专利名称：减少了宿主糖含量的乙型肝炎病毒表面蛋白的制作方法
乙型肝炎病毒(HBV)是引起多种人类肝脏疾患的感染性因子。许多感染了HBV的患者都经历疾病的急性期，继而进入恢复期。但是，部分患者没能消除所受到的感染，因而成为HBV感染的慢性携带者。HBV感染在世界许多地区呈现出流行性，感染的高发生率见于产期，由受慢性感染的母亲传染给其新生儿，而新生儿常常又维持其慢性感染。据估计，世界范围内受HBV感染的人数已逾3亿。在这些携带者中，每年有成千上万的患者死于长期患慢性乙型肝炎所致的并发症(肝硬化和/或肝癌)。
与HBV共同感染的乙型肝炎delta病毒能引起通常是致死性的急性暴发性疾病。delta病毒不能由其自身的遗传物质编码作为病毒体包膜的蛋白质;而是被由共同感染的HBV编码的包膜蛋白所包裹，因此，该病毒与下文述及的HBV蛋白共有一种密切的结构和免疫关系。目前还不清楚其它的感染性因子是否与HBV也具有类似的关系。然而，已经清楚，借助于一类与HBV有微弱或部分抗原交叉反应活性的因子，被扩展了血清学反应性范围或被增强了免疫原效力的蛋白质可用于疾病(或感染)的诊断或预防(或治疗)系统中。
乙型肝炎病毒体由二类结构蛋白组成核心蛋白和包膜或表面蛋白。除了作为主要的表面蛋白或病毒体，即Dane颗粒外，包膜蛋白也是澳大利亚抗原，或22nm颗粒的主要成分。这些包膜蛋白是编码至少389个氨基酸(aa)的大的病毒开放阅读框架(ORF)的翻译产物。该ORF分成三个区，每区以可在体内作为翻译起点的ATG密码子起始。这些区域在基因中以5′-3′方向分别称作前S1(108aa)、前S2(55aa)和S(226aa)。因此，这些区域定义了被称为S或HBsAg(226aa)、前S2+S(281aa)和前S1+前S2+S(389aa)的三种多肽，这三种多肽也分别称为p24/gp27、p30/gp33/gp36和p39/gp42(以及主要、中等和大蛋白)。
HBV的包膜蛋白是含有碳水化合物侧链(聚糖)的糖蛋白，该侧链以N-配糖键与被定义的肽识别位点相连接[Heermann et al.，J.Virol.52，396(1984);Stibbe et al.，J.Virol.46，626(1983)]。因此，在自然感染过程中产生的HBV多肽所包含的种类有p24/gp27(S多肽及其糖基化衍生物)、p30/gp33/gp36(仅在前S2区糖基化的前S2+S多肽和在S及前S2区糖基化的前S2+S多肽)和p39/gp42(前S1+前S2+S肽及其在前S1区糖基化的衍生物)。现行可用的从血浆中获得的疫苗由只含有S区(包括p24单体和其糖基化衍生物)的蛋白质组成，而目前成功地制备出的酵母源性疫苗由S多肽(仅含非糖基化p24类多肽)独自构成。
22nm HBsAg颗粒已从慢性携带者血浆中纯化出来。由于他们的血浆呈病毒颗粒阳性，这些慢性携带者被称为HB+S。如果感染者已产生了足够的免疫反应，他们能清除感染，变成HB-S。如果产生了抗HBS的抗体，这些感染者被称为抗-HBs+。由此说来，抗-HBs+与疾病的恢复和对疾病再感染的免疫力，及对HBV再感染的免疫力相关。因此，可望证实通过HB疫苗刺激或形成的抗-HBS对HBV感染具有保护作用。
上述假设已进行了实验性检验。在人类之外，黑猩猩是少数几种对HBV感染完全易感的物种之一，这种感染以可定量的标志物如HB+S和血清中肝酶水平的升高来反映。用三种剂量的纯化HBsAg颗粒接种黑猩猩，然后用感染性HBV静脉内注射加强。尽管接种动物模型表现出急性HBV感染征象，但HBsAg接种的动物则在这种感染中完全得到保护。因而，在这一实验系统中，由p24(或p24和p27)组成的HBsAg颗粒已足以诱导保护性免疫。受到这些观察结果的鼓舞，数家制造商已生产出由HBsAg颗粒组成的HB疫苗。
为了扩大可用的HB疫苗的来源，制造商已转向用重组DNA技术介导病毒包膜蛋白的表达。在微生物系统中，大肠杆菌和啤酒酵母最常用于表达多种由重组得到的蛋白。许多试图在大肠杆菌中表达有免疫活性的HBsAg颗粒的尝试都未获成功。然而，啤酒酵母在表达有免疫活性HBsAg颗粒方面显示出了很大的多样性。这些颗粒(仅含有p24)在配制成疫苗时被证明能够完全防止黑猩猩遭受多种血清型的活HBV的侵袭。而且，在人类临床试验中，酵母源性S颗粒与血浆源性HBsAg同样具有免疫活性和有效地防止疾病或感染[Stevensetal.，JAMA，257∶2612-2616(1987)]。因此，可确立用啤酒酵母作为控制重组HBsAg合成的宿主种属。此外，在酵母中表达用于人类的治疗因子和疫苗对于增加产量非常有益，因为酵母不含内毒素，对人无致病原性，能进行工业规模的发酵，并且没有因应用连续性哺乳动物细胞系(许多由病毒转化的细胞系对小鼠具致肿瘤原性，并且所有细胞系都含有原癌基因)所产生的多种安全性考虑。
啤酒酵母(面包酵母)是能合成糖蛋白的真核细胞。酵母中的糖基化作用已成为许多近期综述文献中的话题[主要文献有Kukuruzinskaetal.，Ann.Rev.Biochem.(1987)56，915-44;Tannenetal.，BBA，(1987)906，81-99]。所说糖基化作用或聚糖向多肽上合适受体氨基酸(aa)的加成作用发生于特异的丝氨酸(ser)或苏氨酸(Thr)残基(O-连接)，或者发生于特定的天冬酰胺残基(N-连接)。于Ser或Thr残基部位进行O-连接加成作用的特异性还未清楚地认识，对特异性的确定是基于不同情况凭经验进行。
进行N-连接糖基化作用的信号序列已清楚地定义为氨基酸序列Asn-X-Thr或Asn-X-Ser(其中的X代表任何氨基酸)。除了合成多种自体天然的糖基化蛋白[这些蛋白被称为甘露蛋白(mannoproteins)或甘露肽(mannopeptides)]，酵母还能够糖基化经重组技术表达的异种或外源蛋白质(如果异种蛋白含有进行N连接或O连接糖基化作用的合适糖基化信号序列)。
在自然感染过程中产生的前S2+S多肽含有的“核心”(估计大小为3KD)N连接聚糖不超过2个，一个在S区，另一个在前S2区氨基酸残基4的Asn上。在Recombivax HB
或在酵母中合成的重组前S2+S的S区中的识别位点未被糖基化，但前S2区中的氨基酸残基4位点可被酵母识别和糖基化。
前S1区在氨基酸残基4上具有一个N连接糖基化作用位点，在氨基酸残基26上有一个用于血清型adw的潜在的位点。本领域的专业技术人员很容易意识到前面对于前体S2糖基化作用的讨论也适用于前S2区以及前S1和S区中的各种不同序列。
酵母合成的重组前S2+S中增加了一个“核心”聚糖，它与病毒感染过程中天然多肽所增加的“核心”聚糖相似。然而，如果用以进行糖基化作用的酵母宿主细胞是“野生型”(即含有天然糖基化作用所需要酶的全部互补成份，实际上对于所有常用的酵母菌株都是这种情况)，即可以与酵母制造其自身结构甘露蛋白一致的方式，用大量额外甘露糖残基来延伸大量的这种聚糖，当这种聚糖的延伸加成作用发生于外来基因产物，如前S2+S多肽时，它被称为超糖基化作用(hyperglycosylation)。本领域技术人员很容易认识到有关酵母的讨论也将扩展到可能具有不同糖基化作用方式的其它宿主细胞(例如昆虫、真菌等)。
进一步还表明，在野生型酵母宿主细胞中表达的HBV表面蛋白22nm颗粒的重组形式在22nm颗粒中获取了一定量的酵母细胞糖类(至少部分衍生于酵母宿主细胞的结构甘露蛋白和甘露肽)。这种获取的糖类会引起潜在性问题，包括它可能刺激抗糖基化蛋白上酵母糖类基团的抗体产生，含有所获酵母糖类的疫苗免疫原将与存在于大多数哺乳动物中的抗酵母抗体反应，因而减弱了其作为免疫原和疫苗的效力。
