用于治疗免疫性疾病的基于胶原的方法和制剂的制作方法

专利名称：：用于治疗免疫性疾病的基于胶原的方法和制剂的制作方法1.发明领域本发明属于用胶原和/或其衍生物治疗自身免疫疾病和其它免疫性疾病(immunesystem-mediateddisease)的领域。2.相关申请本申请是1995年1月10日提交的美国申请系列号08/370,388的部分继续。3.发明背景尽管免疫系统对于抗感染是必需的，但它对感染(外来抗原)和机体内产生的分子(自身抗原)的免疫应答可导致许多疾病，即免疫性疾病。免疫性疾病既可由B细胞介导(即抗体介导)，也可由T细胞介导。此外，免疫性疾病可由抗体和抗原(外来的或自身的)间形成的免疫复合物引起，许多免疫性疾病涉及到不需要的炎症应答，包括例如类风湿性关节炎、慢性肝炎、节段性回肠炎、银屑病、脉管炎等疾病。现有的治疗免疫性疾病，尤其是导致不需要的炎症应答的免疫性疾病(如类风湿性关节炎)的疗法还存在不足，大多数免疫性疾病是慢性病，需要长时间施用药物。因此，应用相对非毒性药物是重要的。但许多用于治疗自身免疫疾病的化合物，如甾类化合物和非甾类抗炎性化合物在长期应用后出现明显的毒副作用。另外，免疫抑制药物也已被用于治疗自身免疫应答，这些免疫抑制药物，如环孢菌素A和硫唑嘌呤是相对非特异性的，有弱化整个免疫系统的不良作用，因此使患者易患感染性疾病。摄入的化合物及结构上与摄入的化合物相关的化合物的口服施用可诱导免疫耐受。这表明通过口服诱导耐受的现象可适于作为治疗自身免疫疾病的方法。PCT出版物WO95/10301中描述了应用口服摄入的霍乱毒素连接物降低小鼠模型的迟发超敏反应并控制实验性自身免疫性脑炎。考虑到用于治疗慢性免疫性疾病的现有技术的缺点，为治疗免疫性疾病提供新方法和组合物是很有意义的。本文所描述的方法中应用一种或多种胶原和/或胶原衍生物以减弱或消除在某一免疫性疾病的发病机理中很重要的免疫应答。设计了一些方法和制剂以诱导针对与疾病过程有关的抗原的耐受。4.发明概述本发明为治疗包括类风湿性关节炎在内的免疫性疾病提供了新的方法和组合物。该组合物包括一种或多种不同类型的胶原或胶原衍生物。特异性的胶原和/或胶原衍生物的组合可用于治疗特异性的免疫性疾病。本组合物中所应用的胶原和/或胶原衍生物既可从天然来源中获得也可用重组基因工程技术制备。另一方面，本发明通过施用有效量的所述含胶原组合物，为治疗免疫性疾病提供了一种方法，本发明的方法包括肠内施用含胶原和/或胶原衍生物的组合物以诱导免疫耐受，即口服施用。另一方面，本发明提供施用给患者的含胶原和/或胶原衍生物的组合物。本发明的优选制剂被设计为在肠内释放胶原和/或胶原衍生物，从而与肠内淋巴样组织接触。在本发明的优选实施方案中，主题组合物为口服施用的制剂。另一方面，本发明提供这样一些胶原衍生物，它们包含至少一种耐受诱导表位，优选包含许多耐受诱导表位。这样的胶原衍生物可包含许多不同胶原衍生的耐受诱导表位，在本文中称作耐受性表位多肽。耐受性表位多肽也可包括非胶原蛋白衍生的氨基酸分解序列。另一方面，本发明为治疗免疫性疾病提供粘膜粘合胶原连接物(mucosabindingcollagenconjugate)。本发明的粘膜粘合胶原连接物包括一种或多种与粘合粘膜的分子相连的胶原分子。各种不同的胶原和/或胶原衍生物可用作本发明粘膜粘合胶原连接物中的胶原组分。各种粘膜粘合分子可用作本发明粘膜粘合胶原连接物中的粘膜粘合分子组分。合适的粘膜粘合组分包括从细菌毒素、细菌菌毛、病毒附着蛋白和植物外源凝集素衍生而来的粘膜粘合结构。特别优选的粘膜粘合组分是霍乱毒素的β亚基和大肠杆菌不耐热肠毒素的β亚基。另一方面，通过施用有效量的粘膜粘合胶原连接物，本发明提供了治疗免疫性疾病的方法。另外还有一方面，本发明提供用于治疗免疫性疾病的制剂，该制剂包含本发明的粘膜粘合胶原连接物。优选地，制剂适于口服施用。5.具体实施方案的说明本发明涉及一种或多种不同胶原和/或胶原衍生物的应用，以在特异性的免疫细胞群中诱导口服耐受，从而为治疗免疫性疾病提供一种方法，本文提供了用各种胶原和/或胶原衍生物治疗免疫性疾病的方法及在这些方法中应用的组合物。本发明的方法包含口服施用在特定组织中发现的一种(或多种)胶原，从而诱导对发现该胶原天然存在于这一种(或多种)组织的炎症抑制作用(免疫耐受)。具体的胶原类型和它的(例如组织型)间的对应关系可在不同的技术参考中找到，包括Fukai等，酶学方法2453-28(1994)。见提供了在这些方法中应用的含胶原(和胶原衍生物)的组合物。本发明还提供了许多不同类型的粘膜粘合胶原连接物及其在治疗免疫性疾病时的应用方法。本发明的一个方面是应用次要胶原，即与主要胶原天然相关的，较为稀少的胶原，以诱导免疫耐受，从而减低不需要的免疫应答的严重程度，由此提供了关节炎和相关免疫性疾病的治疗基础；然而，本发明还提供了主要胶原诱导免疫耐受的应用。