专利名称：重组dna衍生的霍乱毒素亚基类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及霍乱外毒素类似物亚基的重组表达以及基于这些类似物的疫苗。更具体地说，对外毒素的遗传工程修饰提供了具有引发保护性反应之能力，并且有较低或基本上没有催化活性的霍乱毒素的类似物，从而提供霍乱疫苗的反应原性。
术语“霍乱”是指由致病因子霍乱弧菌(Vibriocholerae)引起的且最常见于卫生条件差的地区的疾病。迄今在世界上的许多地区霍乱仍有很高的发病率和死亡率(1，2)。经验表明，染患该病通常可长期保护继后接触其病原因子的个体(3)。因此，已在发展能产生相似保护作用之疫苗方面作了相当大的努力。已产生了亲代全细胞霍乱疫苗，但对于某些病人特别是少年儿童，因存在很大的患该病危险而上述疫苗不再适用(1)。
如许多其他传染性疾病一样，由感染因子之基因组编码并由之分泌的生物学外毒素(在本发明中为“霍乱毒素”或“CTX”)，对于微生物获得在被感染宿主内移生的能力起到重要作用(4)。另外，接触毒素可引起严重腹泻和呕吐，导致脱水而使疾病危及生命(3，5)。这些经验提示，能引发足以中和毒素之免疫反应(如抗体生成)的疫苗，可在很大程度上帮助机体阻止或减少细菌的移生及腹泻和呕吐等伴随症状。因此，大量的研究工作已集中在开发含毒素之无毒性类似物即“类毒素”的疫苗上(1，3-13)。已知霍乱毒素是由亚基A组成的多亚基的大分子物质，其中亚基“A”含有称为“A1”的催化区，它可使靶细胞中的G蛋白质ADP-核糖基化，还含“B”寡聚体它可使全毒素结合到靶细胞上(6)。为了开发疫苗，已用各种方法产生了霍乱毒素的非毒性类似物。这些方法包括化学处理全毒素或毒素亚单位、删除A亚基并使用保留的B寡聚体，以及合成或分离毒素亚基的肽片段(1，3-13)。
近年来，研究工作已转向发展口服疫苗，有两种手段已显然受到极大关注。其中之一是基于使用杀死的霍乱弧菌(即化学或热灭活的)，可单独使用，或添加霍乱毒素的B寡聚体(1，11，12)。已发现这种方法可产生不完全保护作用，特别是对于儿童(12)。另一种方法包括使用活的，但已减毒的、同时不产生毒素的A1亚基的霍乱弧菌的菌株(13)。这种类型的疫苗提供了更高水平的保护作用，但直到目前仍存在不可接受的肠道付作用。一种近年开发的基于霍乱弧菌CVD103-HgR菌株的疫苗-其中删除了编码A亚基的基因，似乎至少在成年人体内有更好的耐受性(13)。但据我们所知，至今还没有在儿童中或在大规模临床试验中检验这种疫苗。
近年对霍乱毒素之性质的研究，使人们对其结构有了更深入的了解，从而有利于发展基于重组方法的疫苗。已知天然存在的亚基A是在霍乱弧菌中作为前体蛋白质合成的(14)，然后再经蛋白水解作用除去一个大约2，160KDa的信号肽序列。另外转译后加工可产生由二硫桥键连接的一个大约21，817KDa的氨基末端多肽(亚基A1)和一个大约5，398KDa的羧基末端多肽(亚基A2);据信二硫键的还原对于催化ADP-核糖基转移酶反应是必不可少的(6，15，16)。同样，B亚基也是作为前体蛋白质合成的，继后经蛋白酶裂解而除去信号肽。已完全测定了霍乱毒素之A1、A2和B亚基的基因，或顺反子元件顺序，并已在文献中述及(16)。
图1A是现有技术中已知的编码CTX之A亚基的顺反子元件的DNA序列。DNA序列下面的单字母氨基酸序列标示推测的A多肽的开放读码。还示出了几个亚区域，显示信号蛋白质(pre-A)，即A1的起始区，两个推测的A1的羧基末端加工区，以及推测的A2的起始和终止区。应注意的是，就A1之羧基末端的准确定位来说，文献中只提供了不肯定的证据(16，17)。
图1B是编码CTX之B亚基的顺反子元件的DNA序列。同样显示了起始和终止密码子以及推测的切割位点。令人感兴趣的是，操纵子中编码A2之终止区和B起始区的DNA区域相互交叠，但这两个蛋白质是在不同的读码中。
图2图解显示前体蛋白质和加工的天然CTX的A和B亚基的蛋白形式以及亚基的重组形式结构。前体蛋白质氨基末端上的曲折部分代表被霍乱弧菌除去的信号肽。“M”表示氨基末端蛋氨酸残基;“(M)”代表这是一个位于成熟重组CTXA和CTXA1亚基，以及其类似物之氨基末端上的异源(非天然的)残基;氨基酸序列数据表明，异源蛋氨酸残基基本上没有被细胞蛋氨酸氨基肽酶从重组多肽上裂解掉。“S”表示半胱氨酸残基之间二硫化键的硫部分。其他选择的氨基酸，用它们的标准单字母密码标示，同时标出了它们在多肽内的位置。在编码多肽用其标准三字母代码标出了编码DNA序列的选择的限制性酶切点。据信天然(“n”)CTX是作为包含氨基末端信号序列的前体蛋白质(“pre-A”)在霍乱弧菌中合成的。转译后加工导致信号序列的切除，从而产生成熟的CTXA。可能有小部分羧基末端也同时被蛋白水解裂解掉。裂解后，较大的A片段(CTXA1)和较小的羧基末端A片段(CTXA2)被各片段中单个半胱氨酸残基间的二硫桥键连在一起。就CTXA1末端(Arg192或Ser194)的定位来说，文献中有不同的报导，据信CTXA2是以Met195开始的。天然(“n”)CTXB在合成时也带有氨基末端信号序列，该序列继后受到蛋白酶的加工切割。令人感兴趣的是，CTXB顺反子元件中编码其氨基末端的区域与编码其羧基末端的区域相互交叠;但这些编码序列是在不同的读码中(16)。重组(“Y”)CTXA是在最适表达载体的控制下，在大肠杆菌中合成的。使用寡核苷酸接头(NdeI-XbaI)来克隆DNA元件的左侧端，以取代信号肽编码序列的起始蛋氨酸密码子。在重组体大肠杆菌中，没有从A1上去掉A2区域。对于CTXB，同样使用左侧端克隆策略，但不同的是使用NdeI-AccI片段来取代其信号肽编码序列的蛋氨酸起始密码子。模拟天然的还原态CTXA1合成重组CTXA1。为此，用一个右侧端的寡核苷酸接头取代A2序列中的终止密码子，从而使A1终止在天然CTXA1中两个推测的裂解位点之一，即Ser194处。也可使用同样的接头策略很容易地使其终止在Arg192处。如前面已提到的，据信重组CTXA和CTXA1分子及其类似物的氨基末端蛋氨酸实质上并没有被未成熟的大肠杆菌蛋氨酸氨基肽酶切掉。
图3是天然和重组CTX亚基的SDS-PAGE图谱。在大肠杆菌和按本文所述方法制备的包含体中合成重组CTXA、CTXA1、重组CTXA和CTXA1的Arg7-Lys类似物，以及重组CTXB。溶解包含体制剂以及纯化的商品级天然CTX、CTXA和CTXB，并在还原条件下进行SDS-PAGE。泳道1，天然CTX;泳道2;rCTXA/A7;泳道3;rCTXA Arg7-Lys类似物(rCTXA/L7);泳道4，rCTXA1/A7;泳道5，rCTXA1 Arg7-Lys类似物(rCTXA1/L7);泳道6，rCTXB;泳道7，天然CTXB;泳道8，天然CTXA(只看到CTXA1)。电泳后，凝胶用考马斯亮蓝染色，然后再脱色，呈现保留染料的多肽。
