专利名称：银杏叶总内酯提取物及其制备方法、药物组合物和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物化学和药物化学等领域，具体而言，本发明涉及银杏植物总内酯提取物及其制备方法和用途。
背景技术：
全世界十大疾病中精神抑郁症列第五位，预计到2020年将跃升到第二位，WHO的数字显示当前全球的抑郁症患者有8500万之众，预计到2005年，抑郁症的发病率将达到总人口的10％；并且每年还有1000万-2000万人的自杀念头，尽管抑郁症严重性如此大，但这类病人中并未获得充分的治疗，仅有53％的病人曾经用药物治疗，现抑郁症的病人得到适量药物治疗者不足10％。氟西丁、舍曲林、帕罗西汀等为SSRI类药物，是许多国家作为治疗抑郁症的首选有效药物，但性功能异常的发病率高达43％，主要不良反应为性功能障碍及性快感缺失，部分病人对其反应不佳，有多种副作用和禁忌症，使病人不能耐受，难以达到满意疗效，复发率高，而且各种抗抑郁药都有可能诱发躁狂。据最近对普通开业者病人的调查SSRI退出率约为11％。近10年来，新抗抑郁药的发明目的在于增加治疗效果、提高耐受性、减少药物相互作用、减少不良反应。
银杏(Ginkgo biloba L.)主要有效成份为黄酮和银杏内酯类化合物，用于治疗脑血管循环和末梢循环障碍，如心绞痛、冠心病、脑梗塞、脑中风等。吴春富等(吴春富，游松，刘雯等，“.银杏内酯和银杏提取物对纹状体和边缘系统多巴胺及其代谢产物含量的影响”，《中草药》，1995，16(5)253～254，262)进行了银杏内酯和银杏叶提取物对纹状体和边缘系统多巴胺及其代谢产物含量的的研究，提示银杏内酯和银杏叶提取物对大鼠纹状体和边缘系统DA代谢有一定抑制作用，并推测在银杏叶提取物对中枢多巴胺代谢的影响中，银杏内酯可能起重要作用。但银杏内酯至今尚未见抗动物实验性抑郁症的研究。我们对银杏叶抑郁有效部位进行了筛选和深入研究，证实了银杏叶提取、富集、纯化的银杏内酯为抗抑郁药理作用最强的有效部位，是银杏叶提取物治疗抑郁症的有效物质群；并进一步证实总内酯比单体内酯效果好，是单体内酯非常合理的配伍，而且单体内酯之间存在一定的比例关系，有一个更佳比例。本发明的银杏叶总内酯提取物的工艺研究以此为指标，筛选出了最优工艺，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型高效、安全、无明显副作用的抗抑郁药物一银杏叶总内酯提取物；
本发明的另一目的是提供银杏叶总内酯提取物的制备方法；本发明的另一目的是提供银杏叶或其总内酯提取物用于制备治疗抑郁症的药物的用途，这种用途优选是使用本发明银杏叶总内酯提取物实现；本发明的另一目的是提供了含有本发明银杏叶总内酯提取物的治疗抑郁症的药物组合物。
本发明的银杏叶总内酯提取物系从银杏叶(Ginkgo biloba L.)或该植物其他部位(如白果、根皮、茎枝等)中提取的萜内酯，其中主要含5种萜内酯化合物，银杏内酯A(Ginkgolide A；〔15291-75-5〕BN-52020；C20H24O9)、银杏内酯B(Ginkgolide B；〔15291-77-7〕BN-52021；C20H24O10)、银杏内酯C(GinkgolideC；〔15291-76-6〕BN-52022；C20H24O11)、银杏内酯J(Ginkgolide J；〔107438-79-9〕BN-52024；C20H24O10)及白果内酯(Bilobalide，C15H18O8)(以下分别简称GA、GB、GC、GJ及BB。各内酯在总内酯中的含量，其中GJ占总内酯3％-15％，GC占总内酯8％-30％，BB占总内酯20％-65％，GA占总内酯15％-50％，GB占总内酯3％-40％。银杏叶总内酯提取物中总内酯的含量≥50％，优选≥70％。本发明人研究发现，银杏叶或其总内酯可以用于治疗抑郁症，这种用途优选使用本发明银杏叶总内酯提取物实现。
本发明的银杏叶总内酯提取物可以通过下面的方法制备得到银杏叶粗粉，用50％～80％(v/v)乙醇或用丙酮提取，回收溶剂，上大孔吸附树脂柱，水洗去杂质，5％～20％(v/v)乙醇洗脱去杂质后，改用50％～80％(v/v)乙醇洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液，浓缩，醋酸乙酯提取。回收溶剂，真空干燥，得银杏叶总内酯提取物。
本发明银杏叶总内酯提取物的优选的制备方法是银杏叶粗粉，丙酮提取，回收溶剂，上大孔吸附树脂柱，水洗去杂质，5％～20％(v/v)乙醇洗脱去杂质后，改用60％～80％(v/v)乙醇洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液，浓缩，醋酸乙酯提取。回收溶剂，真空干燥，得银杏叶总内酯提取物。
本发明银杏叶总内酯提取物的更优选的制备方法是银杏叶粗粉，70％～80％(v/v)乙醇提取，回收溶剂，上大孔吸附树脂柱，水洗去杂质，10％～15％(v/v)乙醇洗脱去杂质后，改用60％～70％(v/v)乙醇洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液，浓缩，醋酸乙酯提取。回收溶剂，或重结晶，真空干燥，得银杏叶总内酯提取物。