软骨包含不同种类的胶原，它们为周围的组织提供了主要的细胞外支架。有关资料表明，II型胶原(一种主要胶原)具有抑制软骨内炎症的能力。本发明部分基于这样一种认识，即天然地与主要胶原一起存在的次要胶原在用于治疗免疫性疾病如类风湿性关节炎时，对于诱导免疫耐受很重要。因此，本发明的一个方面是单独或与主要胶原一起应用次要胶原以诱导免疫耐受，从而改善一些免疫性疾病的疾病过程。本发明提供了不同的含胶原和胶原衍生物的组合物。多种不同类型的胶原是本领域的普通技术人员所熟悉的。目前为止已发现了19种不同类型的胶原。在其它地方可找到关于这19种不同类型天然存在的胶原的结构和生物功能的详细论述。Ayad等，TheExtracellularMatrixFactsBook，学术出版社出版，SanDiego，CA；Burgeson，R.E.和Nimmi，“胶原类型分子结构和组织分布”，临床矫形外科学，282250-272(1992)；Kielty，C.M.等，“胶原家族在细胞外基质中的结构、装配和组织”，结缔组织和其遗传性疾病，分子遗传和医学方面，Royce，P.M.和SteinmannB.，Eds.，Wiley-Liss，NY，pp103-147(1993)。I型胶原是骨和皮肤的主要纤维胶原，I型胶原是包含2条α1(I)链和1条α2(I)链的异三聚体分子。除其他地方外，制备纯化的I型胶原的详述可见Miller.E.J.和Rhodes，R.K.，酶学方法8233-64(1982)，学术出版社。II型胶原是包含3条相同的α1(II)链的同三聚体。除其他地方外，制备纯化的II型胶原的方法可见Miller，E.J.和Rhodes，R.K.，酶学方法8233-64(1982)，学术出版社。III型胶原是在皮肤和血管组织中发现的主要纤维胶原。III型胶原是包含3条相同α1(III)链的同三聚体胶原。除其他地方外，制备III型胶原的方法可见Byers等，生化135243-5248(1974)和Miller，E.J.和Miller，R.K.，酶学方法8233-64(1982)，学术出版社。IV型胶原是在基底膜中发现的以片状而非纤维状形式存在的胶原。IV型胶原分子由来源于六个不同基因的3条不同的α链组成，即IV型胶原包括3个α1(IV)、α2(IV)、α3(IV)、α4(IV)、α5(IV)和α6(IV)链。该物质以组织特异的方式表达。除其他地方外，纯化IV型胶原的方法可见Furuto等，D.K.和Miller，E.J.，酶学方法14441-61(1987)，学术出版社。V型胶原是在骨骼、肌腱、角膜、皮肤和血管中发现的纤维胶原。V型胶原以同三聚体和异三聚体2种方式存在。一种V型胶原是两条α1(V)链和α2(V)的异三聚体，V型胶原的另一类型是α1(V)、α2(V)和α3(V)的异三聚体。还有一种V型胶原是α1(V)的同三聚体。除其他地方外，V型胶原的纯化方法可见Elstrow，S.F.和Weiss，J.B.，与胶原相关的研究，3181-193(1983)和Abedin等，Biosci.Rep.，2493-502(1982)。VI型胶原有一小的三股螺旋区域和一大的非胶原残余部分。在许多结缔组织中可找到VI型胶原，VI型胶原是包含α1(VI)、α2(VI)和α3(VI)链的异三聚体。除其他地方外，纯化VI型胶原的方法可见Wu等，生化杂志，248373-381(1987)和Kielty等，细胞科学杂志，99797-807。VII型胶原是在特殊的上皮组织中找到的纤维胶原。VII型胶原是3条α1(VII)链的同三聚体分子。除其他地方外，纯化VII型胶原的方法可见Lundstrom等，生化杂志，2619042-9048(1986)，和Bentz等，美国国家科学院院刊，803168-3172(1983)。VIII型胶原可在角膜后弹性膜中找到，它是包括2条α1(VIII)链和1条α2(VIII)链的异三聚体。除其他地方外，纯化VIII型胶原的方法可见Benya和Badilla，生化杂志，2614160-4169(1986)，Kapoor等，生化，253930-3937(1986)。IX型胶原是可在软骨及玻璃体中找到的纤维相关胶原。它是包括α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)链的异三聚体分子。除其他地方外，纯化IX型胶原的方法可见Duance等，生化杂志，221885-889(1984)，Ayad等，生化杂志，262753-761(1986)，Grant等，组织损伤的控制，Glauert，A.M.，Ed.，ElSevier，Amsterdam，pp.3-28(1988)。X型胶原是XI(x)链同三聚体的化合物。除其他组织外，它可以从生长平板的肥大软骨中分离而来的。XI型胶原可在与II型和IX型胶原相联系的软骨组织及身体的其它部位找到。