专利名称：高含量银杏叶黄酮内酯浸膏及其制备方法
技术领域：
本发明属高含量银杏叶黄酮内酯浸膏及其制备方法。
银杏(Gin kgo biloba L.)系银杏科银杏属银杏种植物。银杏叶为常用中药材，具有敛肺气、平喘咳、止带浊功能，可用于肺虚咳喘、冠心病、心绞痛等疾病。银杏叶中的活性成分主要是黄酮类和内酯类，它们对改善心血管、脑血管和周围血管有明显的治疗作用。
国内外医药科学家对银杏叶作了大量的研究开发工作，发现银杏叶中主要含有黄酮类化合物，其中有黄酮、黄酮醇及其甙类，儿茶素类和双黄酮类，其次是含有倍半萜和二萜的内酯类，另外还有少量的有机酸、生物碱和其它化合物。目前已有不少银杏叶浸膏制剂，但由于制备工艺困难，因而这类制剂对含量和质量的要求仅限于含黄酮甙≥24％、及一定量的内酯，忽视了其它有效的黄酮活性成分，不收集游离黄酮；此外，现有制剂对容易产生刺激性和致过敏物质的银杏酸也不进行限量检查。所以，现有的银杏叶浸膏制剂在药效上受到了一定的限制。
本发明的目的在于开发银杏叶中的多种有效黄酮活性成份，研制一种高含量银杏叶黄酮内酯浸膏。
本发明公开了一种高含量银杏叶黄酮内酯浸膏，又名“银杏酮酯”(EGB50)，主要成分含量如下总黄酮≥44％、(其中黄酮甙≥24％)、内酯≥6％，控制银杏酸≤10ppm。
本发明的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏药理研究证明对心、脑血管有较明显的保护机体、改善功能作用。
一、高含量银杏叶黄酮内酯浸膏对狗心肌梗塞的治疗作用研究1、供试样品高含量银杏叶黄酮内酯浸膏(EGB50)为淡棕色粉末状固体，使用时用1％西黄耆胶配成6mg/ml和20mg/ml浓度的混悬液备用。
2、实验方法本实验选用剂量为30mg/kg和100mg/kg口服。阳性对照组选用硝苯啶5mg/kg口服。
3、实验步骤将狗用3％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉，然后经口插入12号胃管作给药用，同时经口插入麻醉用气管导管(Curity，内径9.55mm，泰国产)，接人工呼吸机，以30次/分频率，呼吸时比1.5∶1进行人工呼吸，调节潮气量至呼吸正压为15-20cmH2O。将动物左侧卧固定于手术台上，于右侧腹股沟处分离股静脉，插入导管作输液用，于左侧胸壁第4、第5肋间开胸，并剪断第5肋骨，用扩张器张开胸腔，距迷走神经2cm处沿神经走向剪开心包，然后将心包缝合于胸壁，充分暴露心脏；在冠状动脉左前降支第三分枝根部游离冠状动脉，其下穿线，将按文献所制的30点多点心外膜电极四角用心血管无损伤连线缝合针缝合于心脏表面，电极间距8mm，同步描记正常肢体导联I、II、III和加压肢体导联aVR、aVL、aVF6导联，然后描记表面30点心电图，描记肢体导联时心电图定标8mm/mv，心外膜电图定标为1mm/mv，记录纸速25mm/s。结扎前2分钟，从股静脉iv利多卡因5mg/kg，然后用加入利多卡因0.2mg/ml的葡萄糖氯化钠注射液连续滴注。结扎后1分、10分记录心外膜电图，以10分钟为给药前。于结扎10分钟后，从胃管按5ml/kg体积灌服试验样品，阴性对照组同体积灌服生理盐水，分别于给药0.5，1，1.5，2，2.5，3小时记录心外膜电图，测出各点心电图ST段高总和(∑-ST)值和ST段升高＞2mv的心电导联数(N-ST)。在第3小时处死动物，迅速取出心脏，称出全心重量，切去心房及右心室，称出左心室重量，放入冰箱速冻1小时，在冠脉结扎线下，平行冠状沟，将心室等厚地切成5片，放入0.5％硝基四氮唑蓝(N-BT)溶液中，于37℃恒温水浴振摇染色10分钟，正常心肌染为暗蓝色，梗塞区心肌不着色为浅黄色，仔细切下梗塞部分，称出梗塞区重量，计算出梗塞区重量占全心及左室重量的百分比。