借助下述任何方法，可以消除超糖基化作用以及对完整甘露蛋白和甘露肽的获取，并且使糖基化作用局限于HBV前体S和S多肽以及它们的相应颗粒中。
首先，可在重组体宿主的生长过程中，于生长培养基中加入一种外源因子(例如，衣霉素)以防止或限制N-连接过糖基化作用发生。第二，可通过化学方法(如无水三氟甲烷-磺酸或无水氟化氢)、或酶学方法(如用N-聚糖酶，Endo-F或Endo-H)或物理方法(例如超声处理)使重组或天然产生的多肽去糖基化。第三，通过DNA水平的诱变作用使糖基化作用的识别位点发生改变或缺失，以阻止核心糖基化作用以及过糖基化作用。经过如此修饰而改变了糖基化作用识别序列(由在酵母中有活性的合适启动子控制)的前S+SORF已转化到酵母宿主细胞中。所得的前S+S多肽不具有糖基化作用。第四，可以鉴别出缺乏糖基化作用所需关键性酶类的宿主细胞，这是说明本发明，但本发明不仅限于此。已鉴定出了一个这类酵母菌株(mnn9突变株)[Ballou，L.et.al.，(1980)，J.Biol.Chem.255，p5986-5991]，它缺乏延伸(过糖基化作用)N-连接聚糖所需糖基化作用通路中的一种关键酶，化学研究表明，该突变株使得甘露蛋白无外层甘露糖残基链而仅含“核心”糖类。[Ballou，C.E.etal.，(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，pp3081-3085;Tsai，P.etal.，(1984)，J.Biol.Chem.，259.pp3805-3811]。编码S或前S+S多肽的ORF(由在酵母中具备活性的适宜启动子控制转录)已用于转化酵母mnn9突变株。所得前S+S多肽只具有“核心”糖基化作用而缺乏过糖基化作用。
尽管S多肽在酵母中表达时既不被糖基化也不被过糖基化，但由它们组成的颗粒含有高水平衍生于酵母甘露蛋白的获取糖类。因此，S多肽及含多肽的前S在不能进行过糖基化作用的酵母细胞中表达将导致所表达22nm颗粒中糖含量的降低。
啤酒酵母在表达有免疫活性的22nm颗粒方面显示出了很大的多样性。已证实，当这些颗粒配制到疫苗中时具有完全保护黑猩猩免遭活的HBV侵袭的能力。而且，在人类临床试验中酵母源性HBsAg与血浆源性HBsAg一样已产生免疫效果。因此，可确定用啤酒酵母作为一种宿主以控制合成重组HBsAg。
在多种重组微生物表达系统中，许多不同多肽的合成对宿主细胞表现出有害性。因此，在选择这些多肽的表达方面有一定的麻烦，使得那些在重组培养物中以递增方式积累的唯一细胞不能够表达外源多肽，或表达如此少的外源多肽以致于该培养物成为上述多肽的一种不经济来源。在某些情况下，其毒性作用太强以致当由强的基本启动子来启动表达时，新的转化细胞在选择性平板上不能增殖和形成克隆。通过应用一种可诱导启动子指导这类多肽的合成以避免其毒性作用。在啤酒酵母中存在大量可诱导基因。已明确特征化的4种可诱导遗传系统是半乳糖(GAL)应用基因、醇脱氢酶2(ADH2)基因、α-配对因子基因和pho5基因。
啤酒酵母中有5种编码负责利用半乳糖作为生长碳源的酶类的基因。GAL1、GAL2、GAL5、GAL7和GLA10分别编码半乳糖激酶、半乳糖透酶、磷酸葡糖变位酶的主要同工酶、α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶和尿苷二磷酸-半乳糖-4-表异构酶。在缺乏半乳糖的情况下，很难检测到这些酶的表达。如果细胞于葡萄糖中生长，然后向培养物中加入半乳糖，这三种酶在RNA转录水平被协同诱生至少1，000倍(GAL5除外，它只诱生了约5倍)。GAL1、GAL2、GAL5、GAL7和GAL10基因已经被进行分子克隆和测序。位于各自编码区5′端的调节和启动子序列已置于Lac2基因编码区附近。这些实验已定义出对于半乳糖诱生必需和足够的那些启动子和调节序列。
啤酒酵母也有3个各自编码一种醇脱氢酶(ADH)同工酶的基因。三种酶中之一的ADHⅡ使得啤酒酵母在氧化生长过程中能利用乙醇作为碳源。编码ADHⅡ同工酶的ADH2基因的表达可被葡萄糖进行降解物阻遏，以致于在发酵生长过程中存在0.1%(w/v)葡萄糖时，根本上不发生ADH2基因转录。在葡萄糖耗尽和存在非抑制性碳源时，ADH2基因的转录被诱导100～1000倍。已对该基因进行分子克隆和测序并且对那些转录消阻遏所必需和足够的调节序列和启动子序列进行了定义。
α配对因子是啤酒酵母中的一种性信息素，它为MATα和MATa细胞间配对所必需。该十三肽作为早期前信息素(prepopheromone)然后被导入粗面内质网，经糖基化和蛋白分解处理，最终从细胞中以成熟形式分泌出来。这一生化途径被认为是外源多肽的表达方式。该α配对因子基因已被进行分子克隆，其带有早期前引导序列的启动子已用于表达和分泌不同的多肽。同样，pho5基因也显示出可被低浓度磷酸所诱导，这一性质同样被用于在酵母中对外源蛋白进行生理性调节表达。
由于外源蛋白穿过了粗面内质网和高尔基体，这些外源蛋白可以进行N-键和O-键糖基化，α配对因子启动子仅在表型是α的细胞中具有活性。在啤酒酵母中有4个称为SIR的遗传位点，它们合成对于抑制其它正常静止(silent)复制a和α信息所需的蛋白。至少有一个这些遗传位点的基因产物中具有干扰这种抑制过程的温敏性(ts)损害。在该突变体中，于35℃生长可以取消这种抑制作用，产生a/α表型细胞，在这种细胞中α配对因子启动子是无活性的。当生长温度下降为23℃时，细胞表型恢复为α，使得其启动子变成有活性的。已经证明了带有tsSIR损害的菌株在调节多种外源多肽表达中的应用。
本发明的目的是提供形成含基本上减低了所获取糖含量颗粒的HBV表面蛋白。本发明的另外一个目的是提供一种在酵母宿主中生产形成颗粒且含有基本减低了所获取糖含量的HBV表面蛋白的方法。本发明的目的还在于提供一种抗HBV的疫苗，它包括含基本减低了所获取糖含量的HBV表面蛋白颗粒，可对由HBV或其它血清学与HBV相关的因子引起的疾病和/或感染进行主动和被动性预防治疗。本发明的目的还在于提供了一种大规模生长重组体宿主细胞和纯化重组HBV表面蛋白的条件。本发明的上述目的和其它目的将从下文所述中认识到。
HBV表面蛋白已在使蛋白质糖基化能力方面存在遗传性缺陷的重组体酵母宿主中高产表达，HBV表面蛋白在酵母细胞中表达导致了特征性颗粒的形成。这些颗粒在酵母细胞中形成时于颗粒内获取了酵母细胞的物质成分。应用“野生型”酵母宿主细胞，HBsAg颗粒内可获取大量的酵母细胞糖分。为了防止由含大量糖分的颗粒组成的HBV疫苗产生，从在糖基化蛋白能力有遗传缺陷的重组体酵母宿主中生产并纯化HBV表面蛋白。通过上述宿主生产的HBV表面蛋白形成的颗粒所含的糖分比野生型酵母细胞中生产的颗粒所含的糖分有实质性的减少。这些HBV表面蛋白作为疫苗可用于HBV相关性感染的治疗和/或预防，也可作为抗原用于免疫学诊断，而且减少了与自然产生的抗酵母抗体的反应。
图1为质粒pC1/1pGAL10HBsAg-tADH-1的示意图，该质粒含有控制HBsAgORF进行转录的pGAL10启动子，随后含有tADH1终止子以及可选择性标记物LEU2+。
本发明涉及一种制备HBV表面蛋白颗粒的方法，所说的颗粒所含有的获取糖分含量被大幅降低，并可用作抗HBV的疫苗。