图4显示rCTXA1和CTXA1类似物ADP-核糖基转移酶活性的SDS-PAGE和放射自显影分析结果。图片A中，对天然CTXA、重组CTXA1、以及各种位点特异性类似物或rCTXA1的制剂进行SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色。用这些同样的制剂作为在本文所述条件下使用〔32P〕NAD检测ADP-核糖基化膜结合之G蛋白的酶源。终止反应后，对各制剂的整个反应混合物作SDS-PAGE，干燥凝胶并进行放射自显影，以显现因加入〔32P〕标记的ADP-核糖而共价修饰的蛋白质，图片B显示在没加入G蛋白底物情况下所作分析的结果，以阐明重组CTXA1自身核糖基化的能力。有趣的是，类似物CTXA1/L7失去了这种反应性。图片C显示见于人红细胞膜中之底物G蛋白的ADP-核糖基化作用。加入这种底物可在实质上使酶本身的反应性(自身核糖基化作用)移向靶G蛋白质(作为其核糖基化α亚基见于放射自显影图谱中)。另外，可见rCTXA1类似物L7缺乏这种反应性。
图5是对rCTXA和rCTXA类似物ADP-核糖基转移酶活性所作SDS-PAGE和放射自显影分析的结果，此结果与图4中所示的对rCTXA1所作分析的结果相似。因为rCTXA制剂具有比rCTXA1明显低的活性(见图6)，即可能因为前者仍在其羧基末端含有未裂解的A2“尾部”所以使凝胶较长时间地接触X光胶片才能得到这些放射性自显影图谱(图片A)。图片A是rCTXA蛋白质的染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶;与图4相比较，对于图片A，有证据表明这些蛋白质的重组表达总体上要比与之相对的rCTXA1蛋白质少。重组CTXA制剂能够自身核糖基化(图片B)并能使人红细胞膜中的G蛋白质底物ADP-核糖基化(图片C);这些活性较之rCTXA1的活性减小很多。不过，CTXA制剂表现出与它们的CTXA1对应物有同样的一般性失活特征。此外，L7类似物(Arg7-Lys)缺乏ADP-核糖基化活性。
图6显示rCTXA和rCTXA1/L7与rCTXA1和rCTXA1/L7之ADP-核糖基转移酶活性的SDS-PAGE和放射自显影比较。图片A显示没加底物的反应性，图片B显示加入红细胞膜(作为底物)的反应性。其中泳道1)空白(未加样品);泳道2)未尿素处理的天然CTXA;泳道3)经过尿素处理的天然CTXA;泳道4)rCTXA;泳道5(rCTXA/L7;泳道6)rCTXA/L7加天然CTXA;泳道7)rCTXA1;泳道8)rCTXA/L7;泳道9)rCTXA1/L7加天然CTXA。该实验证明，就G蛋白质的ADP-核糖基化来说，rCTXA比rCTXA1的活性小得多(比较泳道4和7)，但表现有明显的自身核糖基化活性。用赖氨酸取代rCTXA和rCTXA1中的精氨酸-7可消除它们的核糖基化活性(即自催化和G蛋白两者)，从而进一步证明了图4和5中所示的数据。当加入类似物制剂中时(泳道6和9)，天然CTXA仍保留活性，这就进一步说明这一活性降低并不是由于重组制剂中的污染物造成的。
图7说明CTXA和CTXA1类似物引起的H27成纤维细胞和红细胞膜的ADP-核糖基化。将天然存在的CTXA或重组CTXA1类似物与〔32P〕NAD以人红细胞或H27成纤维细胞膜一起保温。保温后，沉淀混合物，离心并对所得沉淀物进行SDS-PAGE。凝胶用考马斯蓝染色，干燥后对X-线胶片曝光以产生放射自显影图。B，未加CTXA或CTXA1类似物;A，天然存在的CTXA，A+u，用尿素处理的天然CTXA;rA1，没有取代残基的重组CTXA1;RBC，人红细胞膜。
图8图解说明CTXA和CTXA1类似物对H27成纤维细胞和膜的ADP-核糖基化。在人红细胞膜、H27成纤维细胞膜存在下或在不加含底物膜的情况下使天然存在的CTXA或重组CTXA1类似物与〔32P〕NAD一起保温。保温后，沉淀并离心该混合物对所得沉淀物进行SDS-PAGE。凝胶用考马斯蓝染色，然后洗涤并干燥之。图中左上方是没有加含底物膜保温之样品的染色凝胶的图片;右上方是该凝胶的放射自显影图。左下方和右下方分别是与红细胞和H27膜保温之样品凝胶的放射自显影图谱。B未加CTXA或CTXA1;A天然存在的CTXAA+u用尿素处理的天然CTXA;rA1没有残基取代的重组CTXA1;RBC人红细胞膜。
本发明提供了一种重组DNA分子，编码已降低了酶促活性的霍乱毒素之催化亚单位的类似物的至少一部分，这一活性一般与疫苗反应原性相关联。更具体地说，如本文所述的位点特异性诱变可产生A和A1亚基的类似物，与天然毒素对应物相比，根据ADP-核糖基转移酶活性检测结果可见这些类似物的催化功能明显降低。
本文所用的术语“霍乱毒素的催化亚基”是指如图1A和2中所示的霍乱毒素A区域和A1亚区域。已知霍乱毒素大分子的这些区域具有ADP-核糖基转移酶催化活性(6)。该酶是下列两个亚活性物的配合物一个是将NAD裂解成烟酰胺和ADP-核糖的NAD糖水解酶活性，一个是将ADP-核糖转移到G蛋白质底物上的转移酶活性。本发明中ADP-核糖基转移酶活性的测量值代表两种活性总和。本发明包括这些A和A1多肽的诱变后变体，以及这些多肽的类似物或衍生物，而这些多肽以其天然形式存在时，则是霍乱毒素多聚体内催化活性的来源。
作为本发明的产品，基因工程化的霍乱毒素类似物提供了适用于霍乱疫苗的重组DNA衍生的材料用于预防霍乱病。A和A1亚基类似物可单独使用，也可与类毒素基疫苗中的，或由霍乱弧菌变种表型表达的，或在其他免疫载体之遗传控制下表型表达的B寡聚体合用。应注意的是，因为本发明的类似物A和A1亚基含有重要的保护性抗原决定基，所以其本身可在疫苗中作为抗原剂使用。但更好是将这些类似物与B亚基合用。B寡聚体含有可用于引发免疫保护作用的中和抗原决定基(1，3，5)。A亚基与B寡聚体的结合可产生更为有效的抗B寡聚体免疫原性反应。B寡聚体可以从霍乱弧菌中纯化得到，另外也可以用得到A和A1亚基的相似方法，以重组技术得到，其中包括在大肠杆菌或其他重组体宿主如其他细菌生物体(如鼠伤寒或伤寒沙门氏菌、芽胞杆菌)、酵母(如酿酒酵母)及病毒(如牛痘病毒和腺病毒)中表达产生的。
按照本说明书进行诱变，可产生在不同程度上降低了催化活性的突变体，包括从表现有减毒活性的变异体到基本上没有这种活性的变异体(即小于5%)。因为减弱而不是消除催化活性可有助于提供更大程度的和/或更持久的保护性反应因而方法上需有灵活性。此外，因为它们降低了酶促活性，所以本发明提供的亚基类似物可望有更小的反应原性。
本发明提供了生产疫苗所必需之所有CTX亚单位的高水平的直接重组表达。此外，催化亚单位类似物可提供在ADP-核糖转移酶催化活性方面降低了的生物活性，或者基本上没有这种催化活性。单独或与毒素的B寡聚体(可衍生于天然来源或用重组方法产生)联合使用的本发明类似物可提供能用于疫苗中，并大大降低了与天然毒素之催化活性相关之付作用的可能性。本发明的毒素类似物可配制成疫苗组合物或与其他免疫原制剂合用于多成分疫苗中。
再克隆编码霍乱弧菌毒素的A和B亚基的个体顺反子元件或其部分，并各自直接在重组宿主细胞系统(如大肠杆菌)中表达之。在没有天然信号肽的情况下(用蛋氨酸取代的启动转译)，可得到占总细胞蛋白质2%-80%的高水平表达。如图3中所示，发酵表达细胞可产生成熟的rCTXA、rCTXA1和rCTXB。但应说明的是，rCTXA没有在大肠杆菌内被加工成rCTXA1与rCTXA2，这可能是由于没有特异性酶或rCTXA没有与这种酶分开。因此，rCTXA具有与A2序列共价连接的A1序列。