4、结果①对心肌缺血程度的影响结扎后10分钟，心电图ST段总和(∑-ST)明显升高达180.4±56.7mv。给药后30分钟，银杏叶浸膏30mg/kg组即使心肌缺血程度(∑-ST)非常显著下降，从给药前201±59mv降至147±67mv，下降60±29mv，与给药前及生理盐水组比较差异均非常显著(P＜0.01)，银杏叶浸膏100mg/kg组给药30分钟后也非常显著降低心肌缺血程度，(∑-ST)从199±85mv降至97±44mv，下降102±40mv，同给药前及对照组比较均P＜0.01，二组以后心肌缺血程度继续下降，作用时间持续至给药3小时后，银杏叶浸膏高剂量组降低心肌缺血程度的作用大于低剂量组，但二组间差异无显著意义(P＞0.05)。阳性对照硝苯啶组在给药30分钟后，∑-ST下降，同生理盐水组相比差异显著(P＜0.05)，但同给药前相比无显著差异(P＞0.05)，至1.5小时，同给药前相比产生显著差异(P＜0.05)，同对照比较则差异非常显著(P＜0.01)。阴性对照组，给生理盐水后∑-ST继续上升，至1小时接近峰值，但同给药前相比无显著意义(P＞0.05)。实验结果见表一。
实验结果表明，“EGB50”30和100mg/kg口服对狗冠脉结扎引起的心肌缺血程度有显著的治疗作用。
②对心肌缺血范围(N-ST)的影响结扎后10分钟，N-ST平均值为25.6±2.6点。
“EGB50”30和100mg/kg口服30分钟，N-ST分别从24.3±3.4降至21.3±3.0下降3.0±1.5和从26.2±2.5降至20.0±4.5下降6.2±3.7，同给药前相比，差异非常显著(P＜0.01)，同对照组相比，差异显著(P＜0.05)，1小时后N-ST继续缓慢下降，同给药前及对照组比较，差异均非常显著(P＜0.01)。心肌缺血范围下降作用持续时间超过3小时，作用强度高剂量组大于低剂量组，但无显著性差异(P＞0.05)。硝苯啶口服1小时后，心肌缺血范围同给药前及对照组相比，出现非常显著下降(P＜0.01)。生理盐水组心肌缺血范围随时间无明显变化(P＞0.05)。实验结果见表二。
实验结果表明，“EGB50”30和100mg/kg口服能非常显著地降低心肌缺血范围。
③高含量银杏叶黄酮内酯浸膏对心肌梗塞范围的定量组织学检测影响用N-BT染色显示“EGB50”对心肌梗塞范围的影响与心外膜电图测定结果一致。“EGB50”30和100mg/kg组均能减少心肌梗塞范围，梗塞区/全心和梗塞区/左室的比值同对照组比较，下降均极显著(P＜0.01)，100mg/kg组作用大于30mg/kg组，二组比较有显著差异(P＜0.05)。硝苯啶组也非常显著地降低梗塞范围(P＜0.01)。实验结果见表三。
二、高含量银杏叶黄酮内酯浸膏(EGB50)对冠脉结扎狗离体培养心肌耗氧量的影响。
1、供试样品EGB50和硝苯啶，同上。
2、实验方法将实验动物，在给药后3小时处死，迅速取出心脏，于低温台氏(Tyrodes)液中洗尽淤血，取心肌梗塞区中心部位及正常左心室心肌组织各一块，在冰浴盘上切片，在电子天平上精确称取60mg，分别放入10ml玻璃注射器，加入新鲜配制的心肌孵育液(台氏液)5.0ml，排尽空气，用橡皮帽封住出口，于37℃恒温水浴中平衡30分钟，并经常转动。孵育液氧分压用Corning161型血气分析仪测定，测量前仪器预热1小时后用标准气体校正零点和标准值。实验时，先用新鲜孵育液测定孵育前氧分压2次，样品测定完后再测定新鲜孵育液氧分压2次，将前后共4次测定值平均作为孵育前氧分压，样品孵育完后各组织孵育液分别测二次，取平均值作为孵育后氧分压值，二者差即为该心肌组织耗氧量，以mmHgO表示。
3、实验结果实验结果见表四。
生理盐水对照组正常心肌耗氧量非常显著大于梗塞心肌(P＜0.01)，“EGB50”及硝苯啶组二种组织耗氧量无显著差异(P＞0.05)。“EGB50”30mg/kg po3小时后正常心肌耗氧量为30.3±2.2mmHgO，100mg/kg为26.8±3.4mmHgO，同生理盐水组36.7±2.9mmHgO相比，下降均非常显著(P＜0.01)，“EGB50”100mg/kg组正常耗氧量与30mg/kg组比较，有显著差异(P＜0.05)。硝苯碇也显著降低正常心肌耗氧量(P＜0.05)。梗塞心肌耗氧量各组间均无显著差异。