Dane颗粒(血清型adw)被作为用于分离病毒ORFS的HBV核酸来源。本领域的技术人员很容易认识到，本发明将延伸到对来自HBV毒株或带有源于病毒遗传多样性的其它血清学反应性的相关病毒的核酸的应用。为了从天然存在于HB病毒体中的带缺口和缝隙的核酸形式中生成HBV基因组的共价闭环双链DNA，而应用了内源性多聚酶反应。分离DNA，再用EcoRⅠ完全消化，然后克隆到pBR322的EcoRⅠ位点，因此获得pHBV/ADW-1。筛选含有于前S区EcoRI位点呈环型置换形式的HBV基因组的重组质粒。通过纯化经EcoRI和AccI消化pHBV/ADW-1所得的0.8kbp片段，首先构建编码前S2区的55个氨基酸和S区的226个氨基酸的完整ORF;该片段编码的前S2+S多肽仅缺乏起始密码子、氨基端的3个氨基酸、羧基端的3个氨基酸和转录终止密码子。
合成寡核苷酸，并连接到上述片段上，使之变为含有一个10bp来自酵母的未翻译的5′侧翼序列的HindⅢ片段，并挑选完整的前S2+S ORF，以致于其终止密码子被直接连接到ADH1转录终止子的天然HindⅢ位点上，这样便产生了无任何额外插入碱基的纯天然性酵母源性连接。本领域的技术人员很容易认识到为了表达HBV表面蛋白和相关蛋白，可以用任何适宜的酵母活性转录终止子取代ADH1。
选择用于构建，ACAAAACAAA(SEQIDNO∶1)的5′侧翼序列，以与用于酵母基因GAP63(GAP)[Holland，J.Biol.Chem.，225，2596(1980)未翻译引导链(NTL)的序列相对应，它也是一种与GAP基因族相一致的序列。构建方式是在无任何额外碱基插入的情况下将NTL直接连接到前S2+S ORF的起始密码子上。因此，本领域专业人员很容易认识到，为了表达HBV表面蛋白，对NTL序列的选择将延伸到能产生合适表达水平的其它序列。
DNA序列分析揭示了2个碱基的取代，使得与由pHBpre SGAP347/19T的DNA编码的前S2+S序列的氨基酸有所不同[Valenzuela et al.，Biotechnology，3(4)，317-320(1985)]。为了评价两种构件中的相同多肽，通过位点诱变[Zoller et al.，Nucleic Acids Research 10∶6487-6500(1982)]来改变下列核苷酸替换HBV前S2+S的846bp ORF的碱基64位T代替C(编码苯丙氨酸而不是亮氨酸)和碱基352位C代替A(编码组氨酸而不是谷氨酰胺)。然后检验所编码的适用于最佳构件的氨基酸序列。本领域技术人员很容易认识到本发明并不仅限于上述序列，而是将延伸到编码具有HBV相关抗原性多肽的任何DNA序列。
用EcoRⅠ和StyⅠ消化后，将含有pUCI9和HBsAg编码区的3.3k bp DNA大片段从前S2编码DNA片段中分离开来，并用制备性琼脂糖凝胶电泳进行纯化。然后将一合成的DNA寡核苷酸与pUC19-HBsAg片段相连。该合成的DNA寡核苷酸含有5′ EcoRⅠ和3′StyⅠ粘末端以及紧随5′EcoRI位点的HindⅢ位点。此外，合成的DNA寡核苷酸含有HBsAg ATG密码子加上其9个上游核苷酸和包括StyⅠ位点的21个下游核苷酸。
该寡核苷酸重建了完整的HBsAg编码区，并且，通过HindⅢ消化它可从pUC19载体中完整地取出。
上述连结有合成DNA寡核苷酸的pUC19-HBsAgDNA片段被用来转化大肠杆菌。筛选那些具有完全重建的HBsAg编码区的重组质粒。从重组质粒中分离完整的HBsAg开放阅读架(ORF)，经过用HindⅢ消化，继而用制备性琼脂糖凝胶电泳来分离和纯化0.7kbp的HBsAgDNA，以备用来克隆到一个GAL10启动子表达载体中。
表达盒(pGAL10-tADH1)启动被插入到半乳糖诱导性GAL10启动子下游唯一的HindⅢ位点上的外源基因的表达。上述(带有HindⅢ末端)的HBsAgORF被连接到载体的HindⅢ位点上。将所说表达盒插入到大肠杆菌穿梭载体pC1/1(Beggs，同前述)的SphⅠ位点之间，再将该载体导入啤酒酵母CF52或CF54菌株中，并筛选被转化的克隆。
在诱变之后，用上述编码S或前S+S的片段构建一个如前文所述[Kniskern et al.，Gene，46∶135-141，(1986)]的表达盒，它的组成是(a)大小约为1.1kbp的GAP491启动子，(b)10bp酵母源性侧翼序列;(c)编码前S1+前S2+S的1230bp病毒ORF或编码前S2+S的846bp病毒性ORF或编码S的681bp病毒性ORF和(d)大小约0.4kbp的酵母ADH1终止子。
用三种不同的表达载体构建HBsAg表达盒。前述的GAP491启动子表达盒[Kniskenetal.，1986，Gene46，pp135-141]由约1.1kbp的甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子和位于pBR322骨架上约350bp的酵母醇脱氢酶(ADH1)终止子组成，在启动子和终止子之间有一个唯一的HindⅢ位点。实施例2中的HBsAgORF被连接到该唯一的HindⅢ位点上，通过限制性内切酶分析和Southern印迹反应来证实它的存在和方向。
另外，在上述构成中，可用(0.5kbp)GAL10启动子(Schultzetal.，1987，Gene，54，pp113-123)代替1.1kbp的GAP启动子，或者是用(1.25kbp)ADH2启动子(Knis-kernetal.，1988，Hepatology8.82-87)代替GAP启动子(参见图1)在每一种构成中，将含有特定启动子、HBsAg ORF和ADH1终止子的表达盒克隆到穿梭载体pC1/1(Beggs，同前文;Rosenberg，et al.，同前文)中，以产生酵母表达载体。然后如下文所述用该表达载体转化啤酒酵母。这些转化子构建后冷冻贮存。用于测定和以后的实验。亲本株CF52是这样获得的在YEHD完全培养基培养皿中混合α配对型菌株CZ5/LB347-1C(mnn9-，SUCZ-)和典型菌株2150-2-3(leu2-，adel-)使之配对。为了筛选二倍体，配对的菌株置于含2%蔗糖作为唯一碳源的leu-最低限度培养基中复制，在分离单个克隆以后，二倍体形成孢子，通过标准技术解析子囊。KHY-107菌株作为单个孢子被分离出来，其特征为Cir+，adel+，leu2-和mnn9-(通过Schiff染色技术)。
如Broach所述[Methods in Enzymology，101，Part C，pp307-325，(1983)]，从菌株KHY107(Cir+)获得KHY107(Cir0)。通过整合一个被破坏的ura 3基因使被修复的菌株成ura3-。使所得的菌株KHY-107ura3△生长于富足的培养基中，以累积自发突变，并筛选刀豆氨酸抗性突变体。通过互补试验，突变株CF55显示出canl-。GAL10pGAL4表达盒被融合到CF55的HIS3基因中(Methods in Enzymology，1990，185.pp297-309)产生终宿主菌株CF52(Mata leu 2-2，112ura 3△ canl his3△∶∶GAL10pGAL4-URA3，cir°)。这些转化子构建后冻存以备评估和以后的实验用。
将冻存的重组酵母生长于YEHD培养基中[Cartyetal.，J.IndustrialMicro.，2，117-121，(1987)]。等生长至稳定期，收集酵母细胞，制备细胞溶解物，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分辨，用抗体结合HBsAg进行免疫吸印。分析发现有一多肽的分子量约24KD，它与预计的SORF的翻译产物的分子量一致。而且重组酵母(而不是亲本)的溶解物经放免检测(AusriaR)为S阳性。对部分纯化的酵母溶解物进行电镜检查显示出高密度的HBsAg颗粒。