对选择的重组分子的氨基酸分析证明，从各种rCTX和rCTXA1亚基上异源蛋氨酰残基实质上没有被细胞蛋氨酸氨基肽酶消化除掉;因此这些产物也是含蛋氨酰的成熟类似物。所有重组蛋白质都是作为包含体从溶解的细胞中回收的。发现这些亚基在还原SDS-PAGE中具有与真正天然亚基基本上相同的迁移分布，不同的只是rCTXA没有在大肠杆菌中被加工而裂解成A2和A1。如图3所示，亚基CTXA、CTXA1和CTXB在大肠杆菌中的高水平重组表达是借助直接的、非融合方式实现的。
在本发明的实践中，虽然可以使用其他一些可替代的方法和材料，而优选的还是如下所述的方法和材料。下文中所列的所有文献均作为本文参考文献。
重组表达CTXA、CTXA1和CTXB亚基的材料和方法材料DNA修饰酶分别购自NewEnglandBiolabs(Beverly，MA)、BethesdaResearchLaboratories(Gaitherburg，MD)、BoehringerMannheimBiochemicals(Indianapopolis，IN)及InternationalBiotechnologies，Inc.(NewHaven，CT);这些酶均按制造厂商推荐的方法使用。所有化学和生物试剂均为分析纯制剂。纯化的、天然存在的霍乱毒素和毒素亚基购自SigmaChemicalCompany(St.Louis，MO)和ListBiologicals(Campbell，CA)。基于Matteucci和Caruthers建立的化学方法(18)合成寡核苷酸。
质粒和细菌菌株含有CTX操纵子部分的质粒pRIT10810和pRIT10841(分别是ATCC39051和ATCC39053)得自AmericanTypeCultureCollection，Rockville，MD。表达质粒pCFM1036、pCFM1146和pCFM1156得自Amgen。
美国专利No.4，710，473(Morris)中描述了本发明中使用的表达载体系统，该专利列为本文参考文献。这些质粒含有可诱导的启动子，合成的核糖体结合位点、克隆簇、质粒复制原点、转录终止子、调节质粒拷贝数的基因以及卡那霉素抗性基因。这些衍生的质粒在重复数上彼此不同。可用下列寡核苷酸取代含合成PL启动子之唯一AstⅡ和EcoRI限制性位点间的DNA序列，以从pCFM836(见US4，710，473)衍生质粒pCFM1036AatIIEcoRI5'-CATCGATTCTAG-3'3'-TGCAGTAGCTAAGATCTTAA-5'该质粒在限制簇之前不含有可诱导的启动子。可用下列寡核苷酸取代唯一ClaI和XbaI限制性位点间的小DNA序列ClaIXbaI5'-CGATTTGATT-3'3'-TAAACTAAGATC-5'并用T4聚合酶经末端充填然后进行平端连接破坏两个内源NdeI限制性位点，以从pCFM836衍生质粒pCFM1146。该质粒在限制簇紧前面不含有合成的核糖体结合位点。
可用下列带有最佳合成的核糖体结合位点的寡核苷酸取代唯一XbaI和KpnI限制性位点间的小DNA序列，以从pCFM1146衍生质粒pCFM1156
XbaIKpnI5'-CTAGAAGGAAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC-3'3'-TTCCTTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC-5'质粒pBR322、pUC18、pUC19和噬菌体M13mp18和M13mp19DNA购自Bethesda Research Laboratories。在Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA从得自C.F.Morris的大肠杆菌K-12菌株(19)衍生出大肠杆菌FM5细胞，并含有整合的λ噬菌体表达基因，CI875(20)。本文描述了个体亚基表达质粒的构建。载体产生、细胞转化及菌落选择均按标准方法进行(21)。
分析方法用改进的引物延伸法、链终止法(22，23)进行DNA序列测定。在ABI470A气相微序列分析仪中经自动Edman降解进行蛋白质序列分析(24，25)，并经标准酶促方法得到选择蛋白质的羧基末端序列。基本上按Laemmli(26)所述方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并按Hunkapiller等人(27)所述的相似方法从聚丙烯酰胺凝胶中洗脱多肽。对细胞总溶胞产物进行SDS-PAGE，然后用考马斯亮蓝R250染色，再用积分密度测定仪检查凝胶，以估计重组蛋白质对细胞总蛋白质或总包含体蛋白质的比例。
按下述方法检测ADP-核糖基转移酶催化活性将天然CTXA和重组体亚基加在含8M尿素、25mM磷酸钠(pH7.0)和10mM二硫苏糖醇(DTT)的溶解缓冲液中于37℃保温1小时，并在没有冷藏情况下以10，000rpm离心15分钟。加入溶解缓冲液中，调到每4μl含1μg天然或重组A1，然后将其加到60μl反应混合物(见下表)中并在冰上保温1天。
反应混合物试剂*(终含量)/60μl (终含量)/100μlNaxPO4,pH 7.0,1M 416mM 250mMDTT,100mM5mM3mMGTP,10mM167μM100μM胸苷100mM17mM10mMMgCl2,1M 5mM 3mM[32P]-NAD2.5μCi2.5μCiNAD,2500μM50μM30μM＊各试剂均由市场得到。天然存在的CTXA得自List Laboratories。作为比照，也在同样缓冲液中保温以分析天然CTXA，但缓冲液中不加尿素，先于37℃保温15分钟，然后置于冰上以待检测ADP-核糖基转移酶活性。
加入36μl水或含有人红细胞膜的缓冲液(28)以使各样品的终体积达到100μl，并将样品在30℃保温。30分钟后，向各样品中加入50μl5mMNAD和0.03%脱氧胆酸钠以终止反应并将反应混合物放在冰上冷却10分钟，然后加入50μl40%三氯醋酸(TCA)，将样品放在冰上至少15分钟;然后向各样品内加入2ml水，并离心将沉淀的蛋白质团成块。除去上清液并冷冻成块的蛋白质。1天后，对成块蛋白质进行SDS-PAGE(26，29)。凝胶用考马斯亮蓝染色、脱色、干燥并进行放射自显影，以检测各带中与〔32P〕标记之ADP-核糖共价结合的蛋白质含量。对凝胶和放射自显影图谱进行密度检测以估测重组CTXA1和重组类似物CTXA1蛋白质的比活性(相对于天然CTXA1的活性)。扫描已染色的凝胶以估测加到各反应混合物中之个体蛋白质的量。扫描放射自显影图谱以估测转移到G蛋白底物上的〔32P〕ADP-核糖的量(作为放射自显影影象之密度的函数)。
表达质粒的构建。以不同于前面描述的一系列大肠杆菌广义的表达载体构建所有表达质粒。利用图1和2中所示的限制性位点分离个体霍乱毒素亚基基因片段。上游限制性位点正好在成熟的，被加工亚基形式(即没有信号序列的)的氨基末端残基的密码子内。为在大肠杆菌中重组表达，缺失编码其天然信号肽的CTX基因部分，并以表达亚基类似物的“蛋氨酰成熟”形式的蛋氨酸起始密码子取代之。利用合成的寡核苷酸接头使基因片段在合成启动子和核糖体结合位点的下游最适位置上插入表达质粒中。上游接头使各基因的读码回复到成熟之氨基末端的第一个密码子处;该寡核苷酸包括蛋氨酰起始密码子。