实验结果表明，“EGB50”能显著降低正常心肌耗氧量，且作用强度与剂量正相关。
统计结果表明，“EGB50”能显著降低正常心肌耗氧量，且作用强度与剂量正相关。
统计检验用成组数据t检验方法。
3、结论实验结果证明，本发明的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏(EGB50)能显著降低冠脉结扎狗的心肌缺血程度，缩小心肌缺血范围，作用强度与剂量正相关，定量组织学检测结果与心外膜电图结果一致，随服药剂量增加，梗塞区域显著减小，证明对狗冠状动脉结扎引起的心肌梗塞有明显的治疗效果。实验结果还表明，该“EGB50”使正常心肌组织氧耗量产生剂量依赖性的下降，30mg/kg组作用显著大于硝苯啶5mg/kg组，提示“EGB50”治疗心肌梗塞的作用除其直接扩张冠脉循环外，尚能通过降低氧耗量进而产生心肌保护作用。实验结果还发现，“EGB50”30mg/kg PO，心外膜电图缺血程度改善大于硝苯啶5mg/kg组。
表一“EGB50”口服对冠状动脉结扎狗表面心电图ST升高值总和的影响(n＝6只/组，X±SD，mV)剂量 给药后(h)样品给药前(mg/kg) 0.5 1 1.5 2 2.5 3生理盐水 5ml/kg148±21158±29a186±49a185±48a190±45a187±45a186±46a硝苯啶 5 169±30131±42ae 143 445ae 133±32be 122±29be 122±37be 122±35beEGB5030201±59147±67cf 138±62cf 131±61cf 126±59cf 116±50cf 108±48cf100 199±8597±44cf115±79cf 90±50cf76±44cf78±38cf79±32cfaP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01同给药前比较dP＞0.05，cP＜0.05，fP＜0.01同生理盐水组比较表二“EGB50”口服对冠状动脉结扎狗表面心电图ST段升高点数总和的影响(n＝6只/组，X±SD，mV)剂量 给药后(h)样品 给药前(mg/kg) 0.5 11.52 2.53生理盐水5ml/kg24.7±1.0 24.3±1.0a25.2±1.2a25.0±1.1a24.3±1.6a23.7±2.3a24.0±2.0a硝苯啶 5 27.2±2.4 24.0±3.2ad 23.0±2.8cf 22.5±2.3cf 22.2±1.9cf 22.2±1.8ce 21.3±2.0ceEGB50 3024.3±3.4 21.3±3.0ce 19.7±3.1cf 19.5±3.6cf 20.7±3.0cf 19.0±3.3cf 19.0±2.8ce10026.2±2.5 20.0±4.5bf 19.2±5.1cf 18.7±4.9bf 17.5±4.8cf 17.7±5.0ce 17.5±3.6cfaP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01同给药前比较dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01同生理盐水组比较表三“EGB50”对N-BT染色测定心肌梗塞范围的影响(n＝6只/组，X±SD)组别剂量 梗塞区/全心 梗塞区/左室(mg/kg) (％) (％)生理盐水5ml/kg12.7±2. 