专利名称：含有非环聚类异戊二烯的细胞分化诱导剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基石，4，6，10，14-十六碳五烯酸或其可药用盐的诱导细胞分化作用(在下文称作诱导分化)治疗或改善造血器官肿瘤的药物。
癌症(肿瘤)一般可以各种方式分类，例如依据表现部位、病象和病理状态等。白血病是以各种没有分化的幼稚白细胞的大量增殖为特征的一种很具有代表性的造血器官肿瘤，是血细胞(白细胞)的恶性肿瘤。根据增殖情况下的肿瘤细胞是未成熟的幼稚细胞还是成熟细胞，可进一步分为急性白血病和慢性白血病。现已观察到白血病的各种临床症状，尽管它们其中的大部分可粗略归类为由于正常血细胞生成抑制引起的症状和由于受其它器官的浸润和/或压迫引起的症状。特别是当正常血细胞受抑制引起骨髓机能不全时，在红细胞减少造成的贫血、粒细胞减少造成的传染疾病和潮红症及由于血小板减少造成的出血趋势中均可表现出正常血细胞的减少。众所周知，白血病是一种预后不良的疾病。为此人们已经尝试了各种药物和临床治疗方法。
在急性白血病中，急性早幼粒细胞白血病(下文简称为APL)是一种肿瘤细胞分化停止在早幼粒细胞阶段，具有高度非典型核的许多粗颗粒和早幼粒细胞进行倍增的疾病。在血液学的FAB分类法(法美英三国研究协作组分类方案)中，APL症归入M3类，是以染色体畸变t(1517)为特征的。从临床角度看，在患APL症情况下，经常会发生由源于粗颗粒的组织凝血酶引起的播散性血管内凝血综合征(DIC)。另外，APL伴随有由于纤维蛋白溶解激活剂(例如纤维蛋白溶酶原激活剂)和从白血病肿瘤细胞中释放出的弹性蛋白酶而造成的严重纤维蛋白溶解，从而引发严重的出血。也就是说，APL是各种急生白血病中最为严重的一种。
另一方面，还有一种被称作骨髓发育异常综合征的急性白血病(在下文中简称为MDS)，它的幼稚细胞增加显示着白血病前期的血象，但其在骨髓中的增加不会超过30%的水平。在MDS症中，尽管不会马上出现什么临床症状，但未成熟细胞随着时间的推移而增殖，则MDS很有可能转化成APL。
对上面提到的病症常规药物疗法的基本思想在于彻底消除白血病细胞(即肿瘤细胞)来达到治疗效果。因此，为了对付有相当高的增殖能力的肿瘤，人们试图发展一种具有高细胞毒性的药物，因而能发挥更有效的细胞毒作用，或者施以高浓度或大剂量的某些现存的药物并伴以一些辅助药物以取得更好的治疗效果。但是这些药物和治疗方法不是仅特异性作用于肿瘤细胞，而且对正常细胞也有毒性，有严重的副作用。例如诱发心脏和心肌疾病，骨髓机能抑制，恶心、呕吐，神经病和脱毛症。结果是迄今为止仅能得到有限治疗效果。
而另一方面，已知各种分化诱导剂其安全性能高于常规抗癌药物。能够诱导体外肿瘤细胞分化成为成熟细胞，这种分化诱导被寄予很大的希望成为一种有效的治疗方法。但遗憾的是没有一种常规的分化诱导剂证明是有临床效用的。尽管如此，自从Huang等人1988年报道了临床应用由下式代表的全反式视黄酸(在下文中简称为ATRA)资料表明几乎100%的APL患者得到了治愈以后[见Blood，72，567-572(1988)]，这一成果已在世界很多国家推广并得到进一步证实。并且有广大的前景预示着分诱导治疗方法不单单对造血器官肿瘤有疗效，而且也适用包括固型肿瘤在内的大范围癌症。
如上所述，包括Huang等人[见Blood，72，567-572(1988)]、Costaigne等人[见Blood，76，1704-1709(1990)]和Warrell[见NewEngl.J，Med，324，1385-1393(1991)]在内的一些科学家已报道了ATRA在临床上治疗APL是有效的。
另外，Olsson等人报道了1a，25-二羟胆钙化醇-维生素D3的一种生理学上活性的代谢产物(在下文中简称为活性VD3)，对培养的人淋巴组织瘤细胞系(U937)有诱导分化作用[见Canert Res.，43(12pt1)，5862-5867(1983)]。随后，人们积极努力，试图发展活性VD3衍生物。例如，日本专利公告-A 33165号/1986公开了一种24-烷基-脱氢维生素D3衍生物有抗肿瘤效用，同时日本公开专利140560号/1986公开了20-氧杂-21-降维生素D3衍生物有诱导分化的作用。
