molecular Biology，(1989年和补充版)Ausubel，等人.，eds.，John Wiley和Sons，NY。
在此举例说明的本发明优选的具体实施方案中，按照以上描述的方法，通过插入Met1-Ala2-PGRF(3-76)OH GRF肽的编码序列来制备PHS452质粒。在此提供了Met1-Ala2-PGRF(3-76)OH GRF肽的DNA编码序列和相应的氨基酸序列是ATG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AATMet Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn
AAT TAT CGA CGC GTT CTG ACT CAG CTG TCTAsn Tyr Arg Arg Val Leu Thr Gln Leu Ser
GCT CGT CGT CTG CTG CAG GAT ATT CTG TCTAla Arg Arg Leu Leu Gln Asp Ile Leu Ser
CGT CAG CAG GGT GAA CGT AAC CAG GAA CAAArg Gln Gln Gly Glu Arg Asn Gln Glu Gln
GGA GCC CGT GTT CGT CTT GGT CGT CAG GTTGly Ala Arg Val Arg Leu Gly Arg Gln Val
GAT TCT CTG TGG GCT GAT CAA CGT CAG CTTAsp Ser Leu Trp Ala Asp Gln Arg Gln Leu
GCT CTC GAG TCT ATC CTG GCT ACT CTG CTGAla Leu Glu Ser Ile Leu Ala Thr Leu Leu
CAG GAA CAT CGT AAT TCT CAG GGT TAA TAGGln Glu His Arg Asn Ser Gln Gly StopStop如果所插入的DNA序列编码Met1-Ala2-bGRF(3-76)OH GRF时，将该质粒命名为PHS500。编码Met1-Ala2-bGRF(3-76)OH GRF肽的DNA序列和相应的氨基酸顺序是ATG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AAT TCT TATMet Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr
CGT CGT GTC CTT ACT CAG CTG TCT GCG CGCArg Arg Val Leu Thr Gln Leu Ser Ala Arg
CGT CTG CTG CAG GAT ATC CTG AAT CGT CAGArg Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln
CAA GGT GAA CGT AAT CAG GAA CAA GGT GCTGln Gly Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
CGT GTA CGT CTG GGT CGC CAA GTT GAT GGTArg Val Arg Leu Gly Arg Gln Val Asp Gly
GGT TGG ACT GAT CAA CAG CAG CTT GCT CTCVal Trp Thr Asp Gln Gln Gln Leu Ala Leu
GAG TCT ACA CTA GTT TCT CTG CTG CAG GAAGlu Ser Thr Leu Val Ser Leu Leu Gln Glu
CTG CGG AAT TCT CAA GGT TAA TAGArg Arg Asn Ser Gln Gly StopStop被插入的DNA序列编码Met1-Ala2-hGRF(3-44)OH GRF肽。编码Met1-Ala2-hGRF(3-44)OH GRF肽的DNA序列和相应的氨基酸序列是ATG GCT GAC GCT ATC TTC ACT AAC TCT TAC CGTMet Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg
AAA GTT CTG GGT CAG CTG TCT GCT CGT AAA CTGLys Val Leu Gly Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu
CAG GAC ATC ATG TCT CGT GAG CAG GGT GAA TCTGln Asp Ile Met Ser Arg Glu Gln Gly Glu Ser
AAC CAG GAA CGT GGT GCT CGT GCT CGT CTG TAAAsn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu StopCravador，A，et al.(1985)Biochimie 67829-834.
在此举例的本发明优选实例中，如果使用PHS190骨架作为表达载体，将宿主细胞在32℃条件下生长，直到预期表达出多肽化合物。当改变生长温度至接近42℃时，CI857抑制物被灭活，而pL启动子解除抑制。大量有GRF活性的多肽以高至约为总细胞蛋白的15%的水平被生产出来。本专业技术人员熟知的和下述的例子提出的方法能将此活性多肽纯化。如以前说明的，MAP特有的作用可移去N端蛋氨酸残基而产生GRF(2-76)OH GRF多肽，然而，在蛋白纯化后，任何遗留N端蛋氨酸残基均可通过常规的酶促方法被移去，如通过适当的氨基肽酶，或者其它化学方法如通过溴化氰的作用。