酵母源性启动子启始HBsAg和相关基因的转录。因此，本领域技术人员容易认识到，任何酵母活性启动子序列(例如包括但不限于GAL1，GAL10，ADH2，Pho5等)都可以替代GAP491启动子。本领域技术人员同样容易认识到应当使用一种合适的检测系统，例如免疫吸印或RIA或酶联免疫测定(EIA)以便检测HBsAg和相关多肽在该系统中的表达，从而得到获取最大产量的最佳培养物收集时间。
GAP491启动子已经用于在酵母中表达包括HBsAg在内的几种外源蛋白[Bitteretal.，Gene，32∶263-274，(1984);Wampleretal.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，826830-6834，(1985)]。基于我们以前表达HBcAg所达到的可溶性酵母蛋白的约40%的结果，我们用这一启动子在合适的酵母宿主细胞中驱动HBsAg和相关蛋白的表达。
本领域的技术人员容易认识到，为表达HBV表面蛋白对适宜酵母株的筛选包含了很广泛的选择范围。适宜的酵母株包括但不限于那些具有诸如蛋白酶缺陷及改变了糖基化作用能力这样一类遗传和表型特征的菌株。
为了控制和定义由重组酵母表面的HBV蛋白的糖基化作用，如前所述构建了啤酒酵母株CF52(Mataleu2-2，112ura3△canlhis3△∶∶GAL10pGAL4-ura3，cir°)。
用表达载体pC1/1pGAL10HBSAG-tADH-1转化CF52(Mataleu2-2，112 ura3△ canl his3△∶∶GAL10pGAL4-ura3，cir°)。在含1M山梨醇的最低限度培养基(leu-)中筛选重组克隆。这些克隆的转化子于17%的甘油中冻存。以备以后的评估和进一步的实验。
为了进行糖基化作用野生型对照，也用表达质粒转化菌株CF54，它是通过已建立的技术从CF52菌株中分离出来的，并且是MNN9+的一种回复变异体(因此它是进行糖基化作用的野生型
，但又与菌株CF52有相同的基因型)。已转化的克隆分离物于17%甘油中冻存用于以后的评估和进一步的实验。
将含有表达质粒的转化酵母的克隆置于leu-选择性琼脂培养皿上(含用于mnn9-转化子的1M山梨醇)，于30℃培养2-3天。将这些酵母转种到含有复合YEHD(Carty et al.，同前文)培养基(含0.1-1M山梨醇)和用于基于GAL10的质粒的2%乳糖的5-7ml培养物中，所得培养物于30℃通风培养12-18小时。再取上述培养物(至初始A600＝0.1)接种于含1M山梨醇和50ml复合YEHD培养基(下文称为YEHDS)的烧瓶中，子30℃摇育(350rpm)48-72小时，直到终A600为10-16。10A600单位样本分散到试管中，于2000xg离心10分钟收集酵母细胞，所得样本或直接用于检测或于-70℃冻存。检测时，将收集到的细胞团丸重新悬浮于含2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的4ml磷酸盐缓冲液(PBS)，再移至1.5ml Eppendorf管中。通过下列步骤破碎酵母细胞1)加入200～300mg洗过的玻璃珠(0.45mm)，于漩涡混合器上搅动15分钟，2)加入TRITONX-100，使其浓度为0.5%，3)，在漩涡混合器上搅动2分钟，4)于4℃培养10分钟。去掉细胞碎片和玻璃珠，用Lowry法检测上清液中的蛋白质(Lowry et al.，J.Biol Chem.193，265，(1951)]，并使用RIA特异性检测前S2+S[Hansson et al.，Infect.Immunol.26;125-130，(1979);Machida et al.，Gastroenterology 86∶910-918，(1984)]或S(AUSRIAR)。
将含表达质粒的转化酵母mnn9-的克隆置于含1M山梨醇的(leu-)选择性琼脂培养皿上于30℃培养2-3天。这些酵母被接种到5-7ml复合YEHDS培养基(加入了用于GAL10启动子质粒的2%半乳糖)中，孵育来自上述培养(初始A600＝0.1)的培养物，于30℃摇育(350rpm)48-72小时，直到最终A600达10-16。10A600单位的三份样本分散于试管中，于200xg离心10分钟收集酵母细胞。所得样本或如上所述直接用于检测或于-70℃冻存。
对来源于mnn9-表型宿主细胞的上述所有重组子克隆的多肽进行免疫吸印分析，结果都显示出了有一条分子量约24KD的条带。
对于重组蛋白而言，定性和定量的糖基化作用方式是宿主细胞的一种功能，并很大程度地依赖于宿主细胞的种类，且在同种细胞中又与细胞系有关。因此，本领域技术人员容易认识到，除了能在糖基化作用途径中可鉴定出酶突变的啤酒酵母之外，对宿主菌株的选择将延伸到种和细胞系。本领域技术人员容易认识到对啤酒酵母宿主菌株的选择将延伸到所有能在糖基化作用途径中可鉴定出酶突变的菌株。
然后筛选有HBsAgDNA存在和p24HBsAg表达的转化克隆。细胞在YEHDS培养基(还含有用于GAL10启动子质粒的半乳糖以在葡萄糖缺失后诱导表达)中生长。制备细胞溶解物，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，并通过Western印迹反应转印至硝酸纤维素膜上。根据p24产物仅存在于被诱导的转化子中，以及它与p24抗血清的反应性发现，p24产物对S蛋白具特异性。筛选出这些克隆中的一个作进一步分析。而且，转化子而不是亲本啤酒酵母的溶解物经放免测定为HBsAg阳性。
这便使得表达载体在啤酒酵母中使用GAL10启动子指导HBsAg及相关表面蛋白的表达的应用显得引人注目。本领域的技术人员容易认识到，可调节的GAL10启动子，或者是功能上难以区分的GAL1、GAL2、GAL7或MEL1启动子能使重组啤酒酵母培养物的生长在重组蛋白的合成启动之前就递增到一种生产规模量，从而对宿主细胞的负作用减小到最低程度。而且，本领域技术人员容易认识到，一种含有另外其他调节启动子的表达载体可用于指导含S和含前S肽的表达，其中的调节启动子包括但不限于ADH2和α配对因子，它们可通过其它方式被生理性诱导或抑制。而且，本领域专业人员容易认识到，强度低于GAPDH的基本启动子包括但不限于CYC1，能控制含S和前S多肽的表达使得细胞蛋白的百分含量较低，这样便消除了过度表达的生理学付作用。本领域技术人员容易认识到，应当应用一种合适的测定系统，例如Western印迹反应或放免测定，以便检测含S和前S多肽在该系统中的表达，从而为获得最大产量而选择最佳培养物收集时间。
用一种结合了能识别HBsAg特定的山羊抗体的免疫亲和柱从转化的啤酒酵母中纯化S及S相关蛋白。经放免测定，洗脱物为HBsAg阳性，在电镜中洗脱物也具有特定形态。这种含有HBsAg和前S抗原或仅含HBsAg的特定形态物质作HBV疫苗和诊断制剂是有效的。
培养和收集被编码HBV表面蛋白或其变异体的表达载体转化的酵母细胞。如果需要的话，可以用缓冲溶液，如PBS洗涤细胞，形成通常用于-70℃冻存的细胞糊，再把细胞贮存起来。