Zhang等人也报道了蟾蜍灵对培养的人白血病细胞系HL-60、U937和ML1有诱导分化作用[见Biochem.Biophys.Res.Commun.，178(2)，686-693(1991)和CancerRes.，52(17)，4634-4641(1992)]。
除了以上所提到的化合物外，还报道了胞嘧啶阿戊糖(Ara-C)[见Baccarani等人，Br.J.Haematol42，485-487(1979)]、阿克拉霉素A[见Monin等，CancerRes.，44，2807-2812(1984)]和干扰素α[见Monya等人，Jap.J.Clin.Hepatol.32，170-172(1991)]，每一种化合物都具有诱导分化作用。
通过利用培养的小鼠髓细胞白血病细胞系，Ishikura等人报道了拢牛儿基法呢醇(3，7，11，15，19-五甲基石，6，10，14，18-二十碳五烯-1-醇)具有诱导分化作用[见LeukemiaRes.，8(5)，843-852(1984)]。
ATRA及其衍生物已用于治疗皮肤癌和顽固的皮肤角化病——牛皮癣。尽管如此，这些药物都存在有可能导致死亡的副作用[见AnnalsofInternalNeclicine，117，292-296(1992)]。进一步说，已清楚知道，由于所述化合物在脂肪中有极高的溶解度，长时间服用常会导致维生素A过多症，包括白细胞增多、皮肤和嘴唇干燥，皮炎、胃肠紊乱、骨痛、高血脂以及肝病(例如肝的无分裂生长)。在这种情况下，ATRA及其衍生物即使在停药后也会长时间停留在肝脏和其它器官内。也就是说，一旦这些副作用发生，会带来严重的不良后果，并持续很长的时间。如上所述，ATRA是治疗APL的有效药物，尽管如此，还存在另一个问题即使在愈后仍反复使用ATRA，APL仍有复发的趋势。
维生素D3衍生物已经被用于治疗中，如治疗骨质疏松症。这些物质加速钙质在肠道吸收和在肾的重吸收，因此可知超剂量施用会诱发高血钙症，导致肾病和由于钙质沉着导致的消化系统紊乱。因此，在使用这些化合物期间定期检查血清的钙水平是很有必要的，这就给这些化合物在临床用药上带来困难。另外，尽管VD3衍生物对源于人急性早幼粒细胞白血病培养的细胞系HL-60有诱导分化作用，但并没有在其它类型的模型上观察到这种相同的功效。
因为蟾蜍灵迄今尚未应用于临床，因此它的安全性如何完全未知，因此也不能评估它对人体的作用。
另一方面，无论是胞嘧啶阿戊糖还是阿克拉霉素A，都因为安全问题在日本未能作为药物使用。另外，干扰素α的抗癌效果达不到预期目的。
评价拢牛儿基法呢醇的分化诱导作用的数据是利用培养的小鼠白血病细胞系获得的，而利用培养的人白血病细胞系的数据迄今尚未见报道。所以当考虑到种与种之间细胞对药物的敏感性的差异时，这一化合物对人体的功效也就完全不可知。
因此，没有一种现存药物对于造血器官肿瘤特别是APL和DMS有相当好的疗效并有高的安全性。因而迫切需要发展一种能用于临床对大多数癌症都有很好疗效的药物。
美国专利4917829和4988732给出了本发明的化合物及其最初药理学应用。
本发明的(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基2，4，6，10，14-十六碳五烯酸(Ⅰ)[下文中简称为化合物(Ⅰ)]由下式表示
US-A4988732和日本专利公告-A181012号/1982都公开了上述化合物具有抗癌作用并能够改善伴有角化病的皮肤疾病。已证实这个化合物对小鼠乳头瘤有抗肿瘤作用。使用小鼠做毒性试验，施用ATRA的一组会出现包括脱毛症在内的维生素A过多症及体重减较，而与此同时，施用化合物(Ⅰ)的一组不呈现上述症状。这表明化合物(Ⅰ)毒性很低。本发明者已注意到这样一个事实，即化合物(Ⅰ)既有各种生理活性且毒性很低，并用了很长的一段时间，检验了它对其它各种疾病的疗效，结果，出乎意料地发现化合物(Ⅰ)有诱导分化作用，因此可用作治疗或改善造血器官肿瘤的药物，达到前面所提到的本发明目的。这样，就完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种治疗或改善造血器官肿瘤的药物，它具有分化诱导作用和较高的临床使用价值。更具体地讲，本发明涉及一种分化诱导剂，更具体地讲，本发明涉及一种治疗或改善造血器官肿瘤的药物，它含有作为活性成份的化合物(Ⅰ)或其可药用的盐。作为造血器官肿瘤的具体实例，可以包括APL和MDS的急性白血病、慢性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤和巨球蛋白血病。本发明中的细胞分化诱导剂，尽管，它所治疗的疾病并不局限于APL和MDS，但它在治疗APL和MDS方面是特别有效的。