本发明所要求的化合物是通过使用所需要的X1羧酸的活性酯而使(2-76)OH GRF肽的氨基末端N-酰化而制得的，较好的是，(2-76)OH GRF肽氨基端氮的酰化作用是通过X1酸的琥珀酰亚胺酯来完成的。酰化作用是由(2-76)OH GRF肽的氨基末端氮对琥珀酰亚胺酯的酯键的羰基碳进行亲核进攻而产生的。下面的反应图说明酰化作用，其结果合成了马尿酰-GRF(2-76)OH
其它X1羧酸活性酯也可用于酰化反应。例如由氯甲酸酯如氯甲酸乙酯和氯甲酸异丁酯或由N-羟基杂环如HOBT(羟基苯并三唑hydroxybenzotriazole)形成的活性酯也能使用。常用于氨基酸的酰化或者配对的其它活性衍生物也可使用。它们包括对称的或N-羧酸酐。
酰化反应是在PH约7.5-9.5，温度约15-35℃的水介质中进行的。或者选用非质子传递溶剂如DMSO。
如果对(2-29，44，或76)GRF肽进行酰化，用于制备结构式1的GRF化合物的X1酸的例子包括马尿酸、对-甲基马尿酸、对-氯马尿酸、对-硝基马尿酸、对-羟基马尿酸、苯氨基碳酸、4-羟基苯丙酮酸、对-氟马尿酸、N-苯丙二酸酰胺、对-甲基-N-苯基丙二酸酰胺、N-(2-噻吩并)甘氨酸、N-(2-呋喃甲酰基)甘氨酸、N-(2-呋喃甲酰基)-b-氨基丙酸、N-(3-噻吩并)-a-氨基丙酸、N-(3-吡啶并)甘氨酸、N-(4-吡啶基)丙二酰胺酸(N-(4-Pyridinyl)malonamide acid)、N-(1，3噻嗪基)丙二酰胺酸(N-(1，3thiazinyl)malonamide acid)、N-(1，3噻嗪基)琥珀酰胺、N-苯基戊二酰胺酸(N-Phenyl glutaramide acid)、N-〔(2-甲氧基乙基)氨磺酰基〕甘氨酸和亚磺酰、N-〔(2-乙硫乙基)氨磺酰基〕甘氨酸和亚磺酰及N-(2-羟基乙基)丙二酰胺酸(N-(2-hydroxyethyl)malonamide acid)。
对于本专业普通技术人员来说。从游离的或粘附到一种类似的N-末端受阻隔的多肽或被取代的羧酸衍生物载体上(3-29，44，或76)GRF肽，GRF(4-29，44或70)GRF肽等开始制备本发明的化合物是显而易见的。
本发明的化合物中包含酰化的GRF肽的其药物学上可接受的非毒性盐，“药物学上可接受的无毒性盐”术语包括有机或无机酸加成盐例如，从如盐酸、氢氟酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富马酸、氢溴酸、乙醇酸(glycolic)、柠檬酸、马来酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、苯甲酸、抗坏血酸、对-甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸等酸制备的盐。酸加成盐较好地从盐酸、乙酸或琥珀酸制备，上述所有的盐可通过常规的方法制得。该术语也包括“羧酸盐”，比如胺、铵、季胺、碱金属和碱土金属的盐如钙、镁、钠、钾、锂的盐等。与现有的羧基构成盐。
下面表1、2和3说明本发明化合物的增强活性。
表1 对Tyr-1＊进行取代后加强了bGRF(1-77)OH生长激素释放活性肽 Ec50(nM)**bGRF(1-77)OH 0.59马尿酰－1bGRF(2-77)OH 0.86对－羟基马尿酰bGRF(2-77)OH 0.33对－氯马尿酰bGRF(2-77)OH 0.19对－氟马尿酰bGRF(2-77)OH 0.14对－硝基马尿酰bGRF(2-77)OH 0.51对－甲基马尿酰bGRF(2-77)OH 0.05n－苯丙二酰胺酰bGRF(2-77)OH 0.19
表2 通过取代Tyr-1而增强bGRF(1-77)OH生长激素释放活性肽 Ec50(nM)**脱Tyr-1pGRT(2-76)OH 95.0马尿酰－1 pGRF(2-76)OH 0.28对－甲基马尿酰pGRF(2-76)OH 0.06对－甲基苯丙二酰胺酰pGRF(2-76)OH 0.06表3 不同长度的对-甲基马尿酰-1 PGRF类似物在体外的作用能力＊肽 Ec50(nM)**对－甲基马尿酰pGRF(2-29)NH20.02对－甲基马尿酰pGRF(2-44)OH 0.07对－甲基马尿酰pGRF(2-76)OH 0.06＊给予7剂促分泌素3小时后，测定生长激素从老鼠原垂体细胞释放进介质中的量。
＊＊EC50是计算得半数有效剂量。
本发明也提供了一种药用组合物包括由结构式1所示的多肽化合物或其药物学上可接受的无毒性的盐作为活性剂和药学上可接受的固体或液体载体。
非肠道使用本发明多肽化合物时，适用于注射的药物制剂包括无菌水溶液或用于重新构成无菌注射液或分散体系的分散剂和无菌粉剂。载体可以是一种溶剂或含有，例如水、乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇、液体聚乙烯乙二醇等等)的分散介质，其合适的混合物和植物油。例如，通过使用一种包衣如卵磷脂，通过维持分散体系中所需颗粒大小和通过使用表面活性剂而保持正确的流动性。利用各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类，氯丁醇，苯酚，山梨酸等，可确保防止微生物的作用。在许多情况下，含有等渗剂是可取的，例如糖、氯化钠等。通过使用延缓吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，能使该注射药剂的吸收延长。