HBsAg及相关蛋白的纯化通常是这样开始的将一批新鲜或冷冻细胞糊悬浮于缓冲液，最好是TRIS中，它具有约8.5-约11.0的高pH值范围，最好是约10.5(缓冲液也可含合适的蛋白酶抑制剂)。然后破碎细胞，最好用机械方法。已发现温和的玻璃球破碎法不适于用来进行递增。因为高压匀质器的操作快速且有效，所以优选它(约10，000-20，000psi，用Gaulin或Stansted匀质器)破碎细胞。
破碎酵母细胞产生粗提取物。然后调节粗提物的pH值。pH值调至8.0-11.0的范围，最好是10.5。
此时最好向粗提物中加入一种洗涤剂。洗涤剂的加入将使酵母细胞膜易于与不需要的细胞碎片分开。已表明，前S2+S蛋白以及其它形式的表面蛋白可与酵母细胞膜相结合。可选用许多中性或非离子型洗涤剂，包括但不限于Triton-N系列、Triton-X系列、BRIJ系列、TWEEN系列或EMASOL系列、脱氧胆酸盐、辛糖吡喃糖苷或NONIDET-Np-40。两性离子型洗涤剂如CHAPS或CHAPSO也是有用和适宜的制剂。
如果应用洗涤剂的话，优选的洗涤剂为浓度约0.5%的TritonX-100。必须强调的是，本发明的方法并不要求在这一步骤使用洗涤剂，选用洗涤剂是选择性的。
如果在裂解过程中不存在蛋白酶抑制剂，提取物可经加热处理。热处理在超过一定温度范围和达到一定处理时限时是有效的。所用的有代表性的温度范围是45～60℃，优选50℃。热处理时间的典型范围是20-40分钟，优选30分钟。在适宜的容器中对提取物进行热处理，将容器浸入热水浴中或使用热交换器。然后将物质冷却到约10℃，最好将它置入冰水浴中或使用热交器进行冷却。本领域技术人员容易认识到，根据本发明的方法，进行热处理和去除碎片的步骤的顺序可以颠倒而不会对本过程的结果产生明显的影响。另外，所有的酵母细胞也可在中性pH的缓冲液中加热、破碎，并且可如上所述加入洗涤剂。
必须从热处理粗提物中去除细胞碎片以防在其后的纯化步骤中发生物理阻塞。通过离心、微量过滤或滤过可去除碎片，产生洁净的提取物。离心和微量过滤是最优选的方法。可以在不同离心力在不同时间范围内进行离心。在约3000xg的条件下于4℃离心15分钟已经足够。在离心前稀释提取物也将有益于降低粗酵母细胞提取物的粘性。稀释将不会改变此过程中的任何后续步骤。
微量过滤所具有的优点在于滤过和透析同时进行。几种类型的微量过滤单位适用于该步骤，例如KROSFLO(MicrogonInc.)或任何种类的中空纤维柱(Amicon或A/GTechnology)。优选的微量过滤方法是将提取物通过ProstakDurapore(Millipore)膜，板、和框架微量过滤单位，孔径约0.1-0.2微米，内向压力约2-7psi，所用缓冲液由大约0.1MTris，pH约10.4，和约0.1%TritonX-100组成。
得自离心的上清液或微量过滤的滤液在进行本过程的下一步骤之前要进行浓缩。可以通过几种方法来达到浓缩目的，所说方法包括但不限于透析、过滤、冷冻干燥、超滤和分离过滤。本发明的优选浓缩方法是将净化的提取物通过一个能截住分子量为105的物质的中空纤维超过滤系统。净化提取物的体积对于进行微量过滤产物来说减少了约6.5倍，而对于稀释的离心产品来说减少了约2倍，因而产生了浓缩的滞留物。在浓缩之后，对滞留物进行分离过滤(diafiltration)以进一步去掉较低分子量的污染物。使用一个截住105分子量的中空纤维系统进行分离过滤。(diafiltration)如果加入了TritonX-100，可用几种常规方法去除它，这些方法包括但不限于透析、加入某种特定有机溶剂、冷冻、层析分离、与可特异性结合洗涤剂的凝胶或树脂接触，例如Extractogel(Pierce)和XAD树脂(Romicon)。本发明优选的去掉TritonX-100的方法是将含有TritonX-100的热处理的提取物通过XAD-2或XAD-4树脂柱(聚苯乙烯二乙烯苯)。热处理的提取物通过XAD柱于4℃循环10小时，然后收集于一合适的容器中，例如可密闭的玻璃瓶。
如果细胞是在高pH缓冲液中破碎，热处理的提取物，或含有蛋白酶抑制剂的提取物的pH值要调节到约7.0-7.9，优选的pH值是7.7。根据本发明的方法，在高pH值下对提取物热处理后，将其pH值调至约7.7将使包膜蛋白极易于吸附到在后续步骤中用到的大孔硅胶上。在去除TritonX-100步骤之前对热处理提取物进行pH值调整不会影响本过程的产量。因此，根据本发明的方法本领域技术人员将容易认识到进行pH值调整和TritonX-100去除步骤顺序可以颠倒而不会对本过程的结果产生明显影响。
这样，HBsAg易于从污染物中分离出来，产生基本纯化的HBsAg。去除污染物的最好方法是将HBsAg吸附到大孔硅胶上。本发明最优选的方法是将HBsAg吸附到孔径大小约1000～1500埃和硅胶颗粒为30～130微米(Amicon)的大孔硅胶上。表面蛋白易于进入硅胶孔内而滞留，酵母细胞蛋白污染物则容易被冲洗掉。
大孔硅胶对表面蛋白的吸附可以层析法或以非层析、不连续方式进行。将调整了pH值的提取物通过柱层析装置中的大孔硅胶柱床进行层析吸附。典型情况下，将约1升热处理的提取物以约200ml/小时的流速，用于一个含300ml(干重大约100g)大孔硅胶颗粒的5cm套层柱装置中。
向大孔硅胶上进行非层析吸附的典型做法是将热处理的提取物与硅胶于一合适容器，例如一个可密闭的玻璃瓶中混合。优选的方法是向玻璃瓶中约1升的热处理提取物加入300ml大孔硅胶，并经连续混合接触。尽管不同的时间和温度都适宜吸附，但优选的吸附条件是在约4-8℃持续1.5小时。
可用非层析法把未被吸附的物质从吸附了表面蛋白的硅胶中冲洗掉，或者如前文所述将硅胶倒入柱装置中进行层析吸附。分批冲洗是使热处理的提取物从大孔硅胶中排出，并加入几体积不会导致被吸附的HBsAg释放到硅胶表面的缓冲液。优选的缓冲液是PBS。排冲硅胶，冲洗步骤重复3-5次。
将PBS以约200ml/小时的流速通过硅胶对吸附有表面蛋白的硅胶进行层析性冲洗直到在280nm处出现恒定性的冲洗干净显示(extinction)。
用pH值为约8.5-9.0的缓冲液从冲洗过的大孔硅胶中洗脱HBsAg。用含约0.05M硼酸盐的缓冲液(pH值约8.7)能对表面蛋白进行很好地吸收。在一个较宽的范围内升高温度有助于HBsAg的吸收，吸收优选的温度是55℃。
进行非层析解吸是通过将1200ml0.05M硼酸盐缓冲液(pH8.7)与约700ml冲洗过的吸附了HBsAg的大孔硅胶相混合。吸收持续约25分钟。然后收集洗脱液。解吸步骤重复2次，冷却洗脱液。
将含冲洗过的硅胶的套层柱加热至55℃进行层析解吸。0.05M硼酸盐缓冲液(pH8.7)加热至55℃，然后以500ml/小时的流速应用到柱上。收集并冷却洗脱液。洗脱液的体积通常与应用到大孔硅胶中的热处理的提取物的体积大致相等。
通常需要对洗脱的HBsAg进行浓缩。优选的浓缩方法是应用一种0.05M硼酸盐缓冲液(pH8.7)将洗脱液通过截住105分子量的中空纤维双向过滤系统。被洗脱的表面蛋白的体积与应用于该系统的体积相比减少了16倍。如果需要的话，可对双向过滤的滞留物用微量过滤法除菌。
用Dubois等人的方法(Dubois，M.etal.，Anal.Chem.，28，p350，1956)确定HBsAg中的糖含量。该方法总的原理是单糖、寡糖、多糖及其衍生物，包括不含或可能不含还原基团的甲基醚，在经酚和浓硫酸处理后生成桔黄色。在恒定的酚浓度下产生的颜色深浅与存在的糖量正比例。