接着用各不同的质粒构建体转化大肠杆菌FM5细胞并接种于含卡那霉素琼脂中后，选择适当数目的菌落，重复接种并作为小量液体培养物培养之(“小量制备物”)，然后于42℃下诱导4小时。为知细菌细胞中是否存在包含体，在光学显微镜下筛选此小量制备物。鉴定带有明显包含体的细胞制剂并在诱导温度下对得自复制平皿的相应菌落进行实验室的培养瓶规模发酵。诱导后不同时间由发酵液中取样品，进行SDS-PAGE分离并用考马斯亮蓝染色，以检查是否产生了适当的CTX亚基。对分离的质粒进行限制性酶切图谱分析，以确定各表达克隆之质粒的结构，并由接合区域的DNA序列证实之。
重组CTX、CTXA1和CTXB的表达。当在37℃和42℃下分别将含有CTXA表达质粒(pCTXA/A7/1156)、CTXA1表达质粒(pCTXA1/A7/1156)和pCTXB表达质粒(pCTXB/1156)的大肠杆菌细胞发酵时，它们分别产生了分子量大约为27，215道尔顿、21，817道尔顿和11，600道尔顿的主要细胞内蛋白质;在SDS-PAGE中，重组CTXA1和CTXB分别与真正(天然)CTXA1和CTXB共迁移。因为天然CTXA在从菌体内分泌出来之前在某些位点上被霍乱弧菌蛋白酶裂解成CTXA1和CTXA2，所以我们的CTXA没有其天然对应物;A1和A2被在SDS-PAGE中被缓冲液还原了的二硫键连在一起。部分氨基酸序列分析表明，重组多肽CTXA1/A7和CTXA1/47(详见下文)具有予料的天然CTXA1亚基的氨基末端序列，而实际未除去异源起始蛋氨酸残基。
重组CTX亚基的性质。
从大肠杆菌细胞分泌的CTX亚基即使有的话也微乎其微。每种亚基的大多数是以包含体的形式存在的，并构成总细胞蛋白质的2-80%。用French压榨器破碎细胞并经低速离心得到沉淀物碎片，该沉淀物中含有占其蛋白质80%的个体亚基部分。所有rCTX亚基均可在用考马斯亮蓝染色的凝胶中检测到(图3)。
CTXA和CTXA1类似物使用蛋白质工程和位点特异性诱变(19，30)技术制得CTXA和CTXA1类似物。在将提交本说明时制备并试验了这些类似物，发现在精氨酸-7、组氨酸-44、组氨酸-70、谷氨酸-112和天冬氨酸-9位置上的氨基酸残基的诱变，以及剪去羧基末端(在成熟天然CTXA序列的色氨酸-179位置上)可导致减少或基本上没有ADP-核糖基转移酶活性。
CTXA表达质粒的构建。用XbaI和ClaI限制性酶切割质粒pRIT10841(ATCC39053)并用凝胶电泳法分离552bpDNA片段，该片段含有CTXA基因的左侧端至编码蛋白酶敏感性部分的区域，从而可使CTXA裂解成CTXA1和CTXA2。用限制性酶ClaI和HindⅡ(后者是HincⅡ的异裂殖体)切割质粒pRIT10810(ATCC39051)并分离一个368bpDNA片段，该片段编码CTXA亚基中从蛋白酶敏感性位点(在ClaI位点编码)(16，17)通过CTXA2区域，通过CTXA的终止密码子并进入CTXB亚基的另一个开放读码的部份。
制备一个合成的寡核苷酸接头，以重新构建从编码成熟蛋白质序列(天门冬氨酰胺)之第一个氨基酸的位点到XbaI位点的CTXA的开放读码区。该接头在其左侧端具有NdeI粘性，从而可产生将取代编码信号肽之序列的蛋氨酸起始密码子，并有利于将基因构建体插入表达载体内;接头的右侧端具有一个XbaI重叠。该接头的序列是5'-TATGAATGATGATAAGTTATATCGGGCAGATT-3'3'-ACTTACTACTATTCAATATAGCCCGTCTAAGATC-5'
用NdeI和XbaI消化质粒pUC19并插入上述接头。连接并转化后，分离称为p2A/pUC19的pUC质粒，该质粒含有在正常pUC19NdeI′-XbaI序列之位置上的接头序列。
用XbaI和HincⅡ消化质粒p2A/pUC19。将该消化产物中的大片段与含有CTXA基因之左手端的552bpXbaI-ClaIDNA片段和含有CTXA基因之右手端的368bpClaI-HindⅡDNA片段连接在一起(通过终止密码子并进入CTXB亚基的另一个开放读码中)。这产生含有整个成熟的CTXA基因的新质粒;该质粒被称为pCTXA/A7/pUC19。
用NdeI和HindⅢ消化大肠杆菌表达质粒pCFM1156，以除去其克隆簇中的这个小的部分。同时用NdeI和HindⅢ消化质粒pCTXA/A7/pUC19，并分离含有CTXA基因之整个区域的DNA片段(772bp)。然后将该片段连接到已消化的pCFM1156质粒上，产生CTXA表达质粒pCTXA/A7/1156。可将该NdeI-NdeI片段以两个方向插入pCFM1156中，其中只有一个将产生能表达一大蛋白质的开放读码。选择该克隆(用SDS-PAGE方法分析诱导的克隆，以鉴定重组体CTXA蛋白质)，并测定上游NdeI接合区域的DNA序列以证实适当定向。
CTXB表达质粒的构建。用ClaI和BstⅪ消化质粒pRIT10810(ATCC39051)并分离538bpDNA片段，该片段含有CTXA的A2编码区、整个CTXB编码区、以及一个达到CTXB之终止密码子右侧的短DNA序列。
制备一个能将上述DNA序列的右手端克隆到pUC19中的合成的寡核苷酸接头。该接头具有BstX1和HindⅢ粘性末端并有下列序列5'-GTGGAATTCGGTACCATGGA-3'3'-GAGTCACCTTAAGCCATGGTACCTTCGAA-5'用HindⅢ和AccI(后者产生一个可与用ClaI消化产生者相容的粘性末端)消化质粒pUC19。将此大的pUC19片段与含有CTXB和BstXI-HindⅢ接头的583bpClaI-BstⅪDNA片段连接起来，产生称为pCTXB/pUC19的质粒。然后用HindⅢ和SspI(后者在CTXB的起始密码子内和ClaI位点的下游)消化该质粒，以分离345bpSspI-HindⅢ片段。
制备具有NdeI和SspI粘性末端和下示序列的合成的寡核苷酸接头5'-TATGACACCTCAAAAT-3'3'-ACTGTGGAGTTTTA-5'用NdeI和HindⅢ消化质粒pCFM1156，以除去其克隆簇中的这个部分。然后使大的pCFM1156DNA片段与含有CTXB基因和NdeI-SspI接头部分的345bpSspI-HindⅢ片段连接，所说的接头恢复了它的左手编码区，并在该编码区左侧潜入蛋氨酸密码子得以启动蛋白质合成。如此得到的含整个CTXB基因和蛋氨酸起始密码子的表达质粒被定名为pCTXB/1156。
接头诱变。合成一个称为L7的寡核苷酸接头，以便用赖氨酸密码子取代CTXA中的精氨酸-7密码子。表1中显示了这个带有NdeI和XbaI粘性末端之接头的序列。将L7接头克隆到pUC19的NdeI-XbaI位点，以产生称为pL7/pUC19的质粒。然后用XbaI和HindⅢ消化质粒pL7/pUC19，以除去pUC19克隆群中的这个部分，并通过连接用含有CTXA基因左手端的552bp XbaI-ClaI DNA片段(见上文)，以及含有该基因右手端的368 bp ClaI-HindⅡ DNA片段(见上文)置换之。用NdeI消化此称为pCTXA/L7/pUC19的质粒，并分离含有完整成熟CTXA基因，且其由赖氨酸密码子取代了精氨酸-7密码子的772bp DNA片段。用NdeI消化质粒pCFM1156并与pCTXA/L7/pUC19的NdeI DNA片段相连接。这一连接产生了适于在大肠杆菌中表达CTXA成熟形式Arg7→Lys类似物的质粒pCTXA/L7/1156。在pCTXA/A7/1156的情况下(见上文)，必须选择含有该质粒，并在适当开放读码中有适于合成rCTXA/L7之DNA插段的克隆。