将本发明的化合物溶于所需量的合适溶剂，如果需要，再与各种其它组分相混合，制得无菌注射液。如果需要和为了更有效的分布，可将化合物与缓慢释放或靶向释放体系如聚合物基质，脂粒和微球相混合。这些化合物通过机械释放装置，渗透泵或任何其它释放装置或提供连续或博动的释放系统进行释放。
为了通过静脉(Ⅳ)应用，将水溶性形式的化合物溶于通常使用的一种静脉液中并通过输注给药。可以使用的这样的静脉液例如生理盐水，林格溶液或5%葡萄糖溶液。也可以制备该化合物的合适的不溶性形式，并用水基质或药物学上可接受的油基如一种长链脂肪酸酯如油酸乙酯一起使用。
单位剂量形式的化合物是一种存在于合适的无菌稀释剂中的化合物溶液，优选的是其盐形式，将其密封于安瓿管中。根据化合物的特定剂型，溶解性以及使用时所需的剂量，化合物的浓度可从约1%到约50%之间变化。
本发明也提供了诱导生长激素释放的方法，该方法包括将有效量的通式1表示的多肽化合物或其药物学上可接受的非毒性盐和一种药物学上可接受的固体或液体载体一起施用。
将本发明的化合物药剂施用给受体一段时间，该期间期望刺激生长激素的释放。受体的重量和用药方式将影响到诱导特定应答必需的剂量大小。对于羊优选的剂量约为0。0.1-3.0mg/Kg/1天;最优选的剂量是约0.5mg/Kg/天。对于猪优选的剂量是约3μg/Kg/天到10μg/Kg/天，最优选的剂量是约3μg/Kg/天。对于牛优选的剂量是约0.5-12mg/Kg/天。尤其优选的是3mg/Kg/天。对于人优选的剂量是约0.03mg/Kg/天到1.0mg/Kg/天。最优选的是约0.3mg/Kg/天。
配制单位剂量形式的本发明的化合物特别有利，易于给药和剂量准确。这里所说的单位剂量形式是指作为单一剂量适用于需治疗的患者的机械分离单位。每单位含有计算得的化合物的预定量，与药物学上可接受的载体联合产生所需的治疗效果。特定的单位剂量形式直接依赖于并受(a)特定组合物的独特性质和(b)所获得的特定治疗效果的支配。
经过证实，如果以药物学上可接受的形式适当地施用本发明的GRF和优选的GRF化合物，结果使哺乳动物中生长激素的产量增加。因此，通过使用本发明的化合物同样可以将哺乳动物生长激素应用于医疗和农业中。常需使用生长激素治疗的病症的例子包括侏儒症和骨质疏松症。通过使用本发明的化合物也可以获得生长激素的其他有利效果，如增加瘦肉产量，促进伤口愈合以及抵抗衰老。
可在许多系统中分析本发明的多肽化合物。在戊巴比妥钠-麻醉的老鼠上进行体内分析。Wehrenberg et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.109382(1982)。用老鼠垂体前叶细胞体外测量生长激素的释放(Heiman et al.，Endocrinol.116410(1985))。
下面的实施例用于进一步说明本文描述的发明但不是为了以此限制本发明。
实施例1固相制备bGRF(2-77)OH利用应用生物系统430A肽合成仪(可从Applied Biosystems购买，Foster City California)通过固相方法合成GRF肽并且由应用生物系统提供合成循环。Boc氨基酸和其他试剂由应用生物系统和其他商业部门提供。利用双偶联(double couple)方案将连续的Boc化学过程应用于启动对-甲基-苯羟胺树脂以生产C-末端酰胺。为了生产C末端酸，使用相应的PAM树脂。用预先合成的羟苯并三唑酯将天门冬酰胺，谷氨酰胺，精氨酸，〔α-(对-羟苯基)乙酸〕、〔β-(对-羟苯基)丙酸〕、对-羟基苯甲酸、对-羟基肉桂酸、对-羟苯氧基乙酸进行配对。利用固相合成法，以及HOBT活化氨基酸制备所有N-末端附加物。
使用下列单侧链保护精氨酸，甲苯磺酰基天门冬酰胺，环己基谷氨酰胺，环己基丝氨酸，苄基苏氨酸，苄基酪氨酸，4-溴苄酯基用存在于三氯甲烷中的三氟醋酸(TFA)来解除Boc的保护。在完成合成后，将肽脱保护并用含有10%间-甲基苯酚的脱水氟化氢将其从树脂上脱离。切除侧链保护基团并从树脂上切下肽均是在0℃或低于0℃下完成的。优选的是在-20℃下保持30分钟，然后在0℃保持30分钟。移去HF后，用乙醚洗涤肽/树脂，并用冰醋酸提取肽而后冷冻干燥，在10%醋酸中的交联葡聚糖凝胶G-10(Pharmacia)柱上，通过大小筛析柱色谱法纯化。
实施例2 GRF肽的重组生产2.A.GRF(2-76)OH的重组表达2.A.1编码Met1-PGRF(2-76)OH的质粒PHS452的合成质粒PHS452是一种重组DNA表达载体，当宿主细胞在合适条件下培养时，产生大量本发明优选的PGRF(2-76)OH多肽化合物。
从北方区研究实验室(NRRL)得到一种E.coli K12RV308/PHS190的冷冻保藏物，Peoria，IL61604，登记号NRRL B-18410(保藏日期1988.9.9)且直接用作下面方法中的“培养物”。质粒PHS190的限制位点和功能图可见附图的图1中。在含有5mg/ml四环素的10毫升TY肉汤(每升含10g胰化胨，5克氯化钠和5克酵母提取物)中接种E.coli K12RV308/PHS190培养物并在30℃时通气培养过夜(15-18小时)。得到的培养物作为质粒PHS190的来源。
在1升含有5mg/ml四环素的TY肉汤中接种E.coli K12RV308/PHS190培养物，并在32℃通气培养过夜(15-18小时)，然后将培养物以转速为5200rpm用sorvall(Dupont.Co.，Instrument Products，Biomedical Division，Newtown，CT06470)GSA转头在4℃离心10分钟，使细胞形成沉淀，弃去上清液，将细胞团重新悬浮于28毫升含有25%糖和50nM EDTA(乙二胺四乙酸)的溶液中，将溶于0.25M Tris-HCl(三(羟甲基)铵基甲烷盐酸)的1ml溶菌酶(20mg/ml)溶液，PH＝8.0以及约1.5ml的0.5M EDTA，PH＝8.0加入上述悬液与细胞悬浮液一起混合。然后将得到的混合物在冰上保存15分钟，将3毫升溶解液(由3毫升10%Triton X-100(Rohm & Heas)，75毫升0.25M EDTA PH＝8.0和7毫升水混合制得)加入已用溶菌酶处理的细胞的混悬液中并缓慢混合，然后将所得溶液在冰上再保存15分钟。