为了确定1份HBV表面蛋白样本中的糖含量，将含10-70μg蛋白的1ml溶液加到检测管中。制备一系列标准糖样和空白样本。向每一试管中加入1ml 0.5%的苯酚溶液，混匀，再分别加入5ml 96%的硫酸溶液，混匀。试管于室温下静置10分钟，混匀，再于25-30℃放置20分钟。用分光光度计分析样本(A490为己糖及甲基化己糖，A480为戊糖、戊糖酸及其甲基化衍生物)，与标准糖管进行比色确定HBsAg样本中的糖含量。
用上述方法分析在“野生型”重组酵母细胞(CF54)中产生的HBsAg和在CF52重组酵母细胞中产生的HBsAg两者中的糖含量。基于这些结果，用样本中的糖的微克数除以蛋白的微克数计算出每份样本中糖和蛋白含量的比值。所计算出的比值表明产生于mnn9-重组酵母细胞的HBsAg中的糖含量始终是产生于重组“野生型”酵母细胞的HBsAg糖含量的1/10。这些结果说明，与由“野生型”酵母细胞产生的HBsAg相比，由mnn9-突变酵母细胞产生的HBsAg所含的糖量有了很大的降低。
下面的实施例是说明本发明的而不是限制本发明。在下面实施例中所公开的每一篇文献都引入本文作为参考文献。
实施例1HBVDNA克隆到pBR322从人血浆中(携带者)分离和纯化HBYDane颗粒(adw血清型)，根据Landers等人的方法(J.Virology23，368-376，(1977)]和Hruska等人的方法[J.Virology，21，(1977)]由Dane颗粒中的内源性多聚酶合成双链DNA。在用溶于SDS中的蛋白酶K消化后，继而用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀分离DNA。用EcoRⅠ消化HBV基因组DNA，产生一个单一的3.2kbp片段，它被克隆到pBR322的EcoRⅠ位点形成pHBV/ADW-1。通过EcoRⅠ消化，向硝酸纤维素膜上Southern印迹转移以及与[32p]-标记的特异性寡核苷酸探针杂交来证实HBV DNA的存在。
实施例2前S2+S基因克隆到pGAP-tADH-2表达载体用EcoRI和AccI消化(实施例1中的)质粒pHBV/ADW-1，经制备性琼脂糖凝胶电泳纯化所得的0.8kbp片段。同样，用EcoRⅠ和BamHⅠ消化pUC质粒，再经制备性琼脂糖凝胶电泳纯化得到线性载体。
为了重建前S2+S ORF的5′部分合成了一对寡核苷酸，它构建的ORF从EcoRⅠ位点上游的ATG通过10bp NTL序列和一个HindⅢ位点直到一个EcoRⅠ位点末端。这些寡核苷酸的序列如下AATTCAAGCTTACAAAACAAAATGCAGTGG(SEQIDN0:4)1102030GTTCGAATGTTTTGTTTTACGTCACCTTAA(SEQIDN0:3)1102030为了重建前S2+S ORF的3′部分合成了第二对寡核苷酸，它构成的ORF从AccⅠ位点通过一个翻译终止子和一个HindⅢ位点直到BamHⅠ位点末端。这些寡核苷酸的序列如下ATACATTTAAGCTTG(SEQIDN0:4)11015
TGTAAATTTCGAACCTAG(SEQIDN0:5)101018将寡核苷酸对退火，然后连接到经EcoRⅠ-BamHⅠ消化的pUC载体上。用制备性琼脂糖凝胶电泳纯化所得的载体(2.8kbp)。将前文所得的0.8kbp EcoRⅠ-AccI片段连接到该载体上。用限制性内切酶分析和Southern印迹分析来证实前S2+S ORF的存在及其方向。DNA序列分析[Sanger et al.，1977]表明发生了2个碱基的替换，使得氨基酸不同于由质粒HBpreSGAP347/19T的DNA编码的序列。为了评估这两种组成的相同多肽，用位点诱变改变下列取代，所说的这些取代是碱基64的T替换C(编码苯丙氨酸而不是亮氨酸)，碱基352的C替换A(编码组氨酸而不是谷氨酰胺)[zoller and Smith 1982，Nucleic Acid Research，10，p6487-6500]。
构建含HBsAg编码区而不含前S2编码区的质粒过程如下用EcoRⅠ和StyⅠ限制性内切酶消化(前文已述及的)质粒pUC HBpreS2+S。从前S2编码DNA中分离出含pUC和HBsAg编码区的大DNA片段(3.3kbp)，并用制备性琼脂糖凝胶电泳进行纯化。将一合成的DNA寡核苷酸对连接到pUC HBsAg片段上，其中合成的寡核苷酸对的序列如下AATTCAAGCTTACAAAACAAAATGGAGAACATCACATCAG110203040GATTC(SEQIDN0:6)45
GTTCGAATGTTTTGTTTTACCTCTTGTAGTGTAGTCCTAA110203040GGATC(SEQIDN0:7)45这一合成的寡核苷酸对含有5′EcoRⅠ和3′StyⅠ粘末端，并提供了一个紧随5′EcoRⅠ位点之后的HindⅢ位点。此外，合成的寡核苷酸对含有HBsAgATG密码子、其上游10bp的非翻译的引导序列以及包括StyⅠ位点在内的21个下游核苷酸。
该寡核苷酸对重建了HBsAg的完整编码区，它可通过HindⅢ的消化从以pUC为基础的载体中完整地提取出来。
用上述连接了DNA寡核苷酸对的pUC-HBsAgDNA载体转化大肠杆菌。筛选具有完整的重建HBsAg编码区的重组质粒。用HindⅢ消化重组质粒从中得到完整的HBsAg开放阅读架(ORF)，再经制备性琼脂凝胶电泳分离和纯化(0.7kbp)HBsAgDNA以用于克隆到一种表达载体中的HBsAgORF。
实施例3HBsAgORF克隆到不同表达载体中三种不同的表达载体用于构建HBsAg表达盒。前述的GAP491启动子表达盒由约1.1kbp的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子和在pBR322骨架上的约350bp的酵母醇脱氢酶Ⅰ(ADH1)终止子组成，在启动子和终止子之间有唯一的HindⅢ位点。得自实施例2的HBsAgORF连接到该唯一HindⅢ位点。用限制性内切酶分析和Southern印迹分析来证实HBsAgORF的存在及其方向。
另外，在上述构成中，(0.5kbp的)GAL10启动子(Schultzet，al.，1987，Gene，54，p113-123)可代替1.1kbp的GAP启动子，或者是用(1.25kbp的)ADH2启动子(Kniskernetal.，1988，Hepatology，8，82-87)代替GAP启动子(参见图1)。
在每一种构成中，将含有特定启动子、HBsAgORF和ADH1终止子的表达盒克隆到穿梭载体pC1/1(Beggs，同前文;Rosenberg，etal.，同前文)中，产生酵母表达载体，然后如下文所述用该表达载体转化啤酒酵母。
实施例4酵母啤酒酵母CF52(mnn9-)突变酵母株的构建构建酵母啤酒酵母株KHY107(Cir+，adel+，leu2-和mnn9-)的过程如下在YEHD完全培养基培养皿中混合α配对型菌株CZ5/LB347-1C(mnn9-，SUCZ-)和典型菌株2150-2-3(leu2-，adel-)使之配对。为了筛选二倍体，配对的菌株置于含2%蔗糖作为唯一碳源的leu-最低限度培养基中复制。在分离单个克隆以后，二倍体形成孢子，通过标准技术解析子囊。KHY-107株以单个孢子被分离出来，确定其特征为Cir+，adel+，leu2-和mnn9-(用Schiff染色技术)。