它是包括α1(XI)、α2(XI)和α3(XI)链的异三聚体分子。除其他地方外，其纯化方法可见Grant等，组织损伤的控制，Glauert，A.M.，Ed.，ElSevier，Amsterdam，pp.3-28(1988)。XII型胶原是主要与I型胶原相联系的纤维相关胶原，它是包括三条α1(XII)链的同三聚体分子。除其他地方外，XII型胶原及其变异体的纯化方法可见Dublet等，生化杂志，26413150-13156(1989)，Lundstrum等，生化杂志，26720087-20092(1992)，Watt等，生化杂志，26720093-20099(1992)。XIII型胶原是在皮肤、肠、骨骼、软骨和横纹肌中发现的非纤维胶原。除其他地方外，其详细论述可见Juvonen等，生化杂志，26724700-24707(1992)。XIV型是纤维相关胶原。它是包含三条α1(XIV)链的同三聚体分子。除其他地方外，其分离方法可见Aubert-Foucher等，生化杂志，26619759-19764(1992)和Watt等，生化杂志，26720093-20099(1992)。XV型胶原与XVIII型胶原在结构上是同源的。除其他地方外，XV型胶原的结构及分离的有关资料可见Myers等，美国国家科学院院刊，8910144-10148(1992)，Huebner等，基因组，14220-224(1992)，Kivirikko等，生化杂志，2694773-4779(1994)，和Muragaki，生化杂志，2644042-4046(1994)。XVII型胶原是在皮肤、肺成纤维细胞、角化细胞和其它地方发现的纤维相关胶原。除其他地方外，关于XVI型胶原结构及其编码基因的资料可见Pan等，美国国家科学院院刊，19896565-6569(1992)，和Yamaguchi等，生化杂志，112856-863(1992)。XVIII型胶原与XV型胶原在结构上相类似，可从肝中分离到。除其他地方外，关于其结构和分离的说明可见Rehn等，美国国家科学院院刊，914234-4238(1994)，Oh等，美国国家科学院院刊，914229-4233(1994)，Rehn等，生化杂志，26913924-13935(1994)，和Oh等，基因组，19994-999(1994)。也可按美国专利5,405,752号，PCT公开专利申请WO93/07889和WO94/16570及相关的专利和申请中所一般性描述的方法，通过重组表达技术获得上面的胶原类型。本发明的另一方面是提供粘膜粘合胶原连接物。该粘膜粘合胶原连接物包括胶原组分和粘膜粘合组分。这两种组分可直接连接在一起或通过一种或多种中间连接分子而连接在一起。粘膜粘合胶原连接物可用于治疗各种免疫性疾病。治疗是通过对粘膜粘合胶原连接物的胶原组分上的一种或多种表位诱导免疫耐受而起效的。该粘膜粘合胶原连接物的胶原组分可包括一种或多种胶原或胶原衍生物分子。粘膜粘合胶原连接物的胶原组分中的胶原分子可彼此相同或不同。胶原组分中的胶原/胶原衍生物分子可直接也可通过中间连接物而连接在一起，另外，胶原组分中的胶原/胶原衍生物没必要彼此相联，它们可直接与粘膜粘合胶原连接物中的粘膜粘合组分相连。粘膜粘合组分包括一种或多种能与所治疗患者的粘膜细胞特异结合的分子。各种不同的分子可充当粘膜粘合组分粘膜结合分子可从细菌毒素、细菌菌毛、病毒附着蛋白和植物血凝素的粘膜粘合结构衍生而来。优选应用从细菌毒素而来的粘膜粘合结构，尤其优选的是霍乱毒素的β亚基和大肠杆菌不耐热肠毒素的β亚基。霍乱毒素的β亚基和大肠杆菌不耐热肠毒素的β亚基具有与粘膜细胞中的神经节苷脂GM特异性结合的特性。当毒素用作粘膜粘合结构时，优选修饰毒素以明显地去除破坏毒素的细胞毒特性，细胞毒特性的失活可用本领域普通技术人员所熟知的一些方法进行，这些方法包括例如变性、突变等等。其它与神经节苷脂特异性结合的分子也可用作本发明中粘膜粘合胶原连接物的粘膜粘合组分。粘膜粘合分子既可以直接又可以以中间连接分子的方式间接地共价结合在一起，另外，构成粘膜粘合组分的粘膜粘合分子也以分子间吸引力的方式彼此联系。例如，霍乱毒素的β亚基形成5分子可联合的“环”结构。合适的毒素分子的实例包括百日咳杆菌毒素的S2、S3、S4和/或S5亚基、白喉毒素、白喉毒素的β片段、志贺毒素、类志贺毒素、志贺毒素的β亚基、类志贺毒素β亚基、霍乱毒素、大肠杆菌的不耐热毒素。合适的细菌菌毛的实例包括大肠杆菌K88、K99、987P、F41、CFA/I、CFA/II、(CS1、CS2和/或CS3)、CFA/IV(CS4、CS5和/或CS6)、P菌毛、霍乱弧菌共调节毛(TCP)、粘液敏感血凝素(MSHA)、岩藻糖敏感血凝素(FSITH)、百日咳杆菌丝状血凝素等等。适宜的病毒附着蛋白的实例包括流感血凝素、仙台病毒血凝素。