19.5±3.4硝苯啶 5 4.7±1.0c 7.1±1.3cEGB50 305.7±0.9c 8.6±1.3c100 3.5±1.8ce5.4±2.9ceaP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01同生理盐水组比较dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01同“EGB50”30mg/kg组比较表四“EGB50”对冠脉结扎狗离体培养心肌耗氧量的影响(n＝6只/组，X±SD)剂量心肌耗氧量(mmHgO)组别(mg/kg) 正常心肌 梗塞心肌生理盐水 5ml/kg36.7±2.9 26.7±4.7硝苯啶5 33.3±2.3b30.3±5.6aEGB50 3030.3±2.2c30.2±6.6a100 26.8±3.4ce 27.2±4.0adaP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01同生理盐水组比较dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01同“EGB50”30mg/kg组比较三、高含量银杏叶黄酮内酯浸膏对动物急性脑缺血的保护作用(药物同上)1、对大鼠急性脑缺血的影响大鼠口服“EGB50”50、200、500mg/kg连续8天后，经手术烧灼椎动脉，并以动脉夹夹闭双侧颈总动脉造成脑缺血，5分钟后，放松动脉夹使血流再灌，记录缺血前后及再灌后的EEG，结果所见对照组缺血再灌后EEG恢复缓慢，至60’仅恢复到正常水平的67％，“EGB50”200mg/kg，500mg/kg组作用明显，再灌10’EBG就有明显恢复，表明“EGB50”能明显改善大鼠阻断双侧颈总动脉后引起的EEG缺血性变化。(见表五)2、对狗急性脑缺血的影响动物预服“EGB50”50mg/kg、250mg/kg，10天，实验前取其自身血制备血凝块，注入其颈总动脉造成脑栓塞缺血，然后测定脑血流量(CBF)，脑血管阻力(CVR)及血清乳酸脱氢酶(LDH)含量，以川芎嗪作阳性对照。结果表明，狗口服“EGB50”能显著对抗脑缺血引起的CBF减少，CVR增加，可明显降低脑缺血引起的LDH释放增加，其作用与川芎嗪相当或更好，且其作用与剂量相关，高剂量“EGB50”作用明显优于低剂量。说明“EGB50”可改善脑循环，对急性脑缺血有较好的保护作用。(见表六、七、八)四、高含量银杏叶黄酮内酯浸膏对家兔血液流变学参数的影响“EGB50”在体外，以30μg/ml、60μg/ml的浓度明显降低家兔血液的粘弹性，减缓其增加速率，延长粘弹摸量的复钙时间。在观察其对血液凝固过程影响的实验中，也可看到上述浓度的“EGB50”能明显延长血液凝固时间，减慢凝固速率，延缓整个血液凝固的过程。“EGB50”对高、低浓度ADP和胶原诱导的血小板聚集也有明显的抑制作用，并能促进低浓度ADP引起血小板聚集后的解聚。这些结果提示“EGB50”有预防血栓形成和促进血栓溶解的作用。(见表九、十、十一、十二)
表五EGB50对大鼠脑缺血EEG的影响组别剂量 动物数 EEG电位％(X±SD)只 缺血再灌g/kg5 1030 60对照 1017.2±12.3 46.6±25.1 50.7±21.860.7±24.2川芎嗪组0.15(iv) 1016.9±6.60 66.3±35.6 93.2±16.7** 93.1±6.7EGB50 0.05(po) 1014.2±10.5 61.3±10.2 77.7±20.4852±149EGB50 0.20(po) 1027.1±25.1 93.0±36** 100.0±60** 100.0±6.0**EGB50 0.50(po) 1016.1±13.8 83.0±31 90.0±16.7** 93.9±16.3与对照组相比较*P＜0.05，**P＜0.01