如Broach所述[Methods in Enzymology，101，Part C，p307-325，(1983)]，KHY107(cir0)是从菌株KHY107(Cir+)衍生而来。通过整合一个被破坏的ura3基因，使被处理的菌株成为ura3-。所得的KHY-107ura3△菌株生长于富足的培养基中以积累自发突变，筛选刀豆氨酸抗性的突变体。通过互补性试验证实突变株CF55是Canl-。GAL10pGAL4表达盒被整合到CF55的HIS3基因中(MethodsinEnzymology，1990，185，p297-309)产生终宿主菌CF52(Mataleu2-2，112ura3△canlhis3△∶∶GAL10pGAL4-URA3，Cir°)。
实施例5HBsAg向CF52 mnn9--突变酵母株中的转化以及种子构建用实施例3所述的质粒pC1/1 pGAL10HBsAg-tADH-1转化啤酒酵母株CF52。在最低限度的培养基中(leu-，含1M山梨醇)筛选克隆子，所构建的克隆株于17%的甘油中冻存，并根据下文所述进行评估。
实施例6酵母CF52(mnn9-)中位于GAL10启动子之后的HBsAg基因的表达和生长将含有实施例5所述表达质粒的酵母克隆置于含1M山梨醇的leu-选择性琼脂培养皿中，于30℃培养2-3天。用5-7ml复合YEHDS(YEHD+1M山梨醇)接种这些酵母，所得培养物于30℃通风培养12-18小时。用含50ml YEHDS+2%半乳糖培养基的烧瓶接种上述培养物(起始A600＝0.1)，于30℃摇育(350rpm)72小时直到终A600为10-16。10A600单位的样本分散于试管中，于2，000xg离心10分钟收集酵母细胞。所得细胞团丸或直接用于检测，或贮存于-70℃以后备用。在检测时，细胞团丸被重新悬浮于含2mM PMSF的0.4ml磷酸盐缓冲液中。经下述步骤破碎酵母细胞1)加入200-300mg被洗过的玻璃珠(0.45mm)，2)于漩涡混合器上搅动15分钟，3)加入Triton X-100，使其浓度为0.5%(v/v)，4)于漩涡混合器上搅动2分钟，5)于4℃放置10-15分钟。于13.000xg离心10分钟去除细胞碎片和玻璃珠。移出净化的上清液，用Lowry法[Lowry et al.，J.Biol.Chem.193.265(1951)]进行蛋白分析。用(AUSRIAR)测定法(Abbott)分析HBsAg。有代表性的检测结果如下所示表1P24水平样本AUSRIA,ug/mg蛋白细胞破碎(免疫吸附)摇育烧瓶mnn9-突变株(0.55,0.61,0.53)玻璃珠+++野生型(MNN9+)(1.8)玻璃珠+实施例7在发酵罐中大规模培养可产生HBsAg的啤酒酵母(mnn9-)将冻存的重组酵母培养物接种到含1M山梨醇的leu-培养皿中。把培养皿倒置于28℃孵育2-3天。将培养皿中的生长物重新悬浮于YEHDS中，然后转移至含500ml YEHD S和2%半乳糖的2升Erlenmeyer烧瓶中。该烧瓶在一个可控环境的摇床孵育箱中以350rpm于28℃孵育18-22小时。然后将这些种子培养物接种到生产阶段的容器中。
将来自1个或多个烧瓶中的种菌(1-5% V/V)转移到分别含有10升或200升YEHDS的16升或250升发酵罐。16升发酵罐在500rpm、5升/分通气和28℃条件下运行，250升发酵罐以160rpm、60升/分通气和28℃的条件下运行。在用种子培养物接种40-46小时后收集发酵罐。获取15.0A660单位的光密度值。收集过程包括用中空纤维过滤装置浓缩然后用缓冲盐溶液洗涤细胞。细胞悬浮液用于如下所述的检测或冻存于-70℃以备进一步的处理和分析。
用玻璃珠(0.45-0.52mm)在150ml Eppendorf管中破碎20%洗涤过的细胞悬浮液(0.6ml)小样本。加入PMSF(6.5μl的200mM贮存液)作为蛋白酶抑制剂。破碎后从小管中取出等份试样冻存于-70℃用于免疫吸印分析。加入Triton X-100重小管中的剩余样本浓度为0.5%，快速混合样本，再于4℃培育20-40分钟。通过离心去除细胞碎片，并检测净化的细胞提取物中的抗原(AusriaR)和蛋白质(Lowry)。
实施例8用免疫亲和层析纯化具一定形态的S蛋白如实施例5所述构建的重组啤酒酵母生长于烧瓶或发酵罐中。经过微量过滤以Amicon DC-10单位收集酵母细胞，将细胞悬浮于30ml缓冲液A中
，在Stansted压力孔中通过7个通道于7.5-85磅/呎2的压力破碎细胞。用120ml缓冲液A稀释破碎细胞的悬液(细胞湿重31mg)，再加入终浓度0.5%(w/v)的Triton X-100，在4℃、10，000xg离心20分钟以净化上述悬液。倾析出净化的液体培养基，与结合了抗HBsAg抗体的Sepharose 4B[McAleer et al.，Nature 307∶178(1984)]一起于4℃温育19小时，使抗原吸附到树脂的表面。在温育之后，将悬浮液升至室温用以所有的后续步骤，并在真空中脱气15分钟。将脱气的悬浮液倒入2.5×40cm的柱中。在柱被完全填充之后，用缓冲液A冲洗掉未结合的蛋白质。用溶于缓冲液A中的3M KSCN洗脱抗原。对含抗原的馏份用0.007M Na2HPO4，pH7.2，0.15M NaCl于4℃进行透析，收集透析的馏份形成在20ml馏分中含1.08mg蛋白的透析亲和池(Dialyzed Affinity Pool)。用5.6ml 0.006M Na2HPO4，pH7.2，0.15M NaCl稀释取自透析亲和池中的16ml样本至40mcg/ml。该产物通过Millex-GV0.22μ膜过滤进行除菌。用AusriaR反应性检测HBsAg来证明透析亲和池中产物的特性。
表Ⅱ样本AUSRIA,ug/Mg/蛋白破碎细胞发酵罐mnn9-(1.13,1.10,1.06)玻璃珠mnn9-(3.1,4.4)Manton-Gaulin野生型(3.3)Manton-Gaulin实施例9大规模纯化重组HBsAg约250g产生重组S蛋白的冻存细胞糊悬浮于约1500ml磷酸盐缓冲液(PBS)中得到湿重量/体积为17%。通过水浴将细胞加热至45℃。细胞在45℃维持15分钟，然后置于冰上冷却至10℃。然后经Gaulin匀质器的两个通道破碎细胞。
在均化作用之后，加入10%TritonX-100至终浓度0.3%，并进行混合约15分钟。然后于3，600xg在4℃离心细胞提取物20分钟，收集上清液。
将上清通过一个含约200gXAD-2树脂的柱子以去除TritonX-100。流出液直接流过一个含约150g大孔硅胶的柱子，其中硅胶孔径大小为约1500 ，颗粒大小约50μm。所用的柱直径为5cm(Pharmacia)，其流速为约200ml/小时。
用PBS冲洗硅胶柱，直到A280回复至基线。
首先用冷的硼酸盐缓冲液(50mM，pH8.7，4℃)以500ml/小时的流速从硅胶柱中洗脱S蛋白，直到观察到A280的上升。一旦A280开始上升，即将硅胶柱加热到55℃，并把55℃的硼酸盐缓冲液以500ml/小时的流速过柱。在冰上收集含S蛋白的洗脱物(约1升)。使用一个能截住105分子量的中空纤维分离滤过单位，以50mM硼酸盐缓冲液(pH8.7)进行分离过滤将该洗脱物浓缩至200ml。用0.2μm滤器过滤S蛋白，并贮存S蛋白。经Western blot分析观察发现，该产物是稳定的，没发生明显的降解。
实施例10测定重组HBV表面蛋白的糖含量使用Dubois的方法[Dubois，M.etal.，Anal.Chem.，28，p350，1956]确定重组HBV表面蛋白中的糖含量。该方法的一般原理是，单糖、寡糖、多糖及其衍生物，包括不含或可能不含还原基团的甲基醚在与苯酚和浓硫酸反应之后产生桔黄色。在恒定的酚浓度下所产生的颜色深浅与所存在的糖含量成正比例。