合成寡核苷酸接头1E和1F，以分别用苯丙氨酸密码子取代酪氨酸-6密码子，用谷氨酸密码子取代天冬氨酸-9密码子。这些接头具有NdeI和XbaI粘性末端并有如表1所示的序列。用XbaI和HindⅢ消化质粒pCTXA/A7/pUC19(见上文)，并分离含有CTXA基因之右手部分的938bp DNA片段。用NdeI和HindⅢ消化质粒pCFM1156，以除去其克隆群中的这个短区域。通过连接用含有Tyr6→Phe或Asp6→Glu密码子突变的NdeI-XbaI接头(分别是接头1E和1F)和CTXA基因的938bpDNA片段置换这个部分。结果产生了两个分别在大肠杆菌中表达成熟形式的CTXA类似物Tyr6→Phe和Asp9→Glu的两质粒pCTXA/1E/1156和pCTXA/1F/1156。
在编码突变的序列中，用谷氨酰胺取代脯氨酸-185，用丙氨酸取代半胱氨酸187，结果产生了只编码CTXA亚基之CTXA1部分的CTXA基因片段(见下文中有关天然序列CTXA1基因的构建，且分别是CTXA基因和其取代类似物中CTXA1的L7、1E和1F取代类似物)。
合成寡核苷酸接头1G和1H，以便分别用谷氨酰胺取代脯氨酸-185，用丙氨酸取代半胱氨酸-187。这些接头具有DsaI和HindⅢ粘性末端和表1中所示的序列。为构建编码类似物蛋白质之表达质粒，从质粒pCTXA/A7/pUC19中分离537bp NdeI-DsaI DNA片段。然后用NdeI和HindⅢ消化质粒pCFM1156，以除去其克隆群中的这一短片段。通过连接用pCTXA/A7/pUC19的537bp DNA片段和1G或1H合成寡核苷酸置换之。这些接头除了编码特定氨基酸取代外，还从CTXA基因中除掉了编码CTXA亚基之A2区域的部分;因此，这些突变在此亚基的CTXA1变体中是独有的。如此得到的表达CTXA1之Pro185→Gln和Cys187→Ala类似物的质粒分别称为pCTXA1/1G/1156和pCTXA1/1H/1156。
构建一个表达终止于Trp179的羧基末端剪短形式之CTXA1变体的质粒。为此首先用NdeI和HindⅢ消化质粒，以除去这一短的DNA片段。在pCFM1156的这一位点中连接得自pCTXA/A7/pUC19的537bp NdeI-DsaI片段(见上文)和带有DsaI及HindⅢ粘性末端并有下示序列的合成的DNA片段5'-CGTGGTAATGATAGA-3'3'-CATTACTATCTTCGA-5'这个表达在Trp179处截短之CTXA1的质粒被称为pCTXA1/T1/1156。
用定点引导方法诱变。
使用购自Promega Corporation(Madison，WI)的“体外改变位点诱变系统”(“Altered SitesTMin Vitro Mutagenesis System”)的药盒，以定点引导法进行诱变;由Promega公司提供的技术手册中包括了该方法具体实验程序(印制1/90)。
为了利于诱变，从质粒pCTXA/A7/pUC19(见上文)中分离编码CTXA亚基部分的938bpXbaI-HindⅢDNA片段。将该片段克隆到由Promega得到的pSELECT1噬菌质体(phagemid)载体中。用辅助噬菌体包装后，该载体即含有了CTXA片段的负性拷贝。合成一系列单股正性DNA引物以进行诱变;这些引物的序列(1B、1C、1D和1I)如表1中所示。这些引物分别与含有CTXA基因片段的单股噬菌质体一起退火;结果产生了含有该基因片段及由引物编码之个别密码子取代的双股噬菌质体。
为了制备能表达CTXA和CTXA1亚基类似物(其中包含用赖氨酸取代精氨酸-146)的质粒，从含有Arg146-Lys密码子突变(1I)的双股噬菌质体中分离207bp BstXI-ClaI DNA片段。从质粒pCTXA/A7/pUC19中分离含有CTXA基因部分的375bp NdeI-BstXI DNA片段和386bp ClaI-HindⅢ片段(CTXA变体的)。用NdeI和HindⅢ消化质粒pCFM1156，以除去其编码簇中的这个短部分。为了构建有Arg146-Lys突变的CTXA变体，将消化过的pCFM1156质粒与pCTXA/A7/pUC19中的375bp NdeI-BstXI片段、双股噬菌质体中的209bp BstXI-ClaI片段，以及pCTXA/A7/pUC19中的386bp ClaI-HindⅢDNA片段相连接。所得到的质粒可在大肠杆菌中表达CTXA亚基的Arg146→Lys类似物，并定名为pCTXA/1I/1156。为了在亚基的CTXA1变体中构建这一突变，将消化过的pCFM1156质粒与来自pCTXA/A7/pUC19的375bp NdeI/BstXI片段、来自双股噬菌质体的209bp BstXI-ClaI片段及一合成寡核苷酸接头相连，所说的接头用编码A1区的DNA序列置换编码CTXA之A2部分的CTXA区域，并包括位于CTXA1的末端处终止多肽合成的密码子。该接头具有ClaI和HindⅢ粘性末端及下示序列5'-CGTAATAGGCGGCCGCA-3'3'-ATTATCCGCCGGCCTCGA-5'所得质粒用于在大肠杆菌中表达CTXA1的Arg146→Lys类似物，并称为pCTXA1/1I/1156。
利用具有表1中所示序列的引物(分别是1B、1C和1D)以利于分别制备能够表达含His44→Asn、His70→Asn或Glu112→Gln等取代的CTXA类似物。将引物分别与含有pCTXA/A7/pUC19中之938bp XbaI-HindⅢCTXA片段(见上文)的pSELECT1噬菌质体一起退火并回收双股质粒以后，用XbaI和HindⅢ消化，以从该质粒上切除含有位点特异性突变的区域，并且在每种情况下都回收到一个938bp的DNA片段。用XbaI和HindⅢ消化p2A/pUC19质粒(含有编码成熟CTXA左末端的一个NdeI-XbaI接头，见上文)以移走位于接头插入物右侧pUC19克隆束的这一短区域;通过连接，以从含有一个单一密码子替代的质粒得到的938bp XbaI-HindⅢ片段置换该区域。从pUC衍生的这一系列质粒依据它们含有的密码子替代物的不同，将它们称为pCTXA/1B/pUC19、pCTXA/1C/pUC19，和pCTXA/1D/pUC19。然后从每一种质粒上切除含有替代密码子的DNA片段。用BstXI和HindⅢ消化质粒CTXA/A7/pUC19，并分离出了一593-bp DNA片段，按照早期描述的方法用NdeI和HindⅢ消化pCFM1156质粒以移走该克隆束的这一短区域，然后通过连接以从上述过渡性pUC质粒得到的个体CTXA类似物基因插入物以及从pCTX/A7/pUC19得到的539-bp BstXI-HindⅢDNA片段置换这一短区域。在分离后，将这些在大肠杆菌中表达位点特异性His44→Asn，His70→Asn，和Glu112→Glu的CTXA类似物的新质粒分别称为pCTX，A/1B/1156，pCTXA/1C/1156，和pCTXA/1D/1156。
CTXA和CTXA类似物基因转变为CTXA1和CTXA1类似物基因。