本发明与其他从银杏叶中提取萜内酯的方法及其得到的产品不同，其显著特点是本发明采用了大孔吸附树脂与聚酰胺柱串联方法提取处理。如果单用大孔吸附树脂，除了无法达到高含量(＞75％)的总内酯外，更无法除去银杏叶提取物中的黄酮部分，而该黄酮部分非但无抗抑郁活性，相反，还呈现出拮抗作用和明显的抑制食欲作用。本发明采用大孔吸附树脂与聚酰胺柱串联方法提取处理，聚酰胺柱将大孔吸附树脂柱洗脱下来的黄酮化合物牢固吸附在柱上，而萜内酯却很容易被水洗脱下来，从而达到完全分离的目的，制备得到本发明的银杏叶总内酯提取物。尽管李新岗等(李新岗，韦玮，陈薇.富含银杏内酯的银杏叶干浸膏制备工艺.中国医药工艺杂志，1998，29(1)8)也采用了大孔吸附树脂与聚酰胺柱串联方法，但与聚酰胺柱串联目的根本不同，他们旨在去除鞣质，所以大孔吸附树脂95％乙醇洗脱流出液，不经回收乙醇直接上聚酰胺柱，这是与本发明采用大孔吸附树脂与聚酰胺柱串联方法不同的关键所在，结果流出液中萜内酯与黄酮成分同时被洗脱，得到的产品黄酮含量27.4％，银杏内酯含量10.6％；不同之二我们聚酰胺柱采用水洗脱，而李新岗等采用95％乙醇洗脱；不同之三我们采用聚酰胺柱水洗脱液浓缩，醋酸乙酯提取的纯化与精制工艺，只有通过这一步骤方能达到总内酯含量＞75％目标；而李新岗等没有设计这一步骤。因此李新岗等采用大孔吸附树脂与聚酰胺柱串联方法得到的产品，更不用说具有银杏叶总内酯提取物抗抑郁症的活性强度了。
根据本发明的制备方法制备得到的银杏叶总内酯提取物，其中GJ，GC，BB，GA和GB的含量相对固定，这种配伍对本发明的银杏叶总内酯的抗抑郁作用很有益。
本发明制备得到的银杏叶总内酯提取物中，各内酯在总内酯中的重量含量其中GJ的含量是3％-15％，GC的含量是8％-30％，BB的含量是20％-65％，GA的含量是15％-50％，GB的含量是3％-40％；本发明优选的银杏叶总内酯提取物是，各内酯在总内酯中的重量含量其中GJ的含量是3％-10％，GC的含量是10％-20％，BB的含量是38％-55％，GA的含量是18％-30％，GB的含量是4％-15％；本发明更优选的银杏叶总内酯提取物是，各内酯在总内酯中的重量含量其中GJ的含量是3％-5％，GC的含量是12％-20％，BB的含量是40％-52％，GA的含量是20％-30％，GB的含量是5％-15％，总内酯含量≥70％。
本发明的银杏叶总内酯提取物具有良好的抗抑郁效果，可以用于制备治疗抑郁症的药物。
本发明的治疗抑郁症的银杏叶总内酯提取物药物组合物由本发明的银杏叶总内酯提取物和可药用辅料组成，其可以通过制药领域的常规方法制备得到。
本发明研究发现，银杏叶总内酯提取物、GA与GB的混合物(纯度≥98％，GA含量略高于GB)、BB(纯度≥98％)及高活性银杏叶提取物(其中总内酯12％，总黄酮48％)对大鼠和小鼠均有抗抑郁作用，并且银杏叶总内酯提取物(灌胃给药剂量小鼠总内酯7.2mg/kg、大鼠总内酯3.6mg/kg)的药理作用与其它3种比较均有显著性差异P＜0.01，而与丙咪嗪(灌胃给药剂量小鼠50mg/kg、大鼠25mg/kg)比较则没有显著性差异(P＞0.05)。它们的药理作用强度总内酯＞GA与GB的混合物＝高活性银杏叶提取物＞BB。本发明银杏叶总内酯提取物对多种抑郁症动物模型均十分有效，能减少悬尾小鼠的不动时间、减少强迫游泳小鼠的不动时间、能增加电击所致抑郁大鼠的成功逃跑次数，作用与丙咪嗪相似。GA与GB的混合物能加重大鼠的焦虑，BB则有抗焦虑作用。本发明制备得到的银杏叶总内酯提取物中总内酯相当于银杏萜内酯的复方制剂，其中BB有抗焦虑作用，有助于焦虑抑郁患者的治疗，同时又拮抗GA与GB混合物加重焦虑的副作用，由此可见，本发明制备得到的银杏叶总内酯提取物中，各内酯配比对抗抑郁作用有显著意义，萜内酯组方非常合理。高活性银杏叶提取物中含总内酯12％，虽其中的总内酯量与本发明制备得到的银杏叶总内酯提取物中的总内酯给药量相等，但前者抗抑郁作用明显不如本发明银杏叶总内酯提取物，从制备工艺与主成分分析，高活性银杏叶提取物比银杏叶总内酯提取物多黄酮部分，由此推测高活性银杏叶提取物中的黄酮部分无抗抑郁活性，相反，似乎还呈现出拮抗作用，此外，高活性银杏叶提取物中的黄酮部分尚有明显的抑制食欲作用。小鼠急性毒性试验与大鼠连续给药6个月长期毒性试验及Beegle犬连续给药9个月长期毒性试验表明，本发明银杏叶总内酯提取物具有毒性低，中毒剂量与有效剂量距离较大。同时观察到本发明银杏叶总内酯提取物对雄性大鼠的交配能力、精子数量和活力以及雌性大鼠的性周期、产仔率、仔鼠成活率、仔鼠生长发育均无异常。试验还表明，本发明银杏叶总内酯提取物长期用药机体不产生身体依赖和精神依赖。
因此，本发明研究证明，本发明提供的银杏叶总内酯及其银杏叶总内酯提取物有明确的抗抑郁作用，可以用于治疗抑郁疾病。本发明银杏叶总内酯提取物的优点是有效剂量低(为丙咪嗪的1/7)，安全性大，副作用小，没有明显的如GA与GB混合物致焦虑作用，没有明显的如高活性银杏叶提取物抑制食欲作用，更没有丙咪嗪严重抑制食欲作用和引起平衡障碍作用，尤其是受到反复电击的情况下，银杏叶总内酯提取物组动物的一般状况好于其它各组。本发明的研究还表明，本发明银杏叶总内酯提取物对性功能及生殖未见明显影响，无成隐性，对心血管、运动系统、共济平衡及肌力没有影响；本发明银杏叶总内酯提取物的急性毒性和长期毒性试验未发现明显毒性反应。
