专利名称：抑制人体肿瘤细胞生长的反义寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制人体肿瘤细胞生长的寡核苷酸，具体地讲涉及抑制人体肿瘤细胞生长的反义寡聚脱氧核苷酸及含有所述寡核苷酸的组合物，以及将所述寡核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。
raf基因编码对丝氨酸、苏氨酸特异的蛋白激酶，这种蛋白激酶在有丝分裂信号途径中起者重要作用。raf一旦被激活就可以直接激活有丝分裂原激活蛋白激酶的激酶(MEK)。raf基因不可控的高表达会引起细胞的无限增殖，导致肿瘤的发生。
资料表明，c-raf激酶对人体许多种肿瘤的发生和发展起关键作用，(Johnson,B.E.et.al.(1993).Chest.103(1suppl):15-25；Vainio,H.(1995),J.of Occupational &Environmental Medicine,37(1):69-76)。c-raf基因最初是在鼠类肉瘤病毒引发的肿瘤中发现的(Rapp,U.R.et,aL.PNAS,80:4218-4222)。随后在人体中也发现了c-raf激酶(Bonner,T.I.et,al.Nucleic Acids Res.14(2):1009-1015)，随后，人们搞清了c-raf基因的序列及主要功能，根据功能分类，c-raf基因属于原癌基因类，其主要功能是与ras基因编码的蛋白相结合，把信号通过细胞表面受体传递到细胞核中，引起细胞增殖，它是ras下游信号通道的一个中央调控子。在人体多种肿瘤组织中，发现有ras基因突变存在的大约占50％以上，因此阻断c-raf基因mRNA的转译，使ras激酶不能与raf激酶相结合，从而使ras激酶失去致癌功能，这会对由ras突变所引发的肿瘤具有相当有效的治疗效果。
反义核酸是在原核细胞及真核细胞内天然存在的一种基因表达的抑制物(Mizuno,T.Chou,M-Y.and Inouye,M.(1984).PNAS81(1966-1970)Heywood,S.M.Nucleic Acids Res,14,6771-6772(1986))，这些核酸片断的功能是结合到互补的mRNA序列上，阻断mRNA翻译蛋白质分子的过程(Paterson,B.M.,Roberts,B.E.,and Kuff,E.L.,(1977).PNAS,74,4370-4374)。反义寡聚脱氧核苷是一小段人工合成的脱氧核苷，它的碱基顺序与人们选择作为阻断目标的基因的某一段互补，依照碱基配对法则可以与存在于细胞质中的特定基因的mRNA结合，阻断其翻译蛋白质分子。
在细胞内部，一个拷贝的基因会产生200-300条mRNA，翻译出10万个有生物学功能的蛋白质分子。传统药物一般是作用于具有生物学功能的蛋白质分子。所以与传统药物相比，反义核酸药物具有高选择性，高效性及低副作用等优点，特别是在抑制肿瘤生长及抗病毒繁殖方面，已有许多反义核酸药物在完成临床前期的研究和开发后进入临床Ⅰ、Ⅱ期试验(Stein,C.A.,et,al.(1994).Curr.Opin.Onco.6:587-594),(Crook,S.T.(1995).HematologicPathology,9(2):59-72))。
本发明目的之一是提供一种反义寡聚脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)序列，其特征在于可特异性结合c-raf基因mRNA的不同区域。
本发明的另一目的是提供含有本发明寡核苷酸的药物组合物。
本发明的另一目的是提供了本发明寡核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。
本发明以c-raf基因的5′端，3′端非转译区攻击位点，设计了一系列反义核酸。采用亚磷酰胺固相合成法合成了相应的核酸分子，还合成了阳性对照Pac10及阴性对照Pac23各一个，其长度均为20个核苷酸残基。采用人体肺癌细胞株A549作为靶受体，对合成的反义核酸进行初步筛选。筛选结果表明，其中六个寡聚反义核苷酸均具有不同程度的抑制人体肿瘤细胞生长的特性，将它们分别定名为Pac14,Pac16,Pac17,Pac18,Pac19,Pac21，其中Pac14具有最高的抑制人体肿瘤细胞生长的活性。
具有抑制人体肿瘤细胞生长活性的Pac系列寡聚反义核苷酸碱基组成及顺序如下所示Pac14:5′-GAG GGA GCC AGG CCG CCC CA--3′20merPac16:5′-AAT CCC ATG TGT CTC CAC CT-3′20merPac17:5′-ACA TGC ATT CCT CCA GAA CC-3′20merPac18:5′-TGA AGA AAG TCC CGC CTG TG-3′20merPac19:5′-TGT GCA AAA TGT CTG GCG CT-3′20merPac21:5′-GGC CAG AGT CTC GGC AGT CC---3′20mer阳性对照Pac10序列如下Pac10:5′-TCC CGC CTG TGA CAT GCA TT---3′ 20mer阴性对照Pac23序列如下Pac23:5′-CAC GGT GCG TCG ACG CAC TA-3′20merPac系列反义寡聚核苷酸均是长为20个核苷酸残基并经过硫代修饰的寡聚核苷酸，攻击目标位于c-raf基因的5′端及3′端非转译区，它们可在细胞质中与c-raf基因的信使核糖核酸特异性结合，阻止raf蛋白的产生，从而抑制了ras的功能，最终抑制了肿瘤细胞的生长，其对肿瘤细胞的抑制活性随着浓度的增加而增强，其中Pac14抑制raf激酶的活性高达90％。