除含有1I密码子替代物的质粒(pCTXA1/1I/1156)(该质粒是通过诱变处理构建的，其缺失A2编码区)外，将含有CTXA基因和含有选择到的个体类似物基因的表达质粒转变为CTXA1表达质粒，以表达得到酷似还原性全毒素制剂中的该亚基的天然种类的CTXA的截短的A1变体。为了完成这种转换，必须将靠着唯一的ClaI位点的右边的CTXA基因的基因序列部分缺失。虽然在以前的文献(16，17)中没有指出位于A1和A2区域间的多肽裂解的真实位点，但在丝氨酸-194位，初步确定A1的羧基末端是明确的;但也应该注意，在精氨酸-192位(在文献中建议过其它末端)建立末端是一件简单的事情，只需插入一个新的接头以替代紧挨着精氨酸-192密码子右面的终止密码子即可。
为了达此目的，用NdeI限制性酶(在编码蛋氨酸起始密码子的序列)和ClaI限制性酶(在选择出来用于将一个终止密码子加到紧挨着丝氨酸-194右边的位点处)将我们希望使之转变为CTXA1变体的每一个CTXA类似物序列(和天然CTXA序列)从其pUC19过渡性质粒(即pCTXA/A7/pUC19、pCTXA/1B/pUC19、pCTXA/1C/pUC19、pCTXA/1D/pUC19、pCTXA/1E/pUC19、pCTXA/1F/pUC19、pCTXA/1G/pUC19、pCTXA/1H/pUC19)中切除;在每一个例子该DNA片段都是585bp。为了将一个终止密码子代替A2编码区域以及随后将该基因片段连接到质粒pCFM1156上，合成一个含有ClaI和HindⅢ粘性末端的寡聚核苷酸接头，该接头具有下列系列
5'-CGTAATAGGCGGCCGCA-3'3'-ATTATCCGCCGGCGTTCGA-5'用NdeI和HindⅢ消化pCFM1156质粒，以移去这部分克隆群，通过连接上ClaI-HindⅢ接头以及连接一个从上面描述的pUC过渡性质粒之一得到的个体585bpDNA片段可以置换该区域。在连接反应后分离质粒DNA得到一系列能在大肠杆菌中表达CTXA1和CTXA1多肽类似物的质粒;根据这种方法制备的质粒包括pCTXA1/1B/1156、pCTXA1/1C/1156、pCTXA1/1D/1156、pCTXA1/1E/1156，和pCTXA1/1F/1156。
CTXA及其重组体类似物的表达和分析在制备后，将每一种质粒用于转化一种新鲜的活性FM5细胞的分离制剂。挑取转化体，以微量制剂培养，诱导这些转化体使之产生重组蛋白，用光学显微镜识别出内含体阳性的样品。在诱导温度条件下更大规模(≥1升)地发酵这些样品以制备更大量的每一种重组蛋白质类似物。重新悬浮于含有1mMDTT的蒸馏水中后，在French压榨机中裂解分离到的细胞团。通过简便的低速离心法从这些裂解体中分离到内含体。这些内含体蛋白质制剂含有小到2%大到80%的重组蛋白。用以前描述的方法，估测这些样品中ADP-核糖基转移酶活性。得到的结果显示于图4、5和6以及表2中。
图4显示rCTXA1和其位点一特异性类似物的内含体制剂的已染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(图片A)。用相同于该凝胶中显示的蛋白质的量催化个体ADP-核糖基转移酶反应。将由这些反应沉淀出的三氯醋酸(TCA)沉淀物，也进行SDS-PAGE电泳，并将凝胶进行放射自显影以使〔32P〕ADP-核糖-标记的底物显现出来。图片B表明未加含有G蛋白的人血红细胞膜制剂的反应结果，图片C显示加入这种底物进行的反应结果。
在图4，图片C中找到了该试验的最重要的发现(并在图片B中得到进一步证实)一些位点特异性氨基酸残基替代结果导致如该试验中测得的酶活性减弱，在某些情况下，明显地完全消失。关于这一点，与天然CTXA(有脲)和rCTXA1/A7(除氨基端蛋氨酸残基外无其他突变)相比时，rCTXA1/L7(Arg9→Lys)，rCTXA1/AB(His44→Asn)和rCTXA1/1D(Glu112→Gln)类似物亚基表现出实际上不具有酶活性，而类似物rCTXA1/1C(His70→Asn)和rCTXA1/1F(Asp9→Glu)表现出活性减小。在Trp129处截断(rCTXA1/T1/1156)也产生酶活性大大减弱的A亚基类似物。
虽然酶活性的放射自显影分析不能严格地进行定量，但我们计划对凝胶和图4放射自显影照片进行定量估测以用数字表示能目测到的结果。结果显示于表2中。这里，我们将含有rCTXA1和前面描述的每一种类似物的已染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(图4，图片A)进行综合的显像密度扫描以更精确地估算出加入到该试验中的每一种蛋白的相对量;这里是指将加入到该试验中的天然CTXA(未含脲)中A1亚基的量记作1.00μg。尽管试图将等量的每一种蛋白质加到试验中(根据每一种内含体制剂中亚基蛋白质的百分数进行估测)，但仍可以看到这种测定法是不精确的。随后用G蛋白质底物进行酶反应的放射自显影照片(图4，图片G)也进行显像密度分析以测定放射性标记G蛋白α亚单位谱带的放射显影图的相对密度，以用天然CTXA(无脲)标记的谱带密度记为100%。然后将图像密度除于加入酶的量计算出近似的相对比活性，将天然CTX(无脲)的比活性记作1.00。应该注意到，这种类型的定量分析结果常受某些实验限制(例如，对每一种亚基制剂用相同量染料染色的假定，用于进行数字化显像密度分析的谱带的选择及其界限，密度显像反应特性，以及〔32P〕ADP-核糖标记和放射自显影密度之间呈线性相关的假定这一系列因素)的支配。而且，该结果(表2)以数字的形式表示在放射自显影照片上目测到的结果;以及类似物rCTXA1/1C(His70→Asn)，rCTXA1/1F(Asp9→Glu)，和rCTXA1/T1(截去Trp179)酶活性的明显减小和类似物rCTXA1/L7(Arg9→Lsy)，rCTXA1/1B(His44→Asn)和rCTXA1/1D(Glu112→Glu)实际上丧失了活性。
在未加入外源底物的情况下(图4，图片B)，可以看到天然的CTXA和具酶促活性的CTXA1蛋白具有自动催化作用即能催化NAD水解以及将ADP-核糖转移至酶自身结构(以顺式，反式，或两种方式)。在放射自显影照片上看到的多条谱带是由于污染了能够进行ADP-核糖基化的大肠杆菌蛋白质而产生的;或者认为(但不确信)，这些谱带表示亚基蛋白质的较次要的变体(例如，蛋白水解产生的缺口，或者，可能是在SDS中具有某些残余的二级结构的变异体)。重组CTXA1制剂表现出比天然CTX的A亚基具有大得多的参与自动催化过程的能力。这种自动核糖基化能力提高的原因目前尚不明确，但这可能与仍待回复本性的重组蛋白质丧失底物特异性有关，或与由于不合适的二级结构而将重组蛋白质的敏感的核糖基化位点暴露出来(在该具体实验中没有制订出获得天然构型的计划)，或者在稳定自动催化作用的重组体粗制剂中存在ARFs(ADP-核糖基化因子)(31-37)有关。但是，如果加入人血红细胞膜形式的G蛋白质底物(图片C)，ADP-核糖基转移酶反应的中心点转移至该底物，便抑制了自动核糖基化作用。