适宜的外源凝集素实例包括植物的和动物的外源凝集素，可溶性结合乳糖的植物外源凝集素、选择素、收集素、螺旋pomatin血凝素、伴刀豆蛋白A、小麦胚凝集素、植物血凝素、金精蓖麻子蛋白。对粘膜细胞抗原特异的免疫球蛋白也可用作粘膜粘合组分。分离的胶原组分和粘膜粘合组分可通过不同方式连接在一起。这两种组分可用化学交联剂连接在一起，所述化学交联剂如N-琥珀酰亚氨基(3-(2-吡啶基-二硫代)丙酸酯、3，3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯、2-亚氨基硫杂戊环、N-琥珀酰亚氨基-(4-叠氮苯基)-1，3-二硫代丙酸酯、4-叠氮苯基-1，4-二硫代丁亚氨酸酯、丙二亚氨酸二乙酯、2-亚氨基硫杂戊环、N，N’-对-苯二马来亚氨酸酯等等。另外，本发明的粘膜粘合胶原连接物可以是单体多肽，这种多肽是胶原组分和粘膜粘合分子组分间形成的融合蛋白。这些融合蛋白可用传统的体外基因工程技术制备。本发明的另一方面是提供编码粘膜粘合胶原连接物融合蛋白的多核苷酸序列。本发明另一方面还提供用重组技术制备粘膜粘合胶原连接物融合蛋白时的宿主细胞。粘膜粘合分子组分可通过从它们天然存在的源有机体纯化而获得。另外，粘膜粘合分子组分也可用重组DNA技术制备。本领域的技术人员熟知纯化粘膜粘合分子或可任选地，用重组技术制备适于本发明应用的这些分子的方法。例如，Sanchez和Holmgren，在美国国家科学院院刊，86481-485(1989)中已描述了霍乱毒素β亚基的重组制备，Hirst等在美国国家科学院院刊，817752-7756(1984)中已描述了大肠杆菌不耐热肠毒素β亚基的制备。本发明的组合物包含一种或多种纯化的胶原和/或胶原衍生物。也提供了包括胶原和/或胶原衍生物特异组合的组合物，表1给出了可用于治疗特殊疾病的胶原类型(以阿拉伯数字表示而非罗马数字)。列出的每一胶原类型用于治疗特异的疾病，既可单独应用又可与一种或多种适于治疗所关心疾病的胶原分子联合应用，例如，参照表1可以看到，可用包括I型、II型、III型、V型、VI型、IX型、X型、XI型、XII型和XIV型胶原的组合物，或其任何一种包括有2种或多种适于治疗特殊病症的胶原的组合来治疗类风湿性关节炎。因此参照表1可看出本发明为治疗类风湿性关节炎提供了组合物，该组合物至少包含一种选自I型、II型、III型、V型、VI型、IX型、X型、XI型、XII型和IV型胶原的化合物。与一定的胶原类型相对应的胶原衍生物可用于补充或替代表1组合物中所显示的特殊胶原类型，例如，如表1所示用于治疗类风湿性关节炎的组合物可包括II型胶原、II型胶原衍生物、多种不同的II型胶原衍生物或II型胶原和II型胶原衍生物的混合物。在本发明治疗类风湿性关节炎的优选实施方案中，组合物包含IX型胶原和/或IX型胶原衍生物，有或没有II型胶原和/或其衍生物。在另一实施方案中，本发明提供的组合物包含XI型胶原和/或其衍生物，有或没有II型胶原和/或其衍生物。在本发明治疗类风湿性关节炎的另一优选实施方案中，本发明由包括IX型和/或其衍生物和XI型胶原，有或没有II型胶原和/或其衍生物的组合物组成。在本发明治疗类风湿性关节炎的另一优选实施方案中，组合物包含II型胶原衍生物。表1胶原类型和应用指征表<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="1100">指征胶原类型01020304050607080910111213141516171819关节强硬性脊椎炎和其他脊椎关节病XXXXXXX自身免疫性听力病XXXX自身免疫性肝病XXX皮肤的水疱性疾病XX大疱型类天疱疮X皮肤的大疱性疾病(如天疱疮)XX粘液囊炎XXXXXXX由细菌或病毒疾病引起的软骨炎(如Lyme病)XXX局限性硬化XXXXXXX</table></tables><tablesid="table3"num="003"><tablewidth="1100">指征胶原类型01020304050607080910111213141516171819全身性纤维化疾病(例硬皮病)XXXXXXX子宫疾病(例纤维瘤)XXXXXX脉管炎XX</table></tables>与本发明的含胶原和胶原衍生物的组合物相似，本发明的粘膜粘合胶原连接物可适于治疗特殊的免疫性疾病。可遵从表1的资料通过选择粘膜粘合胶原连接物的胶原组分而使粘膜粘合胶原连接物适于应用。本发明的方法和组合物中所应用的纯化胶原可从动物或人的组织中分离得到；可是当治疗的对象是人时，组合物和方法中优选应用人的胶原。本方法和组合物中所应用的胶原除可从天然来源获得外，也可用重组DNA技术制备。如何用重组DNA技术制备II型胶原的描述可在其它的地方找到，PCT公开的专利申请WO93/07889和WO94/16570在此引入作为参考。PCT申请中描述的重组制备技术可容易地适于用重组DNA技术制备人或其它动物的许多不同类型的胶原。