本发明的银杏叶总内酯提取物可以与可药用辅料组合，被制成药物组合物，用于治疗抑郁症。这种药物组合物可以是片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、注射剂、口腔速释制剂、缓控释制剂等形式。
具体实施例方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。另外，在本发明中，(v/v)表示体积比浓度或者体积比；(w/w)表示重量比浓度或者重量比；(w/v)表示重量/体积比浓度或者重量/体积比，其对应的单位是(克/毫升)；(rpm)表示每分钟的转数(转/分钟)；(d)表示天，(h)表示小时，(min)表示分钟，(s)表示秒。除非另有说明，本发明的百分数是重量百分数，除另有规定，本发明使用实施例1制备得到的银杏叶总内酯提取物进行药理试验和制剂制备。
实施例1本发明银杏叶总内酯提取物的制备取银杏叶粗粉2kg，加60％乙醇20升，加热回流、提取2次，每次3小时，回收乙醇，上DM-130大孔吸附树脂(山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂生产)柱，60％乙醇冼脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱(柱层析，上海化学试剂公司出品)，水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩至适量，用醋酸乙酯提取，回收溶剂，80℃真空干燥，得银杏叶总内酯3.8g，总内酯含量83.38％。各内酯在总内酯中的含量，其中GJ的含量是3.62％，GC的含量是12.70％，BB的含量是49.59％，GA的含量是27.27％-，GB的含量是6.83％.
实施例2本发明银杏叶总内酯提取物的制备取银杏叶粗粉2kg，加丙酮24升加热回流，提取2次，每次2小时，回收丙酮，上DM-130大孔吸附树脂(山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂生产)柱，60％乙醇冼脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱(柱层析，上海化学试剂公司出品)，水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩至适量，用醋酸乙酯提取，回收溶剂，80℃真空干燥，得银杏叶总内酯3.95g，总内酯含量85.11％。各内酯在总内酯中的含量，其中GJ的含量是7.37％，GC的含量是14.94％，BB的含量是47.84％，GA的含量是24.83％，GB的含量是5.02％。
实施例3本发明银杏叶总内酯提取物的制备取银杏叶粗粉2kg，加丙酮24升加热回流，提取2次，每次2小时，回收丙酮，上D101大孔吸附树脂(天津农药厂生产)柱，70％乙醇冼脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱(柱层析，上海化学试剂公司出品)，水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩至适量，用醋酸乙酯提取，回收溶剂，80℃真空干燥，得银杏叶总内酯4.87g，总内酯含量71.76％。各内酯在总内酯中的含量，其中GJ的含量是9.41％，GC的含量是20.22％，BB的含量是40.58％，GA的含量是24.65％，GB的含量是5.15％。
实施例4本发明银杏叶总内酯提取物的制备取银杏叶粗粉2kg，加70％乙醇24升，加热回流、提取2次，每次3小时，回收乙醇，上DM-130大孔吸附树脂(山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂生产)柱，10％乙醇洗去杂质后，改70％乙醇冼脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱(柱层析，上海化学试剂公司出品)，水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩至适量，用醋酸乙酯提取，水洗醋酸乙酯提取液，无水硫酸钠脱水，回收溶剂，重结晶，80℃真空干燥，得银杏叶总内酯3.10g，总内酯含量93.13％。各内酯在总内酯中的含量，其中GJ的含量是4.11％，GC的含量是15.08％，BB的含量是45.64％，GA的含量是25.14％，GB的含量是10.03％。
实施例5高活性银杏叶提取物的制备取银杏叶粗粉2kg，加70％乙醇24升，加热回流、提取2次，每次3小时，回收乙醇，上DM-130大孔吸附树脂(山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂生产)柱，70％乙醇冼脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱(柱层析，上海化学试剂公司出品)，水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩至适量，用醋酸乙酯提取，回收溶剂，80℃真空干燥，得银杏叶总内酯提取物4.5g，总内酯含量87.13％，备用。水洗脱后的聚酰胺柱，用10％乙醇洗去杂质后，用稀醇洗脱，真空浓缩，喷雾干燥，得银杏叶总黄酮提取物13.7g，，总黄酮含量55.87％，加前面所得的银杏叶总内酯提取物2.2g，混合均匀，得高活性银杏叶提取物15.9g，其中总内酯含量12.05％，各内酯在总内酯中的含量，其中GJ的含量是3.62％，GC的含量是14.67％，BB的含量是45.68％，GA的含量是26.04％-，GB的含量是9.99％；总黄酮含量48.04％。