表六EGB50对狗脑血流量(CBF)的影响组别 N剂量给药途径 缺血前 缺血后CBF(ml/min.100g)(只) (mg/kg)1′ 5′ 30′ 60′ 90′120′对照 6N.S i.v.251.3188.33 90.74 134.64 127.45 127.88129.20±94.80 ±33.18## ±44.28## ±73.49# ±73.53# ±73.15# ±72.93#川芎嗪 620 i.v.213.82204.08 204.20202.53 177.00 161.20154.47±68.39 ±62.90** ±65.02** ±59.44±47.88 ±44.16 ±38.37EGB50650 p.o 232.95179.03 201.02208.35 202.40 192.49176.92±88.50 ±74.81*±87.85* ±84.12±82.29 ±89.69 ±83.07EGB506250 p.o.169.85136.63 156.37166.05 152.75 148.80140.17±59.00 ±38.25*±54.64* ±80.01±75.54 ±71.69 ±66.32与缺血前比#P＜0.05，##P＜0.01与对照比*P＜0.05，**P＜0.01
表七“EGB50”狗脑血管阻力(CVR)的影响组别 N剂量给药途径 缺血前 缺血后CVR(KPa ml/min).100g，X±SD(只) (mg/kg)1′ 5′ 30′ 60′ 90′120′对照 6N.Si.v.0.06 0.140.14 0.12 0.12 0.120.12±0.03 ±0.05##±0.04## ±0.04# ±0.04# ±0.05 4#±0.04#川芎嗪 620 i.v.0.08 0.060.06 0.08 0.08 0.090.09±0.04 ±0.03**0.03**±0.02±0.02±0.02 ±0.02EGB50650 p.o 0.07 0.080.08 0.08 0.08 0.080.10±0.03 ±0.03* ±0.04* ±0.04* ±0.04±0.04 ±0.06EGB506250p.o.0.08 0.090.09 0.09 0.10 0.110.11±0.02 ±0.01* ±0.02* ±0.03±0.04±0.05 ±0.05与缺血前比#P＜0.05，##P＜0.01与照比*P＜0.05，**P＜0.01
表八“EGB50”对狗血清乳酸脱氢酶(LDH)的影响组别 N 剂量 给药途径 缺血前缺血后LDH(单位/1 00ml，X±SD)(只) (mg/kg) 1′ 5′ 30′ 60′ 90′ 120′对照 6 N.S i.v.187.6 520.6530.5 588.8 615.0 710.6 850.6±3.8 ±400.2 ±432.8 ±432.2* ±456.8* ±566.2* ±618.0*川芎嗪 6 20 i.v.180.7 230.7221.0 216.1 207.4 231.3 258.8±63.2 ±130.4 ±115.5 ±110.4 ±98.8±1 40.8 ±180.0EGB506 50 p.o 160.7 289.6260.6 202.8 190.4 186.9 210.5±94.2 ±180.8 ±158.2 ±100.6 ±90.8±88.8±110.4EGB506 250 p.o.203.1 220.3246.6 228.8 230.0 230.6 236.3±110.4±128.6 ±160.6 ±130.6 ±138.5 ±120.0 ±136.8与缺血前比*P＜0.05
表九“EGB50”对家兔血液粘弹性的影响动物数 血药浓度 Tg TG Ua(G) Ua(g) GmaxGnax药物 nug/ml mimdydc/cm2dydc/cm2×103×103对照组8 290 334 21.545.095.197.72±132 ±132 ±15.13 ±1.62 ±1.39 ±1.90川芎嗪8100 281 313 26.116.536.368.57±137 ±132 ±14.73 ±2.87 ±2.62 ±3.12EGB50 830344 366 19.244.364.346.47±171 ±1.77 ±14.11 ±211 ±181 ±1.36EGB508300431 494 14.183.673.714.69±2.48 ±2.57 ±11.39 ±1.46 ±1.80 ±1.32*EGB508600424 353 11.33334 291 402±258 ±282 ±9.34 ±1.02* ±136* ±1.76**同对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01