4℃温度下，用Sorvall SS34转头，以17，000rpm转速离心约45分钟，将细胞碎片从溶液中移走。将Cscl约28.6克和5mg/ml溴化乙锭溶液约1毫升加到约30毫升的上清液中。用水将溶液体积调至40毫升，并将其转移到超速离心管中，密封，并用Ti70转头(Beckman，7360N、Lincoln Avenue，Lincolnwood，IL60646)以49，500rpm的转速离心约18小时，在紫外灯下可见，分离出的质粒谱带用CsCl饱和的异丙醇提取将溴化乙锭移走，并与三次更换的约20倍体积的缓冲液(10mM Tris-HCl，PH＝7.5和1mM EDTA)进行渗析，收集渗析液，然后加入两倍体积的乙醇和0.05倍体积的3M醋酸钠溶液。将此乙醇混合液冷却到-20℃并在-10℃温度下用SS34转头以10，000rpm转速离心30分钟使质粒DNA沉淀。所得团块再次混悬在约1毫升的TE缓冲液中，然后用等体积的苯酚与氯仿混合液(1∶1，V/V)提取。通过加入0.1倍体积的3M醋酸钠和2倍体积的乙醇，然后在-20℃下保存约30分钟并用SS34转头以15，000rpm的转速离心20分钟，回收水相中的DNA，所得DNA沉淀先用70%乙醇，然后用100%乙醇进行洗涤并干燥。
由上述获得的约1.0毫克质粒PHS190DNA悬浮于1.5毫升的0.1×TE缓冲液中并在-20℃下贮藏。在一个含有DNA的EcoRI缓冲液(100mM Tris-HCl，PH＝7.5 5mM MgCl，50mM NaCl)的反应中用EcoRI(约10单位)限制性酶消化，约10毫克质粒PHS190 DNA该反应在37℃下保持2小时。
为了将5′突出末端转变为平齐末端，将0.5mM的各种dNTP(dATP，dCTP，dGTP，和dTTP)与1-5单位的Klenow片段(Boehringer Mannheim Biochemicals，7941 Castleway Dr.，P.O.Box 50816，Indianapolis，IN 46250)一起加入。此反应在30℃下保持15分钟，然后在75℃处理10分钟而使酶失活。用苯酚，苯酚/氯仿，氯仿提取反应混合物然后用乙醇沉淀。
将质粒再次混悬于50毫升含有40mM Tris-HCl，PH＝7.5，10mM MgCl，10mM二硫苏糖醇(DTT)，0.5mM三磷酸腺苷和1单位T4DNA连接酶(Boehringer-Mannheim Biochemicals，7941 Castleway Drive，Indianapolis，IN46250)的溶液中，此反应在14℃保存过夜。
通过下列过程(见Maniatis et al.，Molecular Cloning，pg，250-251(Cold Spring Harbor Press，1982))将此连结混合物转化E.coli K12RV 308(从NRRL购得NRRL15624)。在500毫升烧瓶中，在100毫升TY肉汤培养基中接种1毫升的RV308过夜培养物。将该细胞在37℃激烈振荡培养至密度为约5×10个细胞/ml。将培养物在冰上放置10分钟，然后在4℃、4000×g下离心5分钟。将细胞混悬在50毫升冰冷的含有50mM CaCl2的10mM Tris-HCl，PH＝8.0的缓冲液中。将细胞再次放置在冰上15分钟并再次离心，然后将细胞混悬于3.3毫升氯化钙溶液中。将连结混合物加到200毫升细胞液中并在冰上保存30分钟。将细胞转移到42℃的水浴中放置2分钟，在试管中加入1毫升TY肉汤并将细胞在30℃培养1小时，然后将200ul等分试样培养在含有5mg/ml四环素的TY琼脂(TY肉汤+1.5%琼脂)平板上并在30℃生长过夜。
将质粒再次混悬于10毫升的水中，用Xba I和Bam HI消化质粒而产生载体。将约1毫升Xba I(约10个单位)加到10毫升质粒DNA(约10mg)和5毫升10X Xba I的缓冲液中(500mM Tris-HCl，PH＝8.0，100mM MgCl，和500mM NaCl)。在37℃下培养90分钟后，加入5M NaCl 0.5ml和BamHI 1ml(10单位)并在37℃下继续培养90分钟。将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳并通过电解洗脱后再用乙醇沉淀，分离出约5.75Kb XbaI-Bam HI载体片段。
采用本领域内技术人员共知的应用生物系统模型380B合成仪合成下列DNA序列，将该序列分割成低聚核苷酸而完成合成基团的构建过程，随后基本上按照Brown等(酶学方法68109(1979))的方法连结这些低聚核苷酸。下列DNA序列编译一个本发明优选的多肽，其中A9＝Asn，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Leu，A28＝Ser，A38＝Gln，A39＝Gly，A40＝Ala，A42＝Val，and Z＝Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly，所说序列的正链包括ATG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AAT AAT TAT CGA CGC GTTCTT ACT CAG CTG TCT GCT CGT CGT CTG CTG CAG GAT ATTCTG TCT CGT CAG CAG GGT GAA CGT AAC CAG GAA CAA GGAGCT CGT GTT CGT CTT GGT CGT CAG GTT GAT TCT CTG TGG