实施例6本发明银杏叶总内酯抗抑郁作用研究材料白果内酯(BB)纯度为≥99％(系发明人采用银杏叶总内酯经硅胶柱层析分离得到)银杏叶总内酯提取物实施例1制备；以下简称总内酯内酯GA∶GB(57∶43)混合物纯度为≥98％(系发明人采用银杏叶总内酯经硅胶柱层析分离得到单体配制而成，GA的比例略高GB)高活性银杏叶提取物实施例5制备；以下简称高活性用蒸馏水分别按顺序将上述银杏叶提取物溶成0.675mg.ml-1，1.15mg.ml-1，0.675mg.ml-1，8.2mg.ml-1的药液灌胃用；盐酸丙咪嗪25mg/片由上海九福药业公司生产，批号990409，同样溶成12.5mg.ml-1和5mg.ml-1的药液灌胃用；SD大鼠、昆明种小鼠。
方法和结果1.1小鼠悬尾试验选取体重20～24g的雄性小鼠60只，按体重随机分为6组，即生理盐水对照组(NS)、盐酸丙咪嗪组、BB组、总内酯组、GA∶GB组和高活性组，每组10只。按体重分别灌胃给药，剂量见表1，生理盐水组灌服等容量生理盐水，每天一次，共5天。于第5次给药后30分钟开始实验。实验时将小鼠尾端2cm的部位贴在一木棍上，使动物成倒挂状态，其头部离地面约5cm。两侧用板隔开动物视线，记录动物6min内后3min的不动时间。给药前实试验1次，给药5天后试验一次。计算小鼠自身两次不动时间的差值经1g(X+86)转换后进行统计学分析，结果见表1。
4种银杏叶提物物用药后小鼠悬尾不动时间与NS组比较有所延长，经F检验分析发现，4个用药组动物的用药前后不动时间的差值与NS组比较有显著性差异，P＜0.01，即这4种银杏叶提取物在此模型上有抗抑郁作用。
表1四种银杏叶提取物对小鼠悬尾试验的影响
n＝10)
ANOV统计分析法*银杏叶总内酯提取物给药剂量以其中的总内酯计(以下同)。
1.2小鼠强迫游泳试验选取体重20～24g的雄性小鼠60只，分组及给药同试验1.1。见表2。于第5次给药后30分钟开始实验。将小鼠放入水深10cm的量筒中(高20cm，直径14cm)，水温30℃。计算小鼠自身两次不动时间的差值经1g(X+45)转换后进行统计学分析，结果见表2。
结果证实，受试的4种银杏叶提取物及丙咪嗪均能延长小鼠强迫游泳时的不动时间，与生理盐水组比较，可延长18.09～34.14％。经方差分析，6个实验组小鼠不动时间差值显著不同，有非常显著性统计学意义(P＜0.01)。由经Newman-Keuls统计分析，丙咪嗪及4种银杏叶提取物减少小鼠强迫游泳中的不动时间分别与生理盐水比较有显著统计学意义(P均＜0.01)。又丙咪嗪、总内酯组药效比GA∶GB组强(P均＜0.01)。
表2种银杏叶提取物对小鼠强迫游泳试验的影响 n＝10)
※※P＜0.01与NS组比较 ANOV及Newman-Keuls统计学分析法1.3大鼠抗抑郁试验用获得性无助电击模型观察药物的抗抑郁作用。选取雄性大鼠70只，体重180～200g，按体重随机分为7组，即正常对照组、生理盐水对照组(模型组，NS)、BB组、总内酯组、GA∶GB组、高活性组和丙咪嗪组，每组10只。按体重分别灌胃给药，剂量见表，生理盐水组灌服等容量生理盐水，每天一次，共35天。于第30次给药30分钟后开始实验。实验第一天进行“无助诱发”，用一20×10×10cm3的底部为铜栅的笼子，给动物施以60次随机的无法逃避的足部电击(0.8mA，15s，每1min±15s给一次)，正常对照组大鼠放入笼中相同时间但不给电击。48h后开始进行回避训练。用60×20×30cm3的穿梭箱，底部铜栅间隔为1.0cm。将动物单个地放入穿梭箱一端，让其适应5min后进行20次的回避训练，每次间隔30s。训练时先给予一个灯光信号，允许动物在此期间达另一端以逃避电击，若无反应发生，则光信号再持续出现3s，同时还出现一个0.8mA，3s的足部电击，若仍无反应发生，电击和光信号立即停止并记作一次逃避失败。训练共进行5天。记录每只大鼠每天训练时的逃避成功次数，对第5次训练结果进行统计分析。
根据试验结果分析，NS组与正常组比较，大鼠成功逃避次数明显减少(t＝3.99，P＜0.01)，说明大鼠抑郁模型是成功的。试验用4种银杏叶提取物及丙咪嗪对无可逃避电击造成的抑郁状态大鼠均有改善作用，以总内酯组尤其显著，经方差分析，7个实验组大鼠逃避成功次数显著不同，有非常显著统计学意义(P＜0.01)。又经Newman-Keuls统计法进一步分析，4种银杏叶提取物及丙咪嗪对抑郁大鼠的作用与生理盐水比较有显著统计学意义(P均＜0.01)，并且总内酯的药理作用与其它3种提取物比较均有显著差异，P均＜0.01，而与丙咪嗪比较则没有显著差别(P＞0.05)。另3种提取物间药效以BB为弱，GA∶GB及高活性提取物间药效则未见显著差别。这3种提取物药效均较丙咪嗪为弱(P均＜0.01)。见表3。
表3四种银杏叶提取物对大鼠抑郁状态的影响
n＝10)
※※P＜0.01，与NS组比较，△△P＜0.01，与总内酯组比较。ANOV及Newman-Keuls统计分析法结论1、银杏叶4种提取物以本试验中所采用剂量，对大鼠和小鼠均有抗抑郁作用。它们的药理作用强度总内酯＝丙咪嗪＞GA∶GB＝高活性＞BB。