表十“EGB50”对家兔血液凝固过程的影响动物数 血药浓度 凝因时间 凝固速率 峰时 收缩速率药物只ug/mlmin units/min min units/min对照 8 0.58±0.0726.78±15.25 3.35±0.946.27±2.31川芎嗪 810.0 0.72±0.1235.67±15.67 3.02 ±1.00 8.20±3.73EGB5085.0 0.80±0.2621.37±10.634.12±1.20 6.35±2.65EGB50830.0 1.13±0.49* 18.58±9.115.±1.23* 4.12±1.71EGB50860.0 1.45±0.74* 15.08±6.635.92±1.33** 4.00±1.00同对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01
表十一EGB50对低浓度ADP(5×10-7g/ml)诱导的血小板聚集的抑制作用血浆药物浓度 聚集百分率药物 g/m11min 2mmin 3mmin对照 41.3±6.5 51.6±4.9 50.5±8.4EGB501×10-439.2±5.646.5±8.9 40.6±8.4EGB502×10-433.6±4.0*37.3±4.7*28.7±10.4*EGB503×10-425.5±7.0*30.1±7.4*1 15.4±11.1*(1)表中数据均用X±SD表示(2)*同对照组比较P＜0.01(3)动物数n＝8表十二对不同聚集剂诱导血小板聚集的影响聚集剂半数抑制浓度(ug/ml) 半数解聚浓度(ug/ml)EGB50阿司匹林EGB505×10-6g/mlADP 410.510.45×10-7g/mlADP 445.0409.0胶原281.7表中数值为8只动物的平均值表十三银杏酮酯与(EGB50)国内外产品比较项目 EGB50 Tebenin Tebonin保宁-forte梯波宁强力梯波宁总黄酮44％ + - - -质量黄酮甙24％ + + + +标准内酯6％ + - + -银杏酸＜10ppm+ - + -药效心血管系统(狗) + - - -研究脑血管系统 + + + -(大鼠、狗)毒理急性毒性试验 + + + +研究长期毒性试验狗 + + + -大白鼠 + + + -本发明的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的安全性研究结果如下1、急性毒性口服LD50约15g/kg，腹腔注射LD50为767mg/kg。2、长期毒性大鼠给“EGB50”最高剂量达1100mg/kg，连续灌胃90天，对大鼠食欲、活动状况及体重未见明显影响，对血像、尿液生化、组织病理等检查也未见明显影响。
Beagle狗给“EGB50”高剂量达600mg/kg，连续90天，各组动物活动正常，摄食良好，血液学、血清生化、尿常规各项指标及病理组织学检查结果，均与对照组无明显差异。停药恢复期一个月中，各组动物的各项指标均无异常。3、一般药理 “EGB50”对小鼠的自发活动无明显影响。
“EGB50”对狗的血压心率、心电图及呼吸频率、深度等均无明显影响。
上述结果表明本发明的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏对心、脑血管有较明显的保护机体、改善功能作用，能有效改善心肌缺血程度，降低血肌组织耗氧量，改善脑血管EEG缺血性症状，对抗脑血流量减少，明显降低血液粘弹性，延长血液凝固时间等，因而对心、脑血管疾病的预防和治疗作用均优于现有的产品；经毒理安全性研究、急性毒性和长期毒性都显示安全、无毒性。