为了确定产生于野生型酵母株和mnn9-酵母中的HBsAg中的糖含量，将含10-70μg蛋白的溶液1ml置于试管中。制备含不同糖量的一系列糖标准物和空白样本。向每只试管中加入1ml 5%的酚溶液，混匀试管，然后加入5ml 96%的浓硫酸，再混匀。试管于室温下温育10分钟，混匀后，再于25-30℃温育20分钟。用分光光度计检读样本(A490为己糖和甲基化己糖，A480为戊糖、戊糖酸及其甲基化衍生物)，通过与糖标准物相比较确定HBV表面蛋白样本中的糖含量。
基于这些结果，用样本中糖的毫克数除以蛋白的毫克数计算出每个样本中糖含量与蛋白含量的比值，其结果如下所示HBsAg中的糖与蛋白的比值酵母菌株糖/蛋白mnn9-0.05进行糖基化作用的野生型0.56(MNN9+)所计算出的比值表明，产生于mnn9-重组酵母细胞中的HBsAg中的糖含量始终是产生于重组“野生型”酵母细胞的HBsAg糖含量的1/10。这些结果说明，与“野生型”酵母细胞生产的HBsAg相比，mnn9-突变酵母细胞产生的HBsAg所含的糖量大大减少。
序列单(1)概述(ⅰ)申请人Kniskern，P.J.
Hagopian，A.
(ⅱ)发明名称减少了宿主糖含量的乙型肝炎病毒表面蛋白(ⅲ)序列数9(ⅳ)通讯地址(A)地址Merck&Co.，Inc(B)街道P.O.Box2000(C)城市Rahway(D)州NewJersey
(E)国家US(F)邮政编码07065-0900(ⅴ)计算机可读形式(A)储存类型Floppy盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentinRelease＃1.0，Version＃1.25(ⅵ)目前的申请资料(A)申请号无(B)申请日无(C)分类无(ⅷ)代理人情况(A)姓名Pfeiffer，HesnaJ.
(B)登记号22，640(C)查询号18346(ⅸ)通讯情况(A)电话(908)594-4251(B)电传(908)594-4720(2)有关SEQIDNO∶1∶的资料(ⅰ)序列特征(A)长度10bp(B)类型核酸(C)链数单(D)拓扑线性
(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶1∶ACAAAACAAA10(2)有关SEQIDNO∶2∶的资料(ⅰ)序列特征(A)长度30bp(B)类型核酸(C)链数单(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶2∶AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGCAGTGG30(2)有关SEQIDNO∶3∶的资料(ⅰ)序列特征(A)长度30bp(B)类型核酸(C)链数单(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶3∶GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA30(2)有关SEQIDNO∶4∶的资料(ⅰ)序列特征(A)长度15bp
(B)类型核酸(C)链数单(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶4∶ATACATTTAA GCTTG15(2)有关SEQIDNO∶5∶的资料(ⅰ)序列特征(A)长度18bp(B)类型核酸(C)链数单(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶5∶TGTAAATTTC GAACCTAG18(2)有关SEQIDNO∶6∶的资料(ⅰ)序列特征(A)长度45bp(B)类型核酸(C)链数单(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶6∶AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGGAGAAC
ATCACATCAG GATTC45(2)有关SEQIDNO∶7∶的资料(ⅰ)序列特征(A)长度45bp(B)类型核酸(C)链数单(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶7∶GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGTGTAGTCCTAA GGATC45(2)有关SEQIDNO∶8∶的资料(ⅰ)序列特征(A)长度29bp(B)类型核酸(C)链数单(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶8∶AATTGTCGAC AGCTAGCTGA ATTCCCGGG29(2)有关SEQIDNO∶9∶的情况(ⅰ)序列特征(A)长度29bp(B)类型核酸
(C)链数单(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶9∶AGCTCCCGGG AATTCAGCTA GCTGTCGAC29
权利要求
1.一种用于生产重组多肽和蛋白质的真核表达系统，其生产的重组多肽和蛋白质所含的宿主细胞糖或糖蛋白含量大大降低。
2.权利要求1的表达系统中的真核宿主是酵母。
3.权利要求2的表达系统，其中的酵母宿主是啤酒酵母。
4.权利要求1的表达系统，其中的重组多肽或蛋白质是一种乙型肝炎病毒多肽或蛋白质。
5.权利要求4的表达系统，其中的乙型肝炎病毒多肽或蛋白质是一种包膜多肽或蛋白质。
6.权利要求5的表达系统，其中的乙型肝炎病毒多肽或蛋白质是HBsAg。
7.一种乙型肝炎病毒表面蛋白，它形成含有大幅度降低了获取性糖或糖蛋白含量的颗粒。
8.根据权利要求7的乙型肝炎病毒表面蛋白，它是由存在蛋白质糖基化遗传性缺陷的重组酵母细胞产生的。
9.根据权利要求8的乙型肝炎病毒表面蛋白，其中酵母细胞的遗传性缺陷存在于mnn9基因。
10.权利要求7的乙型肝炎病毒表面蛋白，其中纯化的表面蛋白中糖与蛋白的比值低于0.5。
11.一种用于人类的抗乙型肝炎病毒的疫苗，它包括一种可形成获取糖或糖蛋白含量已大幅度减少了的颗粒的乙型肝炎病毒表面蛋白。
12.根据权利要求5的疫苗，它由存在蛋白质糖基化遗传性缺陷的重组酵母细胞产生。
13.根据权利要求12的疫苗，其中的遗传性缺陷存在于mnn9基因。
14.根据权利要求11的疫苗，其中的表面蛋白中糖与蛋白的比值低于0.5。
15.一种免疫诊断制剂，含有乙型肝炎病毒蛋白，该乙型肝炎病毒蛋白形成的颗粒含有的宿主细胞糖或糖蛋白含量已大大减少，并且与天然产生的抗酵母抗体的反应性也被减少。
16.根据权利要求15的免疫诊断制剂，其中的纯化表面蛋白中糖与蛋白的比值低于0.5。
全文摘要
为了生产含有大大降低了获取糖含量的颗粒形式的乙型肝炎病毒(HBV)表面蛋白，在缺乏蛋白质糖基化能力的重组酵母宿主中表达编码HBV表面蛋白的DNA。这些HBV表面蛋白显示出由HBV病毒体包膜蛋白开放阅读架的S区进行遗传编码的抗原性位点，并且与由野生型酵母细胞产生的HB
文档编号A61P31/12GK1067680SQ92104290
公开日1993年1月6日 申请日期1992年4月28日 优先权日1991年4月29日
发明者P·J·尼斯肯, A·哈戈皮安 申请人:麦克公司