2、GA、GB混合物能加重大鼠的焦虑和致僵木作用，BB则有抗焦虑作用。高活性银杏叶提取物明显抑制食欲作用。
3、银杏叶总内酯提取物抗抑郁的优点是副作用小，没有明显的GA、GB致焦虑和致僵木作用，没有明显的高活性银杏叶提取物抑制食欲作用，更没有丙咪嗪严重抑制食欲和引起平衡障碍作用，尤其在受到反复电击的情况下，总内酯组动物的一般状况好于其他各组。
4、银杏叶4种提取物以本试验中所采用剂量，均有镇静作用，但并不影响动物的运动、进食等活动。
实施例7银杏叶总内酯提取物对抑郁状态的影响材料受试药物银杏叶总内酯提取物实施例1制备，灌胃试验用药液为2.5％阿拉伯胶生理盐水混悬液。
动物昆明种小鼠，SD大鼠。
其它药品盐酸丙咪嗪为上海九福制药厂产品(批号990401)。
1.1对小鼠不动时间的影响选取体重20～24g的雄性小鼠50只，按体重随机分为5组，即生理盐水对照组、银杏叶总内酯提取物12.5、25.0、50.0mg·kg-1组、盐酸丙咪嗪组30.0mg·kg-1，每组10只。用以上剂量按体重分别灌胃给药1次，生理盐水组灌服等容量生理盐水，实验时将小鼠成倒挂状态，其他同实施例6中1.1的实验方法。给药前实验1次，给药后1h实验一次。计算小鼠自身两次不动时间的差值，作方差分析。
另取体重20～24g的雄性小鼠50只，分组情况同上。分剂量按体重分别ig给药，生理盐水组ig等容量生理盐水，每日1次，共3d，同上法给药前试验一次，给药3d后试验一次。计算出小鼠不动时间/6min的比值和自身两次试验的差值，作方差分析。
银杏叶总内酯提取物用药后小鼠悬尾不动时间与生理盐水组比较有所延长，且随剂量增加，小鼠不动时间剂量依赖性地延长，经F检验分析发现，5组小鼠的用药前后差值有显著性差异，P＜0.01，即银杏叶总内酯提取物在此模型上有抗抑郁作用。
1.2使小鼠悬尾不动时间减少的ED50测定选取体重20～24g的雄性小鼠100只，按体重随机分为10组，即银杏叶总内酯提取物5.12、6.4、8.0、10.0、12.5mg·kg-1组、盐酸丙咪嗪12.29、15.36、19.2、24.0、30.0mg·kg-1组，每组10只。同上法进行小鼠悬尾实验，以前后差值达10％为药物有效，结果用bliss法计算出使小鼠悬尾不动时间减少的银杏叶总内酯提取物ED50±L95＝7.27±0.91mg·kg-1，丙咪嗪ED50±L95＝16.90±2.40mg·kg-1。
1.3对小鼠强迫游泳不动时间的影响选取体重20～24g的雄性小鼠50只，分组及给药同试验1.1，给药4d，于第4次给药后1h开始实验。将小鼠分别放入水深10cm的量筒中(高20cm，直径14cm)，水温25℃。记录动物6min内后4min的不动时间。计算小鼠不动时间/6min的比值，与对照组比较，作方差分析。
结果证实，银杏叶总内酯提取物及丙咪嗪30.0mg·kg-1均能延长小鼠强迫游泳时的不动时间，与生理盐水组比较，银杏叶总内酯提取物12.5-50.0mg·kg-1可延长17.98～37.49％。经方差分析，5个实验组小鼠不动时间差值显著不同，有显著性统计学意义(P＜0.01)。
1.4对抑郁大鼠的影响用获得性无助电击模型[4]观察药物的抗抑郁作用。选取雄性大鼠60只，体重180～200g，按体重随机分为6组，即正常对照组、生理盐水对照组(模型组)、银杏叶总内酯提取物7.5、15.0、30.0mg·kg-1组和丙咪嗪20.0mg·kg-1组，每组10只。按体重分别ig给药，生理盐水组ig等容量生理盐水，每天1次，共35d。于第28次给药1h后开始实验。实验第1d进行″无助诱发″，其他同实施例6中1.3的实验方法。
根据试验经方差分析，6个实验组大鼠逃避成功次数显著不同，有显著统计学意义(P＜0.01)。无可逃避电击造成的抑郁状态大鼠与正常对照组大鼠逃避成功次数有显著统计学差异(P＜0.01)，银杏叶总内酯提取物对无可逃避电击造成的抑郁状态大鼠成功逃避电击有积极作用，且有剂量依赖性。丙咪嗪对抑郁状态大鼠也有改善作用(P＜0.01)。
实施例8对心血管、运动系统药理作用研究材料受试药物银杏叶总内酯提取物实施例1制备，灌胃试验用药液为2.5％阿拉伯胶生理盐水混悬液。
动物昆明种小鼠，SD大鼠。
其它药品和试剂东莨菪碱(Scopolamine，Sco)为广东侨业制药有限公司产品，盐酸噻啦嗪(Xylazine，Xyl)由军事医学科学院防化所提供，盐酸丙咪嗪为上海九福制药厂产品(批号990401)。
仪器与设备CPRS血压心电生理电脑监测系统(江西医学院功能中心研制，已通过省级鉴定)，压力换能器等。
统计分析结果用皖南医学院研制的NDST软件进行统计分析。
方法与结果2.1银杏叶总内酯提取物对心血管的影响选用实验大鼠，乌拉坦1.5g·kg-1ip麻醉，颈总动脉插管，连接压力换能器、心电导线后与CPRS生理监测系统联接，待动物反应稳定后，记录一段给药前观察值，即心率、心律、收缩压、舒张压、呼吸频率、节率及呼吸幅度。然后十二指肠注射给予银杏叶总内酯提取物，剂量分别为7.5，15.0，30.0，50.0，75.0，100.0mg·kg-1，给药体积为2.5ml·kg-1，对照组给予等容量生理盐水，分别于给药20，30，60min后观察记录以上各指标。