GCT GAT CAA CGT CAG CTT GCT CTC GAG TCT ATC CTG GCTACT CTG CTG CAG GAA CAT CGT AAT TCT CAG GGT TAA TAG将含有编码序列的DNA随后与上述构建的Xba I-Bam HI载体片段混合并连接。将连接混合物转化上述的E.coli K12 RV308，由限制性内切酶消化，分析具四环素抗性的转化体的质粒DNA以证实该质粒是PHS452。
2.A.2 编码Met1-bGRF(2-76)OH的质粒PHS500的合成来源于牛的重组GRF肽可基本上按照上述2.A.1例的方法进行生产，但是在生产重组牛GRF肽时，该DNA序列编码本发明的优选肽，其中A9＝Ser，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Leu，A28＝Asn，A38＝Gln，A39＝Gly，A40＝Ala，A42＝Val，and Z＝Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly，该DNA序列所对的链是ATG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AAT TCT TAT CGT CGT GTCCTT ACT CAG CTG TCT GCG CGC CGT CTG CTG CAG GAT ATCCTG AAT CGT CAG CAA GGT GAA CGT AAT CAG GAA CAA GGTGCT CGT GTA CGT CTG GGT CGC CAA GTT GAT GGT GTT TGG
ACT GAT CAA CAG CAG CTT GCT CTC GAG TCT ATA CTA GTTTCT CTG CTG CAG GAA CGT CGG AAT TCT CAA GGT TAA TAG将含有该编码序列的DNA与在例2.A.1中所描述的Xba I-Bam HI载体片段相混合并连结。用连结混合物转化上述所描述的E.coli K12RV308。将编码bGRF序列的质粒命名为PHS500。通过限制性酶消化对具四环素抗性的转化体的质粒DNA进行分析以证实该质粒是PHS500。
2.A.3编码Met1-hGRF(2-46)OH的DNA的合成来源于人的重组GRF肽基本上采用实施例2.A.1所述方法制备。但是，在本发明的优选实施方案中，制备人的重组GRF肽时，采用经修饰的hGRF肽，其中A9为Ser，A12为Lys，A15为Gly，A21为Lys，A22为Leu，A25为Asp，A27为Met，和A28为Ser，y含有下列氨基酸序列Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-LeuZ为0，编码这种肽的DNA正链序列包含以下序列ATG GCT GAC GCT ATC TTC ACT AAC TCT TAC CGT AAAGTT CTG GGT CAG CTG TCT GCT CGT AAA CTG CTG CAGGAC ATC ATG TCT CGT GAG CAG GGT GAA TCT AAC CAGGAA CGT GGT GCT CGT GCT CGT CTG TAA含有这种编码序列的DNA，采用实施例2.A.1所述的方法与Xba I-Bam HI载体片段混合并连接，连接混合物再采用前面所述的方法转化到E.coli K12RV308中。
实施例2.B.重组GRF肽的分离2.B.1 GRF类似物在E.coli中的表达将E.coli K12RV308/PHS451在温度为32℃，含有5mg/ml四环素的TY肉汤中培养至细胞的半对数生长期，然后将混合物的温度升至42℃，继续培养3小时以上。将定位于由PHS451质粒表达的GRF类似物上的λPL启动子的cI857温度敏感性阻遏物在42℃灭活，以允许GRF类似物的表达。bGRF肽的表达基本上按照上面所描述的表达PGRF的方法进行，所不同的是用PHS500质粒以代替PHS452质粒。
2.B.2 含有GRF类似物的颗粒的分离如果利用本文中例举的高水平E.coli表达系统，旦白质产物存在于内含体或颗粒体中而与其他物质隔开。分离出含有该GRF类似物的颗粒，溶解以分离所需的GRF肽。首先，将所有细胞离心，然后重新悬浮于10℃水中。将细胞浆在Gaulin匀化器中以8000psig进行匀浆化处理。得到的匀浆用水稀释，搅拌10分钟，随后用10%氢氧化钠调PH至8.4-8.6。然后离心混和物。所得固体物为含有GRF类似物的颗粒，将其冷藏于-70℃下备用。
2.B.3 GRF类似物的最后纯化将上述实施例2.B.2制备的颗粒在温度为2-5℃的条件下解冻，加入10倍体积的0.05N乙酸-7M脲溶液溶解，然后匀浆5-8分钟。加10%HCl将PH值调至2.5-2.6。将混合物在2-5℃搅拌12-15小时，溶液用覆盖DicaliteSpeedex过滤助剂(Grefco，Torrance，CA)的Sparker过滤器净化。用乙酸-脲溶液稀释使细胞溶液的导电率，降至4000mohms以下。