图5表明，如果在rCTXA的重组体亚基变体中(即仍共价连接有A2“尾部”的变体)相同残基替代物被制得，也能观察这种变体与rCTXA1类似物具有相同的减弱或丧失酶活性的类型。但是，A2区域的存在能明显减小酶促活性蛋白的ADP-核糖基转移酶活性。在图6中更清楚地描述了该酶活性的减小，在该酶分析试验中rCTXA和rCTXA1以相同的量评估(图片A)，在同一凝胶上将放射性标记的产物进行电泳，然后在相同的曝光时间内进行放射自显影(图片B)。正如所看到的，rCTXA1表现出比rCTXA具更大的活性(将泳道7和4比较)。也没有检测出带有Arg9→Lys替代的亚基结构(泳道5和8)对G蛋白底物具有可测量出的ADR-核糖基转移酶活性。根据在由大肠杆菌产生的，含有类似物的制剂存在时天然CTXA对核糖基化G蛋白的能力这一事实，可以证明类似物中酶活性的丧失不是由于大肠杆菌污染物抑制催化反应引起的(泳道6和9)。
由于有毒活性的主要标志物(ADP-核糖基转移酶)的减少或基本上消除，因而予期由pCTXA1/L7/1156，pCTXA1/1B/1156，pCTXA1/1C/1156，pCTXA1/1D/1156，pCTXA1/1F/1156，和pCTXA1/T1/1156克隆产生的重组体CTXA1类似物分子，以及相应的rCTXA类似物对应物能够单独或与CTXB结合后用于较安全疫苗中。所描述的突变也可望不会减少天然CTX亚基的正常的，保护性的，免疫原特性。因此本发明的CTXA和CTXA1类似物可以与CTXB亚基结合后以全类毒素的形式应用。CTXB亚基可以提高对CTXA和CTXA1的免疫应答，反之亦然，每一种亚基有保护性抗原决定基。CTXB亚基来源于霍乱弧菌或者是通过遗传操作得到的亚基以及它们的类似物。经过遗传操作后的亚基产物包括融合蛋白和非融合蛋白。
利用上面描述的同样方法可以制备霍乱毒素的CTXA亚基的其他重组类似物。利用合成的寡聚核苷酸实现密码子替代，或者通过接头诱变或通过特定位点引发的诱变的情况显示于表3中。简单地说，利用在制备类似物CTXA1/1F(Asp9→Glu)中描述的方法通过接头诱变而制备CTXA1/1J(Asp9→Tyr)类似物，所不同的是合成寡聚核苷酸具有适当的密码子替代。为了构建CTXA1/1K(Ser10→Gly)，CTXA1/1L(Arg11→Lys)和CTXA1/1M(Arg11→His)类似物，通过利用下面的合成寡聚核苷酸引物在指定的位点处引发而将一个新的DraⅡ(也称作为EcoO 109I)限制性位点引入到CTXA1基因5'-AGCAGTCAGGGGGCCTTATGCCAA-3'
引入该位点后可以在该基因区域进行接头诱变(利用前面描述的在该插入位点左边的NdeI位点和刚产生的在该插入位点右边的DraⅡ位点)从而在这三种类似物中实现密码子变化。利用特定位点引发的方法可以在类似物CTXA1/1N(His44→Tyr)，CTXA1/1“O”(His44→Gln)，CTXA1/1P(His44→Val)，CTXA1/1Q(His70→Tyr)，CTXA1/1R(His70→Gln)，和CTXA1/1S(His70→Val)中产生密码子变化。
但有二点例外，这些类似物中每一种可在重组E·Coli中表达并测试分离到的内含体的在人血红细胞膜制剂中G3α进行ADP-核糖基化的酶促能力，或者尤其是在His44和His70类似物的情况下，在培养的H27人包皮成纤维细胞膜制剂中(旧金山，加利福尼亚大学提供)G3α和/或微管蛋白进行ADP-核糖基化的能力。这些例外是对由重组体表达但没有分析其活性的CTXA1/1J(Asp9→Tyr)类似物，以及CTXA1/1L(Arg11→Lys)类似物而言，对于后一种类似物已合成了一个接头并进行了克隆，但没有分离到其正确序列的克隆。
上述分析结果表示于图4和7中，并在表4作了总结，图4提供了将表1中报道的类似物相比较得到的资料。在图7和表4中描述的其他类似物中有三种类似物在His44上进行了不同的替代(CTXA1/1N，CTXA1/1“O”，CTXA1/1P)。除前面描述的CTXA1/1B类似物(His44→Asn)丧失了活性外，在这些类似物中也没有可检测到的酶活性，这一结果表明在His44位的特异性替代导致具有多体分子的具固有毒性活性的霍乱毒素亚基失活。根据这些结果，在该残基进行任何替代都将可能产生这种失活。
在这些类似物中还有三种类似物(CTXA1/1Q，CTXA1/1R，CTXA1/1S)在His70被替代。除CTXA1/1C类似物(His70→Asn)外，这些类似物列于表1中。如图7所示，所有四种His70类似物都减弱了使G3α底物ADP-核糖基化的能力，但它们显然保留了使其他非G3α蛋白质底物(例如H27成纤维细胞中的包皮)ADP-核糖基化的能力。因此，在His70位的替代导致CTXA1对特定的G3α底物的活性明显减少，据信，这种特异性底物将参与对霍乱毒素的特殊病征的细胞毒性应答。如果将包含于已形成的全毒素多聚体中的CTXA1进行这种取代，则有可能产生一种减弱了霍乱毒素的分子而不是完全丧失毒性。
其他两种类似物的分析结果显示于图8中。CTXA1/1K(Ser10→Gly)保留了与天然CTXA分子相关的催化活性。用His取代Arg11(CTXA1/1M)产生了一种具很小或检测不到的酶促活性的类似物。可以预言在进行分离和分析后CTXA1/1L(Arg11→Lys)类似物具有的活性也明显减弱，在表1中的发现支持了这一结论(见Arg7→Lys)。
rCTX亚基的体外结合在文献(36，37)中已描述许多将天然霍乱毒素分裂以及将个体亚基在体外重新结合而重新形成全毒素分子的方法。对于天然亚基，在文献中也已描述了百日咳毒素亚基的体外重新结合(38-40)。利用同样的方法，可将重组CTX亚基分离，在体外结合而形成全毒素的类似种类，并且纯化。一般说来，在表达和回收后，将个体亚基按化学计算的比例进行结合(如果以内含体制剂的形式，根据特定亚基蛋白的相对含量)，该比例接近天然CTX全毒素中存在的亚基的比例。将该制剂溶于含有高离液序列试剂(Chaotropic)或去污剂，或两者都有的水溶液中。将该制剂置于还原条件下(一般用一种还原剂或通氢气或用这两种方法)然后进行氧化(用一种氧化剂或在富含氧的空气中，或两者)重新形成必需的分子内二硫桥键。通过减少或移走可溶性的高离液序列剂或去污剂可以将这些亚基结合成全毒素的类似种类。这一过程可以利用各种方法包括过滤和利用透析色谱的缓冲交换来进行。然后用常规方法例如离子交换，尺寸筛析和亲和色谱纯化出类似全毒素的种类。应该注意到如果A亚基的内含体制剂未加入则利用同样的方法可以回收到不含A亚基的B多聚体种。
利用常规方法可将本发明的经过遗传操作得到的类似物亚基配制类毒素霍乱疫苗。对于已从遗传学上失活的毒素例如本发明中的霍乱毒素的情况，由于这些产品是由非病原性有机体产生的并且其本身不具有一般认为能诱发与全细胞霍乱疫苗的不利反应的酶活性，因而通常不需要进一步的失活步骤(如化学处理或热处理)。而且，控制重组产品的纯度，尤其是对于内毒素的含量是必要的。一般说来，以本发明中描述的重组全类毒素，重组全类毒素的类似大分子，重组B亚基大分子，单独的重组B亚基或可能的B亚基重组类似物，以及单独的A亚基类似物作为潜在的接种抗原时将它们纯化到≥90%均一性。测定污染物(如果有的话)的性质和估测其量以保证内毒素污染物的含量满足个体调节作用的标准。