结果表明，银杏叶总内酯提取物一次给药7.5-50.0mg·kg-1对麻醉大鼠收缩压、舒张压、心律、心率、呼吸频率、节律、深度均无显著影响，给药后20，30，60min各观察值与自身给药前比较，差异无显著性(P＞0.05)。给药后2小时内大鼠未出现心律失常。当给药量达到75mg·kg-1时，给药20min后大鼠血压下降约20mmHg，40min后可恢复到用药前血压水平。但给药量达到100.0mg·kg-1以上时，血压下降更多，且不能恢复到给药前水平。以上结果提示大鼠用银杏叶总内酯低于50.0mg·kg-1是安全剂量。
2.2银杏叶总内酯提取物对协调平衡运动的影响2.2.1小鼠平衡试验和转棒试验取小鼠，体重19～22g，♂♀兼用，按性别体重随机分为6组，每组12只①对照组②-⑤银杏叶总内酯提取物12.5、25.0、50.0、100.0mg·kg-1组⑥噻啦嗪10.0mg·kg-1组。给药前先进行转棒试验，将小鼠放在自制的水平转棒盘上，杆直径为2.5cm，转速16次/min，选在棒上停留3min以上小鼠进行下一步实验。各组按上述剂量ig给药，对照组给予等容量生理盐水，给药体积0.2ml/10g，每天1次，连续7d，末次给药1h后试验。转棒试验时记录在转棒盘上失平衡的鼠数，再将小鼠放在一60cm长，直径为0.8cm的悬空水平棒上，动物凡3min内落下3次以上者为失去平衡，记录落3min内落下3次以上的鼠数。
实验证实，α2受体阻断剂Xyl 10.0mg·kg-1使8/12小鼠转杆失能，与其镇静和肌松作用有关。银杏叶总内酯提取物12.5-50.0mg·kg-1对小鼠的共济协调平衡没有不良影响，100.0mg·kg-1以上影响小鼠的共济协调平衡能力，降低小鼠转杆和握杆能力，但无统计学意义(P＞0.05)。
2.2.2倾斜板法取大鼠40只，体重160～200g，♂♀兼用，按性别体重随机分为4组①对照组②-④银杏叶总内酯提取物7.5、15.0、30.0mg·kg-1组，给药前选在转棒盘上(杆直径为7.5cm，转速为8次/min)停留3min以上大鼠进行下一步实验。各组按上述剂量给药，对照组给予等容量生理盐水，给药体积1.0ml/100g，每天1次，连续7d，末次给药1h后试验。转棒试验时记录在转棒盘上失平衡的鼠数，再将大鼠放在一平滑的木板上，将木板一头向下倾斜45°，记录滑下动物数。
大鼠用银杏叶总内酯提取物7.5-30.0mg·kg-1不影响协调平衡功能，与对照组大鼠比较，无显著性差异，P＞0.05。
2.2.3游泳法取2.2.2实验鼠，另取大鼠10只，体重与2.2.2实验鼠相近，ig盐酸丙咪嗪30mg·kg-1，每日一次，共7d。于给药第1d，第2d，及第7d放入Morris水迷津中游泳。
分析结果发现，丙咪嗪组大鼠在第2d游泳时开始失平衡，在水中身体倾斜向一侧，但不影响在水迷津中的游泳速度和方向识别，至第5d时，失平衡状态减轻。银杏叶总内酯提取物各组大鼠则没有失平衡现象，提示银杏叶总内酯提取物对平衡功能损伤较丙咪嗪为轻。
2.3对肌力的影响用牵引试验观察小鼠和大鼠的肌力。取雄性小鼠和雄性大鼠，给药剂量见表，每天1次，共7d，于末次给药后1h将动物的两个前爪放在水平金属丝上(大鼠0.2cm，小鼠0.1cm)，如3s内动物跌落或仅一个爪抓住金属丝均属失败，记录失败动物数。
结果表明，银杏叶总内酯提取物小鼠剂量12.5-50.0mg·kg-1、大鼠剂量7.5-30.0mg·kg-1，用药7d对啮食类动物的肌力没有影响。
结论小鼠给予12.5-50.0mg·kg-1，大鼠7.5-30.0mg·kg-1的银杏叶总内酯提取物，用药7天对啮食类动物的共济协调平衡及肌力没有影响，与对照组动物比较无差异。在游泳试验中与丙咪嗪组动物比较，平衡功能的损伤更小。
实施例9对性功能及生殖的影响受试药物同实施例8，用5％阿拉伯胶生理盐水溶液配成合适的浓度，直接给动物灌胃用。动物及统计分析同实施例8及实验结果用皖南医学院软件NDST分析计算。
3.1对雌性大鼠动情周期的影响取长期毒性试验中给药3个月的雌性实验鼠，10.0、60.0、120.0mg·kg-1组及生理盐水对照组，每组10只，体重205-266g，用棉拭子取大鼠阴道细胞于生理盐水混匀后，至低倍显微镜下观察，每日1次，共6次。
观察结果表明，受试本发明银杏叶总内酯提取物的各组雌性大鼠的动情周期没有受到影响，动情期与动情间期区别明显，发情后期可见角化上皮细胞，形状大而不规则，与对照组相似，发情周期则只见少量的白细胞，无角化上皮。
3.2对雄性大鼠交配能力及精子数量、活力的影响同实验3.1，用长期毒性试验中给药3个月的雄性鼠，每组取6只，以雌∶雄1∶1比例与成年处女鼠和笼，以两周内雌鼠阴道出现精子认为是雄鼠有交配能力，计算雄鼠交配率(％)。然后处死大鼠，取下附睾，用剪刀在一端按十字型剪开，吸取0.1ml精液，置盛有2ml生理盐水的试管中摇匀，静置30min后，滴于计数板上，观察精子活力并计数。
银杏叶总内酯提取物长期给药(10.0-120.0mg·kg-1)对雄性大鼠的交配能力，精子数，精子活动影响不明显，与对照组比较，无统计学意义(p＞0.05)。
3.3对大鼠生殖的影响取3.2实验中120.0mg·kg-1组交配受孕雌性大鼠2只，受孕后21d分别产仔11只(7♂，4♀)和(6♂，6♀)，与对照组受孕雌鼠产仔(2只，一只产仔10只，4♂，6♀，一只产仔11只5♂，6♀)比较，仔鼠外观无畸形，仔鼠之间体重均衡，体重增长、发育良好，仔鼠无一死亡。可以认为银杏叶总内酯提取物120.0mg·kg-1以下对雌性大鼠的产仔数、仔鼠存活率、仔鼠外观、生长发育无不良影响。