本发明的另一目的是提供本发明所述的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的制备方法。
现有的银杏叶浸膏制备方法中采用了有毒有害的易燃溶剂，并且工艺繁琐、操作不便，例如中成药杂志VOL14、NO6，1992年报道的“从银杏叶提取黄酮类化合物的方法”介绍的工艺。而用这些方法不能制得高含量银杏叶黄酮内酯浸膏。
本发明公开了一种高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的制备方法。
本发明的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的制备方法是将银杏叶粗粉用水和亲水性溶剂提取，经浓缩、沉淀、过滤、柱层析分离、干燥后制得高含量银杏叶黄酮内酯浸膏。
本发明的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的制备方法具体实施是将干燥的银杏叶粉碎成粗粉，过60目筛，用原生药重量5-30倍量的水或亲水性溶剂加热回流提取或冷浸渗漉法提取，热提2-3次，每次1-3小时，或冷提1次，48-88小时，然后将提取液于低于60℃条件下减压浓缩至比重为1.15-1.25，加入原生药量的1-5倍量水溶解，静置36-72小时，过滤，滤液通过以不带离子交换基团的分离介质为载体的柱层析1-2次，再用水及水一醇混合溶剂洗脱，收集洗脱液，于低于60℃的条件下减压浓缩或喷雾干燥后制得高含量银杏叶黄酮内酯浸膏。
本发明的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的制备方法中所述的亲水性溶剂为脂肪族低级醇或低级酮等。
其中所述用于柱层析的不带离子交换基团的分离介质为大孔吸附树脂、硅胶、氧化铝、聚酰胺、硅藻土、活性炭或纤维素等。并且，这些介质可以单一使用也可混合使用。
其中所述用作柱层析洗脱液的水-醇混合溶剂中的醇为脂肪族低级醇，水与醇的比例为99-1∶1-99的任意比例。
本发明的高含量银杏叶黄酮内酯制备方法、操作简便、无苛刻的设备要求，宜于规模型工业化生产。
用本发明方法制得的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏可作为各种口服制剂如口服液、片剂、颗粒剂、硬胶囊或软胶囊等；注射剂如水针或粉针等和外用制剂的原料药中的活性成份。
实例1、制备高含量银杏叶黄酮内酯浸膏。
银杏叶干燥粗粉1kg，加70％乙醇5kg，加热回流2小时，过滤，重复热提共3次。合并滤液，50℃减压浓缩至比重1.25，加水3kg，溶解，静置36小时，过滤，滤液加至大孔吸附树脂(HP 20，0.5kg)和聚酰胺(60目，0.5kg)混合柱，分别以水1kg，10％乙醇1kg，50％乙醇2kg，95％乙醇2kg洗脱，将10％、50％、95％乙醇洗脱液合并，50℃减压浓缩，冷冻干燥，得银杏叶浸膏粉0.017kg，含总黄酮44.7％(其中总黄酮甙27.8％)，总内酯6.8％，银杏酸＜10ppm。实例2、银杏叶干燥粗粉10kg，加50％乙醇60kg，加热回流1小时，过滤，残渣加50％乙醇50kg，加热回流1小时，过滤。合并滤液，60℃减压浓缩至比重1.2，加水40kg溶解，静置72小时，过滤，滤液加至大孔吸附树脂(C1300，10kg)柱，分别以水10kg、30％乙醇10kg、60％乙醇10kg洗脱，将30％乙醇洗脱液60℃减压浓缩至无醇味，浓缩液加至聚酰胺(60目，10kg)柱，分别以水10kg、10％乙醇10kg、80％乙醇10kg洗脱，将水和80％乙醇洗脱液，及前述60％乙醇洗脱液合并，60℃减压浓缩，喷雾干燥，得银杏叶浸膏粉0.14kg，含总黄酮45.6％(其中总黄酮甙31.4％)，总内酯7.2％，银杏酸＜10ppm。