本发明的组合物中优选应用重组DNA技术制备的人类胶原。重组DNA技术避免了与获得足量人类组织对相关的伦理道德和经济问题。除应用直接从天然来源获得的胶原外，本发明的方法和组合物可包括许多不同类型的胶原衍生物。在几个方面，胶原衍生物不同于自然产生的胶原。与自然产生的胶原不同，胶原衍生物可以是非糖基化的或是糖基化的。所需的糖基化模式可由不同的方法制备。这些方法包括直接化学修饰和酶催化的糖基化和糖基化反应，所需的糖基化模式可通过抑制或去除酶制备，而这种酶对制备胶原的自然产生糖基化模式是必需的。胶原衍生物所具有的糖基化模式不同于相应的自然产生的胶原，但在结构上基本相同(除羟化的脯氨酸和/或赖氨酸数量外)，在这里称作“变异地糖基化胶原”。胶原衍生物也包括自然产生胶原的不同片段。这些胶原片段可通过化学或酶分裂一或多个肽键而制备的。胶原衍生物也包含有一或多种氨基酸残基，它不同于自然产生胶原中相应位置的氨基酸残基。含有这种氨基酸残基替代物的胶原衍生物可由包括基因工程技术和体外肽合成在内的各种方法制备。其它的胶原衍生物可这样制备，改变一定分子中羟化赖氨酸和/或羟化脯氨酸的量，改变赖氨酸羟化酶和/或脯氨酸羟化酶的表达，其中羟化酶基因(重组或其它的)在表达重组胶原或其衍生物的宿主细胞中也表达，当本发明的组合物和方法中应用的胶原衍生物单独或作为本发明中包括许多胶原和/或胶原衍生物的组合物的一部分施用给病人的时候，它有降低所关心免疫性疾病中不需要的免疫反应的能力。本发明用于治疗类风湿性关节炎的方法和组合物中适合应用的胶原衍生物也通过应用从类风湿性关节炎患者而来的T细胞进行体外实验而确定，其中如果给定的胶原衍生物可刺激抑制性T细胞诱导克隆无反应性或诱导其它的免疫耐受，该实验即可确定。本领域的普通技术人员熟知测定诱导抗原耐受的方法，例如，在Paul，W.E.，编辑的基础免疫学第2版，Raven出版纽约，(1994)中可找到这种方法。同样，通过应用从相关疾病患者分离别的免疫细胞进行体外实验，可确定适于治疗给定免疫性疾病的用于治疗其它免疫性疾病的胶原衍生物。适合本发明的方法中应用的胶原分子，胶原衍生物或粘膜粘合胶原连接物至少包括一种耐受诱导表位，这里应用的“耐受诱导表位”一词指具有这样特征的胶原上的表位，它能对免疫性疾病中的致病性免疫应答诱导耐受，且不依赖于分离出这一“耐受诱导表位”的胶原分子的其它部位。各自的胶原分子可包括一或多种耐受诱导表位。此外，耐受诱导表位或一定胶原分子上的表位可依胶原治疗的特异性免疫性疾病的不同而改变。本发明还提供胶原衍生物，它由包括一或多种胶原耐受诱导表位的氨基酸残基序列；这里所指的新型多肽称为“耐受表位多肽”耐受表位多肽可包括许多一致的耐受诱导表位。本发明的耐受表位多肽也可包括一或多种从相同或不同胶原分子衍生来的非一致性耐受诱导多肽。该耐受诱导表位的实施方案包括不同表位以有规律重复方式排列的多肽和不同耐受诱导表位自由排列的多肽。耐受表位多肽包括许多耐受诱导表位；然而耐受表位多肽是实质性的且有大小，所以本领域的普通技术人员会认识到在合成和应用很大多肽时出现的某些技术问题，如溶解度、稳定性等。因此，本发明的耐受表位多肽优选包括500耐受诱导表位，更优选的范围为250耐受诱导表位，还更优选的范围是50-100耐受诱导表位。耐受诱导表位可以糖基化或非糖基化，取决于碳水化合物基质是否作为耐受诱导表位的一部分。可用传统的基因工程技术制备耐受表位多肽。如Goeddel基因表达技术，酶学方法185卷，学术出版社(1991)中所描述的。此外，耐受表位多肽可包括一或多种非胶原来源的氨基酸残基序列，由耐受表位多肽中的胶原来源的耐受诱导表位区可作为非胶原来源的氨基酸序列的载体，于是也可对非胶原来源的氨基酸残基序列诱导免疫耐受。换言之，耐受表位多肽的一些实施方案中，多肽为诱导对非胶原蛋白产生免疫耐受而充当“载体”，而这种非胶原蛋白参予免疫性疾病的发病机理。例如，本发明提供包括髓鞘碱性蛋白的耐受表位多肽在多发性硬化病理性免疫应答的发展过程中和多种耐受诱导表位中显示出重要作用。编码耐受表位多肽的多核苷酸序列可通过体外合成多核苷酸和控制前分离的编码胶原的多核苷酸而进行制备。遵照表1提供的资料可为治疗特异的免疫性疾病设计耐受表位多肽。耐受表位多肽可包括从胶原或在特殊的组织中发现的胶原而来的耐受诱导表位，从而能对发现自然产生该胶原的组织诱导炎症抑制(免疫耐受)。因此，包括II型、IX型、XI型胶原的耐受诱导表位的耐受表位多肽可代替(或补充)II型、IX型和XI型胶原的混合物。免疫学领域的普通技术人员可容易地确定特定胶原和特定免疫性疾病的耐受诱导表位。例如，患有(或好象要产生)特异的免疫性疾病的人的某种淋巴细胞亚群中有可与耐受诱导选择区结合的受体。其中可在有关的胶原分子中制造系统性缺失而推断耐受诱导表位。本发明的另一个方面是为治疗免疫性疾病提供方法。这里所应用的“治疗”一词指对疾病的预防和去除已在个体中存在的症状。