采用S Sepharose (Pharmacia，800 Centennial Ave，Piscataway，NJ08854)树脂制备阳离子交换柱。该柱子含有1升树脂/50克样品。将样品以0.1升/cm/小时的流速加到柱上并用2倍柱体积的溶于乙酸-脲溶液中的0.1M NaCl洗涤。用含有0.25-1.6M线性梯度浓度的NaCl的乙酸-脲溶液洗脱GRF类似物，每次用3个柱体积的洗脱液可收集0.1倍柱体积的分馏物。含GRF类似物的馏份可利用其导电率，O.D.276，高压液相色谱(HPLC)和聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定。然后将得到的馏分集中。
在收集到的馏分中加入等体积的乙酸-脲溶液。然后将样品上样至已用乙酸-脲进行排序的含S Sepharose 树脂的柱子上，每升树脂装载50克旦白质。流速是0.02升/cm2/小时。用含有0.25M至1.2M NaCl线性梯度的乙酸-脲洗脱GRF类似物馏分。收集0.1倍柱体积的馏分。按照以前的方法分析馏分，并且收集含有GRF类似物的馏分。
用PH为2.5的0.02M甘氨酸制备柱体积为前面收集的馏分的体积的5倍的葡聚糖G-15柱。分离出含有O.D.276峰的馏份。
然后用10%乙腈-0.02M甘氨酸，PH＝2.5制备含有SP20SS树脂(Sephabeads ，Mitsnbishi Chemical，Tokyo)的柱子。用乙腈将含收集的GRF类似物的溶液浓度调至10%然后将其以1.5-2柱体积/每小时的流速加到柱上。用2倍体积的乙腈-甘氨酸缓冲液洗涤柱子。用由3倍柱体积的10%乙腈-0.02M甘氨酸与三倍柱体积的50%乙腈-0.02M甘氨酸混合而形成的梯度洗脱GRF类似物。收集0.1倍柱体积的馏分，用于分析GRF类似物。
然后将含有GRF类似物的样品在用0.25M乙酸平衡过的Sephadex G15柱上进行色谱分析。然后分离出O.D.276峰，冷冻干燥备用。
实施例3 马尿酰-1-PGRF(2-76)OH的制备将3.58克苯甲酰甘氨酸(购自Transworld Chemicals)振荡溶解于约20ml DMF中并在一个冰浴中冷却。将2.5克N-羟基琥珀酰亚胺加入该溶液中，然后再加入4.5克二环己羰酰亚胺(DCC)。反应在室温下搅拌过夜。
通过过滤移走反应所生成的不溶性二环己脲(DCU)，真空浓缩DMF滤液。用CH2Cl2稀释残留物。形成的沉淀通过过滤，真空干燥后得到3.79克的琥珀酰亚胺基马尿酸酯。
将基本上按照上述实施例2.A.制备的约72mg的PGRF(2-76)OH在室温下通过搅拌溶解于3ml 0.1M Tris-HCl，PH7.8，30%丙醇溶液中。在该反应中加入57mg琥珀酰亚胺基n-苯甲酰甘氨酸酯，在室温下搅拌反应，在加入琥珀酰亚氨基n-苯甲酰甘氨酸酯后，在15分钟，1小时，2小时时分别取出5μl样品以跟踪反应进展。用0.1%TFA(0.15-0.2mg/ml)将每一个样品稀释至500μl然后注射到0.46×15cm Vydac C18柱上以进行RP-HPLC分析并与起始样品进行比较。
在2.5小时后，用约1ml冰醋酸酸化反应混合物，将其上样到2.2×28.5cm Sephadex G-10柱上。用10%醋酸洗脱柱子并收集7.5ml馏分。测定每一馏分的ABS280以表明肽的存在。将表明有肽存在的7-10馏分合在一起，冷冻，并且冷冻干燥得到70mg的冻干粉。
将约9mg的样品溶于1.0ml的0.1%TFA中。将该溶液分成十个0.1ml的等分试样，将这些样品冷冻并且冻干。将一份样品用作快原子轰去质谱分析(FAB-MS)。将第二份样品进行氨基酸序列分析。
实施例4 对甲基马尿酰PGRF(2-76)OH的制备A部分对-甲基苯甲酰甘氨酸的合成在0.5℃，采用机械搅拌将约7.5克甘氨酸溶于含有105ml的2N NaOH和50ml的二噁烷的溶液中。用二噁烷将大约14.9ml的对-甲苯酰氯稀释至50ml体积并在15-20分钟期间将其滴加到反应中。25℃(即室温)将反应混和物搅拌过夜。
用NaOH水溶液使反应物呈碱性，用二乙基醚萃取。用6N HCl将水相酸化至PH3.0。用乙酸乙酯萃取水相，用水冲洗乙酸乙酯并用MgSO4干燥，过滤，将滤液真空干燥至近干燥。将固体悬浮于乙醚中，过滤，真空干燥以产生14.25克后来证明是对-甲基马尿酸。通过熔点和其元素燃烧分析，将其与对-甲基马尿酸的，理论值进行比较而证实鉴别到的产物。上述得到的化合物的熔点是151-154℃。下表1中显示了元素燃烧分析资料。
B部分 对甲基马尿酰PGRF(2-76)OH的合成将基本上按照实施例4A部分描述的方法制备的约1.65克对-甲基马尿酸边振荡溶解于15ml二甲基甲胺(DMF)中并在冰浴中冷却。将约1克N-羟基琥珀酰亚胺加入该溶液中，然后加入1.9克DCC。在室温(25℃)下振荡反应过夜。
通过过滤分离出DCU沉淀物，真空浓缩滤液。用乙醚稀释残留的油，析出晶体。通过过滤分离出固体，用乙醚冲洗，真空干燥，产生具熔点为167-170℃的3.28克产物。将样品进行元素燃烧分析，其结果与对-甲基马尿酸的琥珀酰二亚胺酯(C14H14N2O5)的预期的理论值进行比较。
将基本上按照实施例2.A制备的大约72mg的PGRF(2-76)OH在室温下通过振荡溶于3ml的0.1M Tris-HCl，PH7.8，30%丙醇中。将57mg对-甲基马尿酸的琥珀酰二亚胺酯加入反应中，并在室温下振荡反应，在加入琥珀酰亚胺基N-(对-甲基)马尿酸后15分钟，1小时和2小时各取5μl样品以便跟踪反应进展。用0.1%TFA将每一个样品稀释到500ml并且注射到0.46×15cm Vydac C18柱上以进行RP-HPLC分析，并与起始材料进行比较。
在2.5小时后，用约1ml冰醋酸将反应混合物酸化，并且上样到2.2×28.5cm.Sephadex G-10柱。用10%醋酸洗脱柱子并收集7.5ml馏分。测定每一个馏分的ABS280以表明存在多肽化合物。将表明有多肽存在的7-10馏分合在一起，冰冻，并冷冻干燥至70mg的冷冻干燥物。