本发明还提供了一种诱导哺乳动物的细胞分化的方法，它包括给予所述的哺乳动物受试验者药理有效剂量的(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳五烯酸或其可药用的盐。在本发明提供的方法中，最好，哺乳动物受试验者是人类;用以治疗的病症是造血器官肿瘤;用以治疗或改善的病症是急性早幼粒细胞白血病及脊髓发育不良综合征。
本发明提供了(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳五烯酸或其可药用盐用于生产能诱导细胞分化的药物，即细胞分化诱导剂的用途。
本发明提供了一种含有(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基石，4，6，10，14-十六碳五烯酸或其可药用盐的细胞分化诱导剂及一种诱导细胞分化的药用组合物，该组合物包括药理有效量的(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳五烯酸或其可药用盐，及可药用的载体。
本发明中使用的化合物是前面式(Ⅰ)所示的化合物，它是非环的聚类异戊二烯化合物之一。
可以相信，ATRA作用于APL的特殊功效的机理是基于APL细胞的15和17对染色体之间发生的相互易位现象。位于染色体15的中央基因PML和位于染色体17的视黄酸α受体(RAR-α)在相互易位过程中共同形成一个融合基团PML/RAR-α，从而抑制APL细胞的分化。因此可以期望这种融合基因PML/RAR-α的检测使将来对APL症更合适的药物疗法的建立成为可能。尽管如此，除了ATRA之外，没有任何物质证明对于PML/RAR-α阳性细胞有疗效。因此，根据本发明的化合物(Ⅰ)及其可药用盐是首次证明的除ATRA之外对PML/RAR-α阳性细胞有疗效的化合物。
如上所述，还存在一个问题，即使在用ATRA治愈APL后继续使用该药，APL仍有复发的趋势。这似乎是因为长时间使用ATRA会诱导肝药代谢酶，因而加速了ATRA本身的代谢，从而不可能保证ATRA正常水平的血药浓度[见CencerResearch，52，2138-2142(1992)和Blood，79(2)，299-303(1992)]。考虑到这一点，可以预期本发明的化合物(Ⅰ)，一种非环的类异戊二烯在结构上完全不同于环的类异戊二烯的ATRA，将不会引起肝药代谢酶的诱导。因此，化合物(Ⅰ)或其可药用盐，可期望成为一种确实有效的临床药物。
本发明的化合物(Ⅰ)可以按照日本专利公告32058号/1988描述的方法制备，例如以法呢基丙酮为起始原料来制备。本发明中使用的可药用盐并无什么限制，只要它是与化合物(Ⅰ)形成的盐则可。其具体例子包括碱金属加成盐(例如钠、钾、锂盐)，碱土金属加成盐(例如钙盐、镁盐)，铵盐，胺加成盐(例如甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺和乙醇胺的盐)以及氨基酸加成盐。
下面是关于本发明化合物的急性毒性试验结果。
通过对7至8周龄5只雄性和5只雌性SD大鼠及ICR小鼠分别进行单一剂量(介质5%阿拉伯胶)的口服、肌内注射、皮下注射、腹腔内注射途径的给药，对本发明的化合物进行了毒性试验。
下表1总结了半数致死量——LD50(mg/kg)的数据。
表1化合物[(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳五烯酸]的急性毒性(mg/kg) 表1清楚地说明，本发明的化合物有着很高的LD50值，因此有极其高的安全性。
作为剂型的例子可包括口服制剂，如粉剂、finesubtilaes、颗粒剂、片剂、包衣片剂和胶囊剂;外用药制剂，如软膏剂、糊剂;以及注射剂。这些制剂都可以借助本技术领域中常用的药物载体，采用常规的方法而制得。