本领域的普通技术人员会认识到，对于阻止疾病的发生或减轻与疾病相关的症状治疗不必完全有效。任何症状程度的减弱，症状发生的延迟，或延缓症状严重度的进展，对病人来讲都是很希望的。基于任何一种暗示可能发生免疫性疾病的变化因素如，家族史、遗传标记、早期症状等，对有患特定免疫性疾病的人可进行预防性治疗。能被本发明的方法治疗的免疫性疾病包括表1中所列出的疾病，但不仅限于此。本发明的方法包括施用有效量的本发明的组合物这一步，如应用胶原，胶原衍生物，或粘膜粘合胶原连接物，如前部分所述，治疗特异的免疫性疾病所优选应用的组合物列在表1中。本发明方法的优选实施方案中，给受试对象施用的组合物包括可变地糖基化胶原或粘膜粘合胶原连接物，其中胶原组分包括可变地糖基化的胶原分子。施用本发明方法中施用的组合物使活性组分，即胶原和/或胶原衍生物与肠的淋巴样组织，如集合淋巴结或其它类似部分相接触。从而诱导免疫耐受。在许多可能的方法中，这种施用可通过应用包括为口服施用设计的组合物的制剂而起效，即活性组分在与合适的肠道淋巴组织接触之前在口腔，胃或消化系统的其它部位不被破坏或灭活。本发明的治疗方法还包括施用其它的治疗免疫性疾病的药性化合物，如用抗炎药物等等。所施用组合物的剂量可在较大范围内变动，这依赖于各种因素，如炎症的严重度，患者的年龄等，并且必须做个体调整。每天可施用的胶原和/或胶原衍生物量的可能范围是0.001mg-200mg左右。优选低量施用胶原和/或胶原衍生物，这样可以抑制而非克隆无反应性的方式促进诱导免疫耐受。可把含胶原和/或胶原衍生物的药性组合物制成合适的制剂，使它所含剂量无论作为单一剂量单位或多元剂量单位均在这些剂量范围内。本发明的方法中应用的耐受诱导组合物的合适剂量将遵照一些因素而有所变化。这里所应用的“剂量”和“量”除其它说明外，不仅可指一次施用组合物，也可用于指选择的一段时间内施用的多个个体施用特定药性组合物时的总量。影响最佳剂量的因素包括施用给患者的胶原分子或分子(和/或胶原衍生物)的选择，所选择的特殊的粘膜粘合分子，患者的年龄、疾病的严重程度、患者患的其它疾病、制剂中的惰性成分、佐剂等等。对治疗特定免疫疾病有效的剂量范围可有相当大的变化。相同药性组合物的不同剂量可通过不同的机制诱导所希望的耐受。尽管本发明的作用不依赖特殊的作用机制，本领域的普通技术人员知道由口服耐受的介导有2个主要机制，所以它们会较好地理解本发明并提供其它的实施方案。口服耐受可由活性细胞抑制所介导。其调节性T细胞抑制对耐受性抗原特异的淋巴细胞的活性和增殖，诱导口服耐受的另一个机制是克隆无反应性，其中有适当受体的T淋巴细胞变得无反应性，通常活性抑制耐受由“低”剂量的耐受性抗原支持，克隆无反应性由相对“高”剂量的相同耐受性抗原诱导。口服耐受诱导原理及技术的综述可于Weiner等，免疫学综述年刊1994，809-835，年刊综述，中找到。本组合物可以药性组合物的形式制剂，以适于粘膜表面施用时的某些类型，如口服，局部用和吸入。口服施用的优选制剂是以组合物中的胶原和/或胶原衍生物与肠内的淋巴组织如集合淋巴结相接触的形式。本发明的组合物可以药物组合物的形式以局部用、口服、鼻内、注射或吸入的方式施用，该药物组合物包括胶原和/或胶原衍生物，它们以原化合物的形式或其药学上的与固体、半固体或液体稀释剂或可摄入胶囊这样药学上的载体相联系的盐形式存在，这些制剂包括了本发明的另一个方面。胶原和/或胶原衍生物和粘膜粘合胶原连接物也可与载体物一起应用。药性制剂的实例可是片剂，如滴鼻用的滴剂，表面应用的制剂如软膏、凝胶剂、乳油和悬液、吸入的气雾剂、鼻喷剂、脂质体等。通常胶原和/或胶原衍生物包含制剂重量的0.05-99％，或0.1-99％，例如用于注射时占制剂的0.5-20％，用于口服时为制剂的0.1-50％。为了以这种剂量单元的形式制备含本发明化合物，口服应用的药物制品，活性成分可与固体、粉状载体混合，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉如土豆淀粉、玉蜀黍淀粉、支链淀粉、昆虫多糖粉或柑桔果肉粉、纤维素的衍生物或明胶，也可包括润滑剂如镁或钙的硬脂酸盐或碳蜡或其它的聚乙二醇蜡，经压可形成片剂或作为糖衣丸的核心。如果需要糖衣丸，可给核心包衣，例如用浓缩的糖浓液，其中可包含阿拉伯胶，滑石粉和/或二氧化钛，或用溶于易挥发有机溶剂或有机溶剂混合物中的薄膜形成试剂。这些包衣中可加入着色剂，例如用于区分活性物质的不同含量。制备由明胶和比如甘油做为增塑剂所组成的软明胶胶囊或相似的密封胶囊时，活性物质可与碳蜡混合或与适当的油如芝麻油、橄榄油或花生油混合。硬明胶胶囊可含有活性物质与固体，粉状载体形成的颗粒，载体有，如乳糖、蔗糖、甘梨醇、甘露醇、淀粉(例如)土豆淀粉，玉蜀黍淀粉或支链淀粉，纤维素衍生物或明胶，也可包括硬脂酸镁或硬脂酸作润滑剂。