为了能进行非肠道释放，将疫苗物质吸附到铝佐剂上。这一过程至少可用两种方法完成用已加工过的明矾进行沉淀以及用铝盐进行沉淀。然后将吸附过的沉淀重新悬浮于赋形剂中从而产生一种剂量浓度一般每剂在5-100μg范围并且明矾的量通常不超过1.5mg/剂的抗原疫苗;每剂的体积在0.1-1.0ml范围内。悬浮用的赋形剂通常是一种缓冲溶液(例如，磷酸缓冲的盐水，PH7.0)，也可以加入稳定剂(例如甘油)，并且多半含有一种防腐剂(例如0.01%乙基汞硫代水构相酸钠)以防止微生物污染并且延长了其活性保存期。
借助于活的载体系统(也包含于本发明中)进行的重组霍乱类毒素或其亚基成分的配制和输送依据该系统的特性而定。例如，通过口腔输送的重组(突变)霍乱弧菌，沙门氏菌，疫苗病毒，或带有A或A和B亚基的基因的腺病毒可以用胶囊将其包裹成肠涂层传送载体中以传送到内脏或包裹成能形成气雾剂的形式(例如，用脂质体)以施用于呼吸道以便在粘膜表面诱导出起保护作用的分泌免疫球蛋白A抗体。或者，根据文献中描述的方法，适当地进行修改以适用于本发明的抗原性试剂，制备其他口服形式的疫苗。例如，将一种重组霍乱弧菌菌株冻干并用碳酸氢盐缓冲液混合以中和胃酸(41);根据本发明制备的全类毒素可以泡腾片剂形式，适当地加入缓冲剂后加补到一种杀死的整细胞疫苗(1)。
本发明已对在大肠杆菌中进行的重组体的生产进行了详细的描述，但本领域内技术人员都能理解本发明中描述的类似物亚基的诱变原则也可用于有关的其他重组宿主和表达系统，并且产生其他的失活的毒素类似物。再者，应该明白利用同源重组可在完整细胞例如在霍乱弧菌而不是在体外将突变类似物装配成全类毒素。本发明也包括按照权利要求定义的范围进行的修饰和改进。
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权利要求
1.一种重组DNA分子，至少该分子的一部分编码霍乱毒素催化亚基的一种类似物，其中所说的类似物的与霍乱毒素反应原性相关的催化活性已受到减弱或已丧失。
2.权利要求1所说的重组DNA分子，其中的类似物是霍乱毒素的A区域。
3.权利要求1所说的重组DNA分子，其中的类似物是霍乱毒素的A1亚基。
4.权利要求1所说的重组DNA分子，其中的类似物能诱发中和霍乱毒素的免疫应答。
5.权利要求1所说的重组DNA分子，该分子可通过位点特异性诱变方法获得，利用该诱变方法产生一种通过ADP-核糖基转移酶活性分析法测定具有很小活性或基本上失活的催化亚基类似物。
6.权利要求5所说的重组DNA分子，其中的位点特异性突变是在结合了编码包括蛋氨酸-1和精氨酸-192或丝氨酸-194的密码子的区域内。
7.权利要求6所说的重组DNA分子，该分子编码一种催化亚基类似物，该类似物具有在所说亚基的选自精氨酸-7、精氨酸-11，天冬氨酸-9，组氨酸-44，组氨酸-70和谷氨酸-112中的一一个或多个位点处发生定点特异性突变。
8.权利要求6所说的重组DNA分子，该分子编码一种从色氨酸-129位开始的羧基末端部分截去的催化亚基类似物。
9.权利要求1所说的重组DNA分子，该分子也编码霍乱毒素B亚基。
10.一种霍乱毒素催化亚基的经过遗传操作加工的类似物，所说的类似物已降低了或基本上丧失了与霍乱毒素反应原性相关的催化活性。
11.权利要求10所说的类似物，它是霍乱毒素的A区域。
12.权利要求10所说的类似物，它是霍乱毒素的A1亚基。
13.权利要求10所说的类似物，它能诱发中和霍乱毒素的免疫应答。
14.权利要求10所说的类似物，它可以通过位点特异性诱变方法获得，利用该诱变方法产生一种以ADP-核糖基转移酶活性测定法测定活性具很小活性或基本上无活性的突变的催化亚基。
15.权利要求14所说的类似物，其中的位点特异性突变发生在结合了包括蛋氨酸-1和精氨酸-192或丝氨酸-194的区域内。
16.权利要求15所说的类似物，该分子在所说亚基的选自精氨酸-7、精氨酸-11、天冬氨酸-9、组氨酸-44、组氨酸-70和谷氨酸-112的一个或多个位点处发生位点特异性突变。
17.权利要求15所说的类似物，该分子中截去了从色氨酸-179开始的羧基末端部分。
18.一种含有有效量的霍乱毒素催化亚基类似物的经过改进的抗霍乱疫苗，所说的毒素具有(a)能诱发中和霍乱毒素免疫应答和(b)具有降低了或基本上丧失与霍乱毒素免疫原相关的催化活性的生物学活性。
19.权利要求18所说的改进疫苗，其中的类似物是霍乱毒素的A区域。
20.权利要求18所说的改进疫苗，其中的类似物是霍乱毒素的A1亚基。
21.权利要求18所说的改进疫苗，其中的中和毒素的免疫应答提供了抗霍乱疾病的保护作用。
22.权利要求18所说的改进疫苗，其中的类似物是通过位点特异性诱变产生的，利用该方法产生一种具有很低或基本上无ADP一核糖基转移酶活性的突变的霍乱毒素的催化亚基。
23.权利要求22所说的改进疫苗，其中的位点特异性突变发生在结合了包括蛋氨酸-1和精氨酸-192或丝氨酸-194的催化亚基区域内。
24.权利要求23所说的改进疫苗，其中的位点特异性突变发生在所说亚基的选自精氨酸-7，精氨酸-11，天冬氨酸-9，组氨酸-44，组氨酸-70和谷氨酸-112的一个或多个位点处。
25.权利要求23所说的改进的疫苗，其中的突变包括截去从色氨酸-179位开始的羧基部分。
26.权利要求18所说的改进疫苗，其中的催化亚基类似物与B寡聚体相结合。
27.权利要求26所说的改进疫苗，其中的B寡聚体是天然形式。
28.权利要求26所说的改进疫苗，其中的B寡聚体是经遗传工程法处理的。
29.用根据权利要求1的DNA分子转化的原核或真核细胞，该细胞能表达由所说的DNA分子编码的一种或几种多肽产物。
30.根据权利要求29所说的大肠杆菌宿主细胞。
31.一种含有经过遗传操作的毒素操纵子的霍乱弧菌菌株，其中已利用诱变方法改变或缺失了该操纵子中与霍乱毒素反应原性相关的一个或多个特定的氨基酸残基。
32.根据权利要求31所说的霍乱弧菌菌株，其中的操纵子已受到诱变而改变了选自精氨酸-7，精氨酸-11，天冬氨酸-9，组氨酸-44，组氨酸-70，和谷氨酸-112中的一个或多个氨基酸，或截去该操纵子从色氨酸-179开始的羧基末端部分。
33.一种生产霍乱毒素催化亚基类似物的方法，该类似物已降低了或基本上丧失了与霍乱毒素反应原性相关的催化活性，该方法包括(a)鉴别该毒素中与这样的催化活性相关联的一种或多种氨基酸残基;(b)使该毒素顺反子或操纵子发生位点特异性诱变以移走或置换这样的一个或几个残基并产生一个突变的顺反子或操纵子，以及(c)在一种转化的生物体中表达经过诱变的顺反子或操纵子以产生一种具有降低的或基本上无催化活性特征的类毒素。
34.一种离体的，经过遗传操纵加工的蛋白质，该蛋白质基本上具有图1A所示的从成熟序列的天冬酰胺-1位开始到亮氨酸-240位结束的氨基酸序列。
35.权利要求34所说的蛋白质，它是由除霍乱弧菌以外的宿主表达产生的。
36.权利要求35所说的蛋白质，它是由大肠杆菌表达的。
全文摘要
利用重组DNA技术产生的霍乱内毒素的亚基或亚基类似物可用于制备包括其生物学活性和免疫原性的疫苗制品。该疫苗能保护个体免受疾病的侵袭。利用遗传工程方法对亚基进行修饰得到的产品保留了免疫原性，但降低了或基本上消失了与毒素的反应原性相关的酶促活性。
文档编号A61P31/04GK1067679SQ92104219
公开日1993年1月6日 申请日期1992年5月2日 优先权日1991年5月2日
发明者W·N·伯内特, H·R·卡斯罗 申请人:安姆根有限公司, 南加州大学