更具体地讲，口服制剂以常规方法制备将化合物(Ⅰ)或其可药用的盐与填充剂混合，如果需要，还可加入粘合剂，崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味剂，然后制成散剂、finesubtilaes、颗粒剂、片剂、包衣片剂或胶囊剂。
填充剂的实例包括乳糖、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨醇、结晶纤维素和二氧化硅。粘合剂实例包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、甲基纤维素、乙基纤维素、阿拉伯胶、西黄著胶、明胶、紫胶、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙二醇/聚氧乙烯嵌段共聚物以及麦格鲁明。崩解剂的实例包括淀粉、琼脂、明胶粉、结晶纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠、枸檬酸钙、糊精、果胶和羧甲基纤维素钙。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇、二氧化硅以及硬化植物油。对于着色剂，那些被批准作为药物添加剂的着色剂都是可以使用的。矫味剂的实例包括可可粉、薄荷醇、芳香剂粒末、薄荷油、冰片和粉状肉桂皮。不用说，如果必要，这些片剂和颗粒剂可以任意选择用糖或其它物质包衣。
为配制注射剂，将化合物(Ⅰ)或其可药用的盐与pH调节剂、溶剂、等张调节剂等混合，如果需要还可加入助溶剂、稳定剂，然后用常规方法制成注射剂。
配制外用制剂的方法无任何限制，它们可以用常规方法生产，即通常在药物、准药物、化妆品中用的各种物质均可作为基质使用。
基质的实例包括动物和植物油、矿物油、酯油、蜂蜡、高级醇、脂肪酸、硅油、表面活性剂、磷脂、乙醇、多元醇、水溶性聚合物、粘土矿物和纯化水。此外，如果必要，可加入pH调节剂、抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、杀真菌剂、着色剂和芳香剂。应该知道在配制本发明外用制剂中所用的基质并不局限于上面所提及的那些物质。而且，如果必要，这些制剂可以包括其它成份，如分化诱导剂、血液循环加速剂、杀菌剂、遮光剂、细胞增效剂、维生素、氨基酸、湿滑物和角质层分离剂。在配方中加入这些基质的量足以调节外用制剂中药物的含量，使其位于通常的水平。
在本发明中，化合物(Ⅰ)或其可药用盐的临床剂量并不特别受限定，但要根据症状严重程度、年龄和并发症而变化。并且，剂量还要根据盐的类型和给药途径而变化。通常，在口服、静脉内或皮下给药时，成人每天的剂量范围为100mg到1200mg，优选300到1000mg，最好为500mg到700mg。
为阐明本发明化合物作为分化诱导剂的用处，下面给出本发明化合物对于APL病人白细胞和各种培养的人白细胞系的作用的实验实例。提供实验中所使用血液的病人的背景如下表所示。
［表2］ FAB法美英三国研究协作组分类方案
图1是表明在化合物(Ⅰ)和ATRA的浓度与传代培养的人APL细胞株HL-60的细胞计数(用平均值±标准偏差表示)之间的关系图。
图2是表明化合物(Ⅰ)和ATRA浓度与能生存的HL-60细胞计数之间的关系图。
就传代培养的人绒膜促性腺激素(APL)细胞系HL-60来说，起始细胞计数调节到5×104个细胞/毫升，并且在添加化合物(Ⅰ)或ATRA(10-4至10-8mol/L)的情况下，在含10%胎牛血清的IMDM培养基(Gibco制造)中孵育五天。孵育完成之后，用Burker-turk计算板计算总细胞计数，同时通过用台盼兰染色死细胞从而可计算出能生存细胞计数。这样，可测定出ID50和LD50。更进一步，准备Cytospin Slide并且通过May-Giemsa染色方法进行细胞的形态学观察。
从APL病人得到的细胞样本初始细胞计数调整到1×106个细胞/毫升，并在上面提到的加有化合物(Ⅰ)或ATRA(10-6至10-8mol/L)的含10%胎牛血清的IMDM培养基中卵育5天，随后象在HL-60中那样进行相同计算。另外，全部细胞中成熟细胞的比率根据下述公式计算测定，并且作为比较诱导分化能力的指标。