实例3、银杏叶干燥粗粉50kg，加60％乙醇拌匀湿润4小时，置渗漉桶中，用60％乙醇1000kg渗漉78小时，合并渗漉液，60％减压浓缩至比重1.15，加水100kg溶解，静置48小时，过滤，滤液加至大孔吸附树脂(DA 201，50kg)柱，分别以水50kg，10％乙醇50kg，20％乙醇50kg，50％乙醇100kg依次洗脱，合并10％和20％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩至无醇味，浓缩液加至聚酰胺柱(60目，30kg)柱，用水50kg，10％乙醇50kg，20％乙醇50kg，70％乙醇100kg分别依次洗脱，将水和70％乙醇洗脱液及前述50％乙醇洗脱液合并60℃减压浓缩，喷雾干燥，得银杏叶浸膏粉0.6kg，含总黄酮46.8％(其中总黄酮甙30.1％)，总内酯6.8％，银杏酸＜10ppm。实例4、银杏叶干燥粗粉100kg，加50％乙醇1000kg，加热回流2小时，过滤，残渣用50％乙醇1000kg，加热回流2小时，过滤。合并滤液，60℃减压浓缩至比重1.2，加水300kg溶解，静置48小时，过滤，滤液加至大孔吸附树脂(DA201，30kg)和聚酰胺(60目，20kg)混合柱，分别以水100kg，30％乙醇100kg，60％乙醇100kg，90％乙醇100kg依次洗脱，将30％、60％、90％乙醇洗脱液合并，60℃减压浓缩，干燥、粉碎，得银杏叶浸膏粉1.5kg，含总黄酮47.2％(其中总黄酮甙24.8％)，总内酯6.3％，银杏酸＜10ppm。
权利要求
1.一种高含量银杏叶黄酮内酯浸膏，其特征在于该银杏叶浸膏的主要成份为含总黄酮≥44％、(其中黄酮甙≥24％)、内酯≥6％、银杏酸＜10ppm。
2.一种如权利要求1所述的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的制备方法，其特征在于该制备方法是将干燥的银杏叶粉碎成粗粉，过60目筛，用原生药重量5-30倍量的水或亲水性溶剂加热回流提取或冷浸漉滤法提取，热提2-3次，每次1-3小时，或冷提1次，48-88小时，然后将提取液于低于60℃条件下减压浓缩至比重为1.15-1.25，加入原生药量的1-5倍量水溶解，静置36-72小时，过滤，滤液通过以不带离子交换基团的分离介质为载体的柱层析1-2次，再用水及水一醇混合溶剂洗脱，收集洗脱液，于低于60℃的条件下减压浓缩、干燥后制得高含量银杏叶黄酮内酯浸膏。
3.根据权利要求2所述的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的制备方法，其特征在于其中所述的亲水性溶剂为脂肪族低级醇或低级酮。
4.根据权利要求2所述的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的制备方法，其特征在于其中所述用于柱层析的不带离子交换基团的分离介质为大孔吸附树脂、硅胶、氧化铝、聚酰胺、硅藻土、活性炭或纤维素等。并且，这些介质可以单一使用也可混合使用。
5.根据权利要求2所述的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的制备方法，其特征在于其中所述用于柱层析洗脱液的水-醇混合溶剂中的醇为脂肪族低级醇，水与醇的混合比例为水醇＝99-1∶1-99的任意比例。
全文摘要
本发明属高含量银杏叶黄酮内酯浸膏及其制备方法。本发明的高含量银杏叶黄酮内酯浸膏的主要成分含总黄酮≥44％、(其中黄酮甙≥24％)、内酯≥6％，控制银杏酸≤10ppm。本发明的银杏叶浸膏经药理、毒理研究证实其对心、脑血管有明显的保护机体、改善功能作用，使用时安全、无毒性，优于现有的银杏叶制剂。本发明提供的制备方法，操作简便，宜于规模型工业化生产。
文档编号A61K31/19GK1145230SQ9511176
公开日1997年3月19日 申请日期1995年9月15日 优先权日1995年9月15日
发明者谢德隆, 王宁, 高崎, 张国安 申请人:国家中药制药工程技术研究中心, 上海中药研究所