实施例10成隐性试验受试药物、统计方法同实施例8。其他药品盐酸吗啡粉针为沈阳第一制药厂产品；安定粉针为上海制药三厂产品。
方法与结果4.1小鼠自然戒断试验取小鼠50只，体重18-22g，♂♀各半。按性别体重随机分为①正常对照组②阳性对照组③银杏叶总内酯提取物12.5mg·kg-1组④银杏叶总内酯提取物25.0mg·kg-1组⑤银杏叶总内酯提取物50mg·kg-1组。将盐酸吗啡掺入配合饲料中(每克料含盐酸吗啡1.1mg)饲喂②组小鼠。③-⑤组小鼠按不同剂量ig(ig表示口服给药)银杏叶总内酯提取物，正常对照组ig生理盐水，每日一次，共7d。于7d给药后立即称体重，然后开始戒断，即②组小鼠换上不掺药的配合饲料饲养，③-⑤组小鼠停止灌胃给药。各组小鼠每隔4h称一次体重，至恢复正常为止。以戒断前的体重为基数，计算戒断后各时间点小鼠体重下降的百分率，分别统计ig银杏叶总内酯提取物各组与阳性对照组体重变化的差异程度。
由实验结果可见，银杏叶总内酯提取物给药7d后突然停药后小鼠不出现戒断症状，与吗啡组的戒断症状如体重变化比较，差异有非常显著性(p＜0.01)。
4.2大鼠替代实验取♂大鼠30只，体重300g±65s，按体重随机分为3组①阳性对照组，用药物掺食法在饲料中给予安定52-160mg·kg-1，②-③银杏叶总内酯提取物30.0mg·kg-1、60.0mg·kg-1组，ig每日一次，连续12周后，突然中断喂食安定和银杏叶总内酯提取物ig，观察大鼠是否出现戒断症状，并称体重，36h后阳性对照组ig安定10.0mg·kg-1，②、③组ig银杏叶总内酯提取物30.0、60.0mg·kg-1，观察大鼠症状是否消失，体重是否恢复。
实验表明，长期饲喂安定，突然停药后，大鼠出现戒断症状，表现为兴奋不安，食量减少，流涎，36h后体重下降明显，立即给予安定后症状减轻，体重恢复较快，而ig银杏叶总内酯提取物30-60mg·kg-1而对成瘾大鼠的戒断症状无改善，ig后体重也未恢复，与阳性对照组比较，p＞0.05。可以认为，银杏叶总内酯提取物对安定成瘾大鼠的戒断症状无替代取消作用。
4.3条件性位置偏爱试验用两个大小一致50×25×25的正方体盒子，盒子四壁光滑，做成黑色和白色，盒子地板面分别为粗糙面和光滑面，中间有活动隔板，开启时用于二盒之间通道，顶部加盖。
取大鼠30只，体重200g±20g，♂♀兼用，按性别体重随机分为生理盐水对照组和银杏叶总内酯提取物(30.0、60.0mg·kg-1)组。实验第1d将大鼠放入抽去隔板的盒中，记录大鼠20min内在黑/白盒中分别停留的时间，然后按不同剂量ig银杏叶总内酯提取物，封闭两盒间通道，将大鼠放置于白盒中，20min后取出，第2d同一时间，ig等容量5％阿拉伯胶生理盐水溶液，将其放入黑盒中停留20min后取出，重复3次后于第7d进行测试，即在不给药的情况下，抽取两盒间隔板，将大鼠放入盒中，记录大鼠20min内在黑/白盒中分别停留的时间，观察动物的偏爱位置，与第一次测试相比较。
由试验结果分析，银杏叶总内酯提取物不能增加大鼠在白盒中的停留时间，与生理盐水组比较，p＞0.05，即银杏叶总内酯提取物不影响大鼠的位置偏爱。
实施例11急性毒性试验银杏叶总内酯提取物对小鼠一次性灌胃给药，雄性LD50为3030.5±646.6mg·kg-1，雌性LD50为2828.7±574.3mg·kg-1；腹腔注射给药雄性小鼠LD50为412.2±47.6mg·kg-1，雌性小鼠LD50为457.9±67.4mg·kg-1。对大鼠一次性灌胃给药，雄性LD50为1073.7±92.8mg·kg-1，雌性LD50为1096.2±139.0mg·kg-1；腹腔注射给药雄性大鼠LD50为410.2±44.7mg·kg-1，雌性大鼠LD50为410.2±45.1mg·kg-1。无性别差异。
实施例12大鼠长期毒性试验银杏叶总内酯提取物用三个剂量10.0mg/kg/日、60.0mg/kg/日、120.0mg/kg/日连续给药6个月，除大剂量组动物大鼠进食较少、体重增长减慢外，大鼠外观体征、行为活动、大小便、血液学指标、血液生化学指标、系统尸解、脏器系数、全身主要器官组织的病理组织学检查均未发现其它毒性反应。
实施例13犬长期毒性试验银杏叶总内酯提取物用三个剂量81.0mg/kg/日、27.0mg/kg/日、9.0mg/kg/日连续给药9个月。试验初期，中、大剂量给药组部分动物出现进食后呕吐反应，约持续3周，3周后基本停止呕吐，其它动物活动自如，大小便正常，体重自然增加。重要脏器系数各组动物的脑、心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏等17项脏器系数末发现明显差异；病理切片检查各组动物的脑、脊髓、胸腺、甲状腺等共26项脏器病理切片均未发现明显病理性病变；恢复期检查发现血液学和尿液检查各项指标均在正常范围；心电图仅见心律不齐，基本在正常范围；病理学检查各脏器均未发现明显病理性改变。
实施例14片剂片剂处方银杏叶总内酯提取物 0.3kg玉米淀粉 0.6kg羟丙基淀粉 0.06kg微晶纤维素 0.02kg硅酸铝 0.02kg低取代羟丙基纤维素 0.03kg硬脂酸镁 0.0003kg制法 将银杏叶总内酯提取物(过80目筛)，加淀粉(80℃烘)、羟丙基淀粉、微晶纤维素、硅酸铝、低取代羟丙基纤维素置流化床制粒机中喷雾2％HPMC酒精制粒，过14目筛整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压10000片，即得。