成熟细胞比率(%)＝ (髓细胞计数+晚幼粒细胞计数+杆状核细胞计数+分裂细胞计数)/(总细胞计数) ×100(1)对于HL-60的增殖抑制作用图1显示化合物(Ⅰ)或ATRA浓度与HL-60细胞计数之间的关系，而图2显示上述浓度与能生存细胞计数之间的关系。
正如图1清楚地所示，在化合物(Ⅰ)和ATRA浓度增加时对HL-60细胞增殖有抑制作用，并且在7.5×10-6mol/L或其以上浓度时可观察到明显的抑制细胞分化作用。化合物(Ⅰ)的ID50为1.0×10-5mol/L，ATRA的ID50为1.4×10-5mol/L。
正如图2清楚地所示，化合物(Ⅰ)和ATRA在1.0×10-5mol/L或其以上浓度时都可导致能生存细胞计数下降。尽管如此，每种化合物在低于上述浓度水平时都显示低细胞毒性，并且可被台盼兰染色的死细胞所占比率是极低的(大约10%或更低)。从图2测得的化合物(Ⅰ)的LD50为3.8×10-5mol/L，ATRA的LD50为2.5×10-5mol/L。
这样就清楚阐明了化合物(Ⅰ)和ATRA都可诱导HL-60细胞的分化。为了阐明这些化合物的性质，可测定LD50/ID50的比例，也就是安全范围的指标。结果列于表3。
［表3］化合物(Ⅰ)和ATRA安全范围的比较(LD50/ID50的比值)
表3清楚表明，用LD50/ID50比值表示的化合物(Ⅰ)的安全范围大约是ATRA的安全范围的2.1倍。因此，可预期化合物(Ⅰ)在临床医学药中比ATRA更适用。
(2)化合物(Ⅰ)和ATRA诱导分化的能力表4显示化合物(Ⅰ)和ATRA对HL-60细胞诱导分化的能力，而表5显示这些化合物对APL病人细胞诱导分化的能力。
表4清楚表明，在HL-60细胞孵育之后的形态学观察中，在化合物(Ⅰ)浓度大于或等于1.0×10-6mol/L或在ATRA浓度大于或等于1.0×10-7mol/L时，可见到明显的诱导分化作用。
另一方面，在用APL病人的细胞进行的实验中，化合物(Ⅰ)所显示出的诱导分化作用近似于ATRA。而且，化合物(Ⅰ)对所有情况的带有PML-RAR-α融合基因的细胞都是有效的，而原来认为只有ATRA对此细胞才有效。因此，可以认为能对APL病人这个基因的检查可进行常规检验，将使更适当的药物治疗的实行成为可能。当上述的化合物(Ⅰ)的高安全范围也被考虑时，化合物(Ⅰ)或其可药用盐预期能成为临床上高度有效的药物是显而易见的。
权利要求
1.一种诱导哺育动物受试者细胞分化的方法，它包括给予哺乳动物受试者有效量的(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳五烯酸或其可药用的盐。
2.按权利要求1的方法，其中从药理学上治疗造血器官肿瘤。
3.按权利要求1的方法，其中从药理学上治疗或改善急性早幼粒细胞白血病或骨髓发育异常综合征。
4.按权利要求1的方法，其中受试者是人类。
5.将(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基石，4，6，10，14-十六碳五烯酸或其可药用的盐用于生产细胞分化诱导剂。
6.一种细胞分化诱导剂，它含有(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳五烯酸或其可药用的盐。
7.一种具有细胞分化诱导作用的药物，它含有(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳五烯酸或其可药用的盐及可药用的载体。
8.权利要求7的药物，它用于治疗哺育动物造血器官肿瘤。
9.权利要求7的药物，它用于治疗哺乳动物急性早幼粒细胞白血病或骨髓发育异常综合征。
全文摘要
对于迄今为止临床上尚无非常有效药物的疾病，如造血器官肿瘤和固形肿瘤，本发明提供了一种具有细胞诱导分化效应的药物。它含有(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳五烯酸或其可药用的盐。
文档编号A61P43/00GK1099264SQ94102318
公开日1995年3月1日 申请日期1994年3月10日 优先权日1993年3月11日
发明者鹤见寿, 高桥健, 森胁久隆, 武滕泰敏, 东条有伸, 浅野茂隆 申请人:卫材株式会社