实施例5 对氯马尿酰bGRF(2-77)OH的制备基本上采用上述实施例4所述方法制备对-氯马尿酰GRF衍生物，所不同的是在A部分中用对-氯苯甲酰氯代替对甲苯酰氯并且基本上按照实施例1(固相)的方法制备bGRF(2-77)OH GRF肽。
实施例6 对-硝基马尿酰bGRF(2-77)OH的制备基本上按照上述实施例4所述方法制备对-硝基马尿酰GRF衍生物，所不同的是在A部分中用对-硝基苯甲酰氯代替对甲苯酰氯，并且基本上按照实施例1(固相)的方法制备bGRF(2-77)OH GRF肽。
实施例7 对羟基马尿酰bGRF(2-77)OH的制备采用基本上按照上述实施例4的方法制备对羟基马尿酰GRF衍生物，所不同的是在A部分中用对-羟基苯甲酰氯代替对苯甲酰氯，bGRF(2-77)OH GRF衍生物采用基本上按照实施例1(固相)的方法制备。
实施例8 对氟马尿酰bGRF(2-77)OH的制备基本上采用上述实施例4所述方法制备对-氟马尿酰GRF衍生物，所不同的是在A部分中用对-氟苯甲酰氯代替对苯甲酰氯，并且基本上采用实施例1(固相)所述方法制备bGRF(2-77)OH GRF肽。
实施例9 N-苯基丙二酰胺基-1-bGRF(2-77)OH的制备在25℃，机械搅拌条件下将约9.1ml(0.1摩尔)苯胺溶解于100ml的CH2Cl2中。在该溶液中加入15.1克K2CO3，然后滴加入含有14ml乙基丙二酰氯的20ml CH2Cl2。将反应在25℃振荡3-4小时，让反应继续进行约72小时。
用约500ml的H2O/CH2Cl2稀释该反应。振荡该混合物并将CH2Cl2相分离开，先用HCl水溶液洗涤，然后用水洗，用MgSO4干燥，过滤，蒸发滤液得14.5克油。
将上面制备的约14克乙基N-苯基丙二酰胺溶于25ml二噁烷和75ml的1N NaOH中。反应在25℃振荡约3小时。
在仍是碱性时用乙醚萃取反应物。用6N HCl酸化水相，再用乙酸乙酯提取并用MgSO4干燥。将乙酸乙酯滤液蒸发至固体。将此固体在乙醚中研磨，过滤并真空干燥得到5.1克产物。利用元素燃烧分析法和1H-NMR分析该产物。所得结果显示产物是N-苯基丙二酰胺酸或N-苯基丙二酸一胺。
将N-苯基丙二酰胺酸通过HOBT酯与bGRF(2-77)树脂交联。
实施例10 N-苯基丙二酰胺基-1-PGRF(2-77)OH的制备将基本上按照上述实施例的方法制备的3.58克N-苯基丙二酰胺酸通过搅拌溶于约20ml的DMF中，在冰浴中冷却。将2.5克N-羟基琥珀酰亚胺加入该溶液中，随后加入4.5克二环己基碳二亚胺(DCC)。在室温下搅拌反应过夜。
过滤除去DCU，真空浓缩DMF滤液。用乙醚稀释残留物。过滤所形成的沉淀，将其真空干燥，得到3.79克N-苯基丙二酰胺酸的琥珀酰亚胺酯。
在室温下通过搅拌将基本上按照上述实施例2.A的方法制备的约72克PGRF(2-76)OH溶于3ml的0.1M Tris-HCl，PH7.8，30%丙醇溶液中。在该反应中加入57mg上面制备的N-苯丙二酰胺酸琥珀酰亚胺酯，在室温下搅拌反应，在加入N-苯丙二酰胺酸的琥珀酰亚胺酯后在15分钟，1小时和2小时时各取5μl样品以跟踪反应进展。用0.1%TFA(0.15-0.2mg/ml)将每个样品稀释到500μl，将其注射到0.46×15cm Vydac C18柱上进行RP-HPLC分析，并与起始样品进行比较。
在2.5小时后，反应物用约1ml冰醋酸酸化，将其上样到2.2×28.5cm Sephadex G-10柱上。该柱用10%醋酸洗脱，收集7.5ml馏分。测定每一馏分的ABS280，显示有多肽化合物存在。将显示有多肽存在的7-10馏分合在一起，冷冻，并冷冻干燥，得到70mg冻干物。
实施例11 对-甲基马尿酰PGRF(2-76)OH的配制用无热原的水溶解1.38克Na2HPO4和1.0克PSA，定容至1升，PH约为5.1，制成载体溶液。将基本上按照实施例4.B.的方法制备的27.4mg的对-甲基马尿酰PGRF(2-76)OH加入该载体溶液，终浓度为360毫当量/毫升。
实施例12.通过每日三次皮下或静脉注射公猪观察对甲基马尿酰PGRF(2-76)OH的体内作用将20头已用手术在股静脉中插入了埋藏导管的平均体重约72Kg的杂交公猪，用于测定对-甲基马尿酰PGRF(2-76)OH的作用。按照上述实施例11的方法制备对-甲基马尿酰PGRF(2-76)OH制剂，将该制剂以10.0μg/Kg/inj.的剂量每天静脉(I.V.)或皮下(S.Q.)注射三次。每天给公猪喂食2000克含18.5%粗蛋白的玉米-黄豆饲料，均分成两次在上午800和下午400喂食。在上午800，下午400和下午1200给公猪注射。在15天的控制期，43天处理期，以及停止处理后23天期间收集公猪的尿氮排泄量数据。在处理的第12天，24小时期间内采集30个血清样品。测定血清样品中的生长激素(GH)，血脲氮(BUN)，葡萄糖，胰岛素，游离脂肪酸(FFA)，和三甘油酯的含量。测定结果显示于下面表4中。
处理＝对-甲基马尿酰PGRF(2-76)OH，通过相应的给药途径每日注射三次。
对照＝通过相应的给药途径用载体溶液(磷酸缓冲液)每日给对照猪注射3次。
(a，b)＝同一柱子的平均值具相同字母时不具差异P＜0.05，Student-Newman-Keuls。
GH＝生长激素含量上述资料表明，如果以30.0μg/Kg/天的剂量每天注射3次，表现出公猪的尿氮排泄减少(41%)以及血清中血脲氮含量减少(54%)的现象表明对-甲基马尿酰PGRF(2-76)OH参与代谢。注射对-甲基马尿酰PGRF(2-76)OH使血清中GH含量增加4倍(见图4)，同时血清中葡萄糖，胰岛素，游离脂肪酸和三甘油酯的含量也提高。除了皮下注射猪比静脉注射猪血清中胰岛素含量提高外，不同的给药方法没有在血清中产生不同的应答。并且皮下注射公猪停止后，对尿中脲氮排泄(见图5)要延长2-3天。