可对本发明的组合物进行配制以提供持久的释放。用缓慢溶解的包衣把活性药物分成几层，由此可得到持久释放的片剂。另一制备持久释放片剂的方法是用不同厚度的包衣把活性药物的剂量分成颗粒，然后把颗粒和载体物质一起压成片剂。胶原和/或胶原衍生物和粘膜粘合胶原连接物可合并在缓溶片剂中，片剂可由例如脂肪和蜡形成，或平均分布在不溶物如无生理活性的成形物的片剂中。为了得到口服制剂(片剂、胶囊等)的剂量单位，设计这些制剂以阻止活性物质在胃液中释放和分解的可能，片剂、糖衣丸等可制成肠溶衣的，这样就提供了一层胃液抵抗性肠或具有这种特性的包衣，在胃液酸性pH的情况下不溶解。因此，活性物质在制剂到达肠道之前不被释放，这种已知肠溶衣的实例有醋酸纤维素邻苯二甲酸酯，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，如市售商标名为HP55，HP50，EdragitL和EudragitS的。可把口服应用的液体制剂制成酏剂，糖浆或悬液的形式，例如含活性物质的重量为0.1-20％糖和混合物或乙醇，水甘油，丙二醇和选择香味；甜味和/或羧甲基纤维素作分散剂的溶液。提到胶原时应用的“纯化”一词表示所指出的分子在其它的生物大分子如多核苷酸，蛋白质等，基本上不存在的情况下存在。这里所应用的“纯化”一词优指至少存在所指生物大分子重量的95％，更优选的是至少存在99.8％(但水，缓冲液或其它小分子，尤其是分子量小于100道尔顿的分子可存在)。这里所应用的“分离的”一词指蛋白质分子不仅从以天然来源的蛋白质存在的其它蛋白质中分离，而且从其它的蛋白质分离，优指仅在溶剂、缓冲液、离子或其它存在于相同溶液的组分中找到的蛋白质。术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于天然来源的蛋白质。6.实施例下列实施例的目的是为了说明本发明，而不应认为是对本发明范围的限制。6.1用胶原免疫后针对抗胶原抗体发生的动物体内研究用人类II型胶原(CII)，哺乳类细胞来源的重组II型胶原(rCII+)或源于昆虫细胞的重组II型胶原(rCII-)免疫每组10只的DBA/l小鼠，每一次免疫之前，胶原溶于0.01M的醋酸，然后以1∶1的比例与完全福氏佐剂进行乳化。给每只小鼠尾部皮下注射100μg的蛋白质。2组接受2剂100μg的rCII-或rCII-，因此总共接受200μg的rCII+或rCII-。在施用总共剂量为200μg的情况时，按上述方法施用第1剂100μg的蛋白质，在施用第1剂3周后，第2剂100μg的蛋白质与不完全福氏佐剂进行乳化后施用。六周时(免疫后)计算了关节炎的发病率，表2阐明了其结果。表2如表2列出的数据所显示的，抗体代表免疫后四周收集的每组血清中对天然人类II型胶原产生的抗体的均值(以单位表示)。6.2静脉内施用胶原之后针对抗胶原抗体发生的动物体内研究把卵白蛋白，人类II型胶原(CII)，源于哺乳类细胞的重组II型胶原(rCII+)或源于昆虫细胞的重组II型胶原(rCII-)静脉内施用给每组10只的DBA/1小鼠。施用前，把胶原(CII，rCII+，rCII-)溶于0.01M的醋酸，用PBS进行透析。每天施用33μg或33μg的蛋白质，应用3天，于是给每只试验小鼠施用的总量为100μg或1000μg蛋白质。施用最后一剂4天后，用CII给小鼠进行免疫。免疫后6周时关节炎的发病率在表3中显示。表3应用免疫后4周收集的血清，抗体代表了每组中针对天然人类II型胶原所产生抗体的均值(以单位表示)。统计学用Student’sT检验。6.3口服施用胶原后针对抗胶原抗体发生的动物体内研究给每组10-12只的DBA/1小鼠口服施用卵白蛋白，人类II型胶原(CII)，源于哺乳类细胞的重组II型胶原(rCII+)或源于昆虫细胞的重组II型胶原(rCII-)。胶原溶于0.01M的醋酸中，每周施用4次，施用2周共8剂。每天施用10μg或100μg以使小鼠接受的总量为80μg或800μg蛋白质。接受最后一剂后3天，用CII给免疫小鼠。表4给出了免疫后5周时的关节炎发病率。表4</tables>统计学差异用Fisher’sExact检验计算，抗体代表免疫后4周收集的每组血清中针对天然人类II型胶原所产生抗体的均值(以单位表位)，统计学用Student’sT检验。6.4人类血小板凝集试验在四个供者提供的血液样品中对III型重组胶原和人类的I型、III型胶原进行了测验，测验应用了常规的血小板凝集试验。所有的胶原显示了血小板凝集活性。更具体而言，10μg重组III型胶原的凝集率与0.3μgIII型胶原或0.6μgI型胶原的凝集素相等同。引入参考所有的专利，专利申请，和公开引证在此引入作为参考。等同认为前面写的说明足以使本领域的技术人员执行本发明。事实上，上面描述的，为执行本发明所设计的各种实施方案，对免疫学，生化领域的技术人员是显而易见的，或相关的领域在下面的权利要求范围之内。