实施例15胶囊胶囊处方银杏叶总内酯提取物0.3kg淀粉 0.45kg微晶纤维素0.025kg硬脂酸镁 0.004kg制法 将银杏叶总内酯提取物(过80目筛)，加淀粉(80℃烘)、微晶纤维素、硬脂酸镁，混匀，分装于10000粒胶囊中，即得。
实施例16滴丸滴丸处方银杏叶总内酯提取物 0.3kg聚乙二醇40001.0kg制法 聚乙二醇熔融后，加入银杏叶总内酯提取物细粉混合均匀，80±2℃以下保温，用内径为3.mm滴管，以60～70滴/分钟滴入甲基硅油中，收集滴丸，吸除冷却液，即得。
实施例17颗粒剂颗粒剂处方银杏叶总内酯提取物 0.3kg倍他环糊精 2.4kg糖粉 0.3kg糊精 0.1kg制法 取银杏叶总内酯提取物细粉加8倍量的倍他环糊精(广东省郁南县永光味精实业有限公司生产)包埋，加入适量糖粉与糊精，30％乙醇，制粒、干燥、整粒、包装即得。
实施例18注射液注射液处方银杏叶总内酯提取物5g丙二醇30ml注射用水加至1000ml制法 取银杏叶总内酯提取物超微粉碎，加丙二醇溶解，加适量注射用水，调pH至7.0，加活性炭0.2g，加热80℃保温，4号垂熔玻璃滤器预滤，加注射用水至1000ml，0.2μm微孔滤膜过滤，灌封，即得。
权利要求
1.一种银杏叶总内酯提取物，其特征在于其中银杏内酯J的重量含量是3％-15％，银杏内酯C的重量含量是8％-30％，白果内酯的重量含量是20％-65％，银杏内酯A的重量含量是15％-50％，银杏内酯B的重量含量是3％-40％。
2.根据权利要求1的银杏叶总内酯提取物，其中银杏内酯J的重量含量是3％-10％，银杏内酯C的重量含量是10％-20％，白果内酯的重量含量是38％-55％，银杏内酯A的重量含量是18％-30％，银杏内酯B的重量含量是4％-15％。
3.根据权利要求2的银杏叶总内酯提取物，其中银杏内酯J的重量含量是3％-5％，银杏内酯C的重量含量是12％-20％，白果内酯的重量含量是40％-52％，银杏内酯A的重量含量是20％-30％，银杏内酯B的重量含量是5％-15％。
4.根据权利要求1-3之一的银杏叶总内酯提取物的制备方法，该方法包括取银杏叶粗粉，用50％～80％(v/v)乙醇或丙酮提取，回收溶剂，上大孔吸附树脂柱，水洗去杂质，5％～20％(v/v)乙醇洗脱去杂质后，改用50％～80％(v/v)乙醇洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液，浓缩，醋酸乙酯提取，回收溶剂，真空干燥，得银杏叶总内酯提取物。
5.根据权利要求4的银杏叶总内酯提取物的制备方法，该方法包括取银杏叶粗粉，丙酮提取，回收溶剂，上大孔吸附树脂柱，水洗去杂质，5％～20％(v/v)乙醇洗脱去杂质后，改用60％～80％(v/v)乙醇洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液，浓缩，醋酸乙酯提取，回收溶剂，真空干燥，得银杏叶总内酯提取物。
6.根据权利要求4的银杏叶总内酯提取物的制备方法，该方法包括取银杏叶粗粉，70％～80％(v/v)乙醇提取，回收溶剂，上大孔吸附树脂柱，水洗去杂质，10％～15％(v/v)乙醇洗脱去杂质后，改用60％～70％(v/v)乙醇洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，上聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液，浓缩，醋酸乙酯提取，回收溶剂，或重结晶，真空干燥，得银杏叶总内酯提取物。
7.银杏叶或根据权利要求1-3之一的银杏叶总内酯提取物用于制备治疗抑郁症的药物的用途。
8.根据权利要求7的用途，其中银杏叶总内酯选自权利要求1-3之一的总内酯提取物。
9.一种治疗抑郁症的药物组合物，其含有根据权利要求1-3之一的银杏叶总内酯提取物和可药用辅料。
10.根据权利要求9的药物组合物，其是片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、注射剂、口腔速释制剂或缓控释制剂。
全文摘要
本发明一种新型高效、安全、无明显副作用的抗抑郁药物－银杏叶总内酯，系从银杏叶(Ginkgo biloba L.)或该植物其他部位如白果、根皮、茎枝等中提取的萜内酯，其中主要含5种萜内酯化合物，银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J及白果内酯，其中GJ占总内酯3％－15％，GC占总内酯8％－30％，BB占总内酯20％－65％，GA占总内酯15％－50％，GB占总内酯3％－40％，总内酯的含量≥50％，各内酯配比对抗抑郁作用有显著意义。银杏叶总内酯对多种抑郁症动物模型均十分有效，其优点是有效剂量低，安全性大，副作用小。本发明还涉及银杏叶总内酯的制备方法、用途和药物组合物。
文档编号A61P25/00GK1977868SQ200510125798
公开日2007年6月13日 申请日期2005年12月5日 优先权日2005年12月5日
发明者杨义芳 申请人:浙江海正药业股份有限公司, 上海医药工业研究院