权利要求
1.制备GRF类似物的方法，该方法包括a)利用化学或重组DNA技术制备des-Tyr1-GRF肽以及b)用化学方法修饰其氨基末端。
2.根据权利要求1所说方法，其特征在于制备下式化合物X1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A12-Val-Leu-Al5-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-Leu-Gln-A25-Ile-A27-A28-Arg-Y-Z-T其中A9 = Ser, Ala, Leu, Thr or Asn,A12 = Arg or Lys,A15 = Gly, Ala, Thr or Leu,A21 = Arg or Lys,A22 = Ala or Leu,A25 = Asp or Glu,A27 = Met, Ser, Arg, Leu, or Norleucine,A28 = Ser or Asn,Y为0，或含1-15个氨基酸的肽，Z为0或含1-32个氨基酸的肽，T为由式-COORa，-CRaO，-CONHNHRa，-CON(Ra)(R)或CH2ORa表示的羰基末端基团，其中Ra和Rb为相互独立的低级烷基，氢，Hse(内酯)，HseOH或HseN(Rc)(Rd)，其中Rc和Rd各自分别是氢和低级烷基，X1为由下式代表的酰基基团
其中R1＝氢，甲基，乙基，羟乙基，苯基，或由卤素，低级烷基，低级烷氧基，羟基，硝基或氨基取代的苯基，酰胺基，三氟甲基，-CH2-OH，或硫酰胺，或为含有1个或多个N，O或S的5员或6员杂环，a为0，1，2或3，b为0或1，c为0或1，d为0-12，A为0，O或S，B为羰基，磺酰基或亚磺酰;R2为H，CH3，CH2OH，对-羟基苄基或
e＝0-5，R3为甲基，乙基，羟乙基，氨基，羟基，苯基，或用卤素，烷基，烷氧基，羟基，硝基，氨基取代的苯基，酰胺基，或硫酰胺，或含1个或多个N，O或S的5或6员杂环，及其药物学上可接受的非一毒性盐。
3.根据权利要求2所说的方法，其中a＝0，b＝1，B是羰基，C＝0，d＝0和A＝0。
4.根据权利要求3所说的方法，其中R1为选自甲基，苯基，对-硝基苯基，对-氯苯基，对氯苯基，对-羟基苯基，对-甲基苯基，N-苄基(异烟酰基)的基团。
5.根据权利要求4的方法，其中R2是选自H，CH3或CH2OH的基团。
6.根据权利要求5的方法，其中R2包括H。
7.根据权利要求2至6的任一种方法，其中A9＝Asn，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Leu和A28＝Ser。
8.根据权利要求7所说的方法，其中Y包括下列氨基酸的肽Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu，或其功能衍生物。
9.根据权利要求8所说的方法，其中Z含有下列氨基酸序列Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-lle-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly，或其功能衍生物。
10.根据权利要求2-6任一项所说的方法，其中A9＝Ser，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp以及A28＝Asn。
11.根据权利要求10所说的方法，其中Y包含下列氨基酸序列Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu，及其功能衍生物。
12.根据权利要求11所说的方法，其中Z包含下列氨基酸序列Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
13.根据权利要求2-6任一项所说的方法其中A9＝Ser，A12＝Lys，A15＝Gly，A21＝Lys，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Met，和A28＝Ser。
14.根据权利要求13所说的方法，其中Y含有下列氨基酸序列Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其功能衍生物。
15.根据权利要求14所说的方法，其中Z是O。
16.一种制备药用制剂的方法，该方法包括将一种GRF类似物与一种或多种药物学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂混合。
全文摘要
本发明提供了与天然的GRF或以前描述的GRF类似物相比具有更好的活性和效力的氨基半端修饰过的生长激素释放因子(GRF)类似物。本发明也提供了含有结合了选自天然形式的GRF肽的氨基酸修饰物的GRF肽的氨基末端经修饰的GRF类似物。描述了牛、猪、人和其它种的GRF的优选类似物。本发明也提供了利用本发明的化合物促进生长激素释放的方法。本发明也提供了本发明化合物的药用制剂。本发明还提供了利用本发明化合物制治疗因生长激素含量不足引起的各种疫病的方法。本发明还提供了施用本发明化合物增加哺乳动物瘦肉质量的方法。
文档编号A61P15/00GK1068123SQ9210421
公开日1993年1月20日 申请日期1992年4月24日 优先权日1991年4月26日
发明者R·D·迪马奇, M·L·海曼, J·E·希尔兹, D·L·施迈利, D·I·威基泽 申请人:伊莱利利公司