19条修改的声明申请人修改了权利要求1，由此实质上也修改了从属权利要求2-14，从而将未决权利要求的范围限定为重组技术来源的化合物和应用这些化合物的方法。本发明的重组分子在形式和活性上不同于国际检索报告中引用的现有技术文献中描述的蛋白质，因此所引用的文献不能表明本要求保护的发明因缺少创造性而为不可专利的。首先，与所引用的现有技术文献不同，本权利要求限于包含与粘膜结合分子相连的重组胶原分子。在所引用的文献的任何地方都没有描述这两种组分的连接。其次，本要求保护的发明中的胶原组分不同于所引用的现有技术文献中描述的胶原化合物。例如，本申请的胶原组分指部分糖基化的人类胶原分子及其应用，而非指“整个”鸡蛋白质。因此，要求保护的化合物在结构上不同于现有技术公开的完全糖基化的蛋白质。第三，与现有技术不一致的是，要求保护的化合物比现有技术中描述的蛋白质诱发较少的抗原性应答，因此具有与那些蛋白质不同的活性分布。最后，与所引用的文献不同，本申请利用来源于重组技术的包含人类胶原蛋白及其片段的化合物治疗广泛的自身免疫疾病，而现有文献在其公开内容中为单一的疾病，即类风湿性关节炎。因此，国际检索报告中引用的现有技术文献不能告知本申请的权利要求的这些限定。权利要求书1.一种治疗自身免疫疾病的化合物，该化合物包含与粘膜粘合分子组分相连接的重组的人类胶原分子组分。2.权利要求1的化合物，其中胶原分子选自II型胶原、IX型胶原和XI型胶原。3.权利要求2的化合物，其中胶原分子是II型胶原的衍生物。4.权利要求3的化合物，其中胶原衍生物是可变地糖基化的。5.权利要求1的化合物，其中粘膜粘合分子选自来源于细菌毒素、细菌菌毛、病毒附着蛋白和植物外源凝集素的粘膜粘合结构的粘膜粘合分子。6.权利要求5的化合物，其中粘膜粘合蛋白可与神经节苷脂GM1结合。7.权利要求5的化合物，其中结合片段是霍乱毒素或大肠杆菌不耐热肠毒素的β亚基。8.一种治疗免疫性疾病的方法，该方法包括施用有效量的权利要求1的化合物。9.权利要求8的方法，其中胶原分子选自II型胶原、IX型胶原和XI型胶原。10.权利要求9的方法，其中的胶原分子是II型胶原的衍生物。11.权利要求11的方法，其中胶原衍生物是可变地糖基化的。12.权利要求8的方法，其中粘膜粘合分子选自来源于细菌毒素、细菌菌毛、病毒附着蛋白和植物外源凝集素的粘膜粘合结构的粘膜粘合分子。13.权利要求12的方法，其中粘膜粘合蛋白可与神经节苷脂GM1结合。14.权利要求12的方法，其中的结合片段是霍乱毒素或大肠杆菌不耐热肠毒素的β亚基。权利要求1.一种治疗自身免疫疾病的化合物，该化合物包含与粘膜粘合分子组分相连接的胶原分子组分。2.权利要求1的化合物，其中胶原分子选自II型胶原、IX型胶原和XI型胶原。3.权利要求2的化合物，其中胶原分子是II型胶原的衍生物。4.权利要求3的化合物，其中胶原衍生物是可变地糖基化的。5.权利要求1的化合物，其中粘膜粘合分子选自来源于细菌毒素、细菌菌毛、病毒附着蛋白和植物外源凝集素的粘膜粘合结构的粘膜粘合分子。6.权利要求5的化合物，其中粘膜粘合蛋白可与神经节苷脂GM1结合。7.权利要求5的化合物，其中结合片段是霍乱毒素或大肠杆菌不耐热肠毒素的β亚基。8.一种治疗免疫性疾病的方法，该方法包括施用有效量的权利要求1的化合物。9.权利要求8的方法，其中胶原分子选自II型胶原、IX型胶原和XI型胶原。10.权利要求9的方法，其中的胶原分子是II型胶原的衍生物。11.权利要求11的方法，其中胶原衍生物是可变地糖基化的。12.权利要求8的方法，其中粘膜粘合分子选自来源于细菌毒素、细菌菌毛、病毒附着蛋白和植物外源凝集素的粘膜粘合结构的粘膜粘合分子。13.权利要求12的方法，其中粘膜粘合蛋白可与神经节苷脂GM1结合。14.权利要求12的方法，其中的结合片段是霍乱毒素或大肠杆菌不耐热肠毒素的β亚基。全文摘要本发明为治疗包括类风湿性关节炎在内的免疫性疾病提供了新的方法和组合物。该组合物包含一种或多种不同类型的胶原或胶原衍生物和一种粘膜粘合结构。胶原和/或胶原衍生物的特异组合可用于治疗特异的免疫性疾病,本组合物中应用的胶原和/或胶原衍生物可从天然来源获得,或用重组基因工程技术和/或化学修饰方法制备。本发明的另一方面是通过施用有效量的含胶原的组合物而为治疗免疫性疾病提供方法。本发明的方法包含口服施用在特异组织中找到的胶原,以诱导对天然存在该胶原的组织产生炎症抑制(免疫耐受),本发明的方法包括把含胶原和/或胶原衍生物的组合物施用到肠内,例如口服施用,从而诱导免疫耐受。文档编号A61K38/17GK1178470SQ96192487公开日1998年4月8日申请日期1996年1月11日优先权日1996年1月11日发明者T·B·内夫,G·R·马尔丁,K·A·皮茨,T·A·皮拉雅尼米,K·I·基维里科申请人:菲布洛根有限公司,芬兰研究院