反义寡核苷酸是通过与目标基因的信使核糖核酸(mRNA)特异性杂交来发挥其生物学功能的，从核酸杂交的特性看，RNA与mRNA杂交的亲和力比DNA与mRNA杂交的亲和力要高，从而在药用方面具有更大的价值，但是由于目前合成RNA的成本远高于合成DNA的成本，考虑到临床应用的成本要求，目前作为临床应用试验的反义寡核苷酸药物均为寡聚脱氧核糖(DNA)，但将来合成RNA成本有可能降低，可能会在临床上采用反义寡聚核糖(RNA)取代反义寡聚脱氧核糖(DNA)作为药用。
反义核酸的生物学活性是序列特异性的，互补于某一基因特定位点的反义核酸其互补的长度不同，生物学活性高低也不同，一般讲来，反义核酸与目标基因互补长一些，生物学活性会高，但较长的反义核酸其合成成本会高很多，所以作为药用目的的反义核酸，研究者均会同时考虑成本和药用活性选取一个合适的长度，本发明中反义核酸长度均为20个碱基。当然延长或缩短一至数个碱基而互补于同一基因位点的反义核酸也会具有程度不同的相同生物学活性。同时互补于相同基因位点附近的反义核酸若结合部位有不同程度的重叠，被认为具有程度不同的序列同源性，也会具有不同程度的相同生物学活性。在人体内存在着大量的核酸外切酶，反义寡核苷酸若不经过化学修饰会很快被降解，从而失去活性。反义寡核苷酸的化学修饰有很多种方法，常见的有硫代修饰反义核酸和2′-甲氧基修饰反义核酸等，目前硫代反义核酸的药理学，药代动力学，毒理学等临床前研究是各种化学修饰中研究的最为全面的，硫代反义核酸在体内可以有效地抵御核酸酶的降解，并且可以激发RNA酶H的活性，降解与之杂交的mRNA链，所以目前临床试验应用的反义核酸均为硫代反义核酸。同时人们也在进行其它化学修饰的反义核酸临床前药物研究，以期进行临床应用。所以某一特定序列的反义核酸可以通过不同的化学修饰作为化学组份不同的化合物，在临床上都具有药物活性。
综上所述，本发明所述的互补于raf基因不同部位的反义核酸具有抑制人体肿瘤细胞株生长的特性，在肿瘤的治疗方面显示出诱人的前景。可以通过不同的化学修饰，采用不同的长度和不同程度同源性的序列发展为具有临床应用价值的抗肿瘤药物。
可以将本发明的寡序列与药用载体结合，用于动物，包括哺乳动物和人。所述药用载体包括磷酸盐缓冲液(pH7.4)以及其他常用的载体和缓冲液。图例说明
图1．显示反义核酸Pac系列对c-raf基因表达的抑制的Northernblot(核酸杂交)结果的照片。
将A549细胞株分成对照组(无处理)和反义核酸处理组，在1640培养基中将细胞接种，培养至细胞总数为10万，在培养液中加入浓度为10ug/ml的脂质体，处理组用800nM的不同的反义核酸处理。24小时后提取细胞RNA进行c-raf基因mRNA的定量监测。制备c-raf基因的核酸探针与硝酸纤维膜上的样品进行核酸杂交，以G3PDH作为内部参照。
图中，0号样品为无处理组，10号样品为阳性对照，23号样品为阴性对照，其它为不同的Pac系列的反义核酸样品。图中可见Pac系列反义核酸不同的抑制活性。图2．显示反义核酸在抑制细胞生长体系中，加入脂质体的作用。
将A549细胞株分成对照组(无处理)和反义核酸处理组，每组内分为加入脂质体处理的样品和不加脂质体处理的样品，在1640培养基中将细胞接种，培养至细胞总数为10万，相应样品中加入浓度为10ug/ml脂质体，处理组用800nM的不同的反义核酸处理。每个样品均作2次。24小时后提取细胞RNA进行c-raf基因mRNA的定量监测。制备c-raf基因的核酸探针与硝酸纤维膜上的样品进行核酸杂交，以G3PDH作为内部参照。
图中Nooligo表示无处理组，14,12号样品表示用Pac14,Pac12反义核酸处理的样品。+表示加入脂质体，-表示不加入脂质体，从图中可以看到，在培养细胞中，只有加入脂质体，反义核酸才能有生物学活性。图3．Pac系列反义核酸对人体肿瘤细胞株A549生长的抑制(1)将A549细胞株分成对照组(无处理)和反义核酸处理组，在1640培养基中将细胞接种，培养至细胞总数为10万，在培养液中加入浓度为10ug/ml的脂质体，处理组用800nM的不同的反义核酸处理4小时，24小时后用MTT法测定反义核酸对细胞生长的抑制作用，用酶标仪于554nm处测定每一样的吸光值，数值高低线性反映出反义核酸对细胞生长的抑制作用。
图中黑色竖直条表示无反义核酸处理组，浅灰色竖直条表示反义核酸阴性对照，深灰色竖直条表示不同的反义核酸处理结果。图4．Pac系列反义核酸对肿瘤细胞株A549的生长的抑制(2)。
将A549细胞株分成对照组(无处理)和反义核酸处理组，在1640培养基中将细胞接种，培养至细胞总数为10万，在培养液中加入浓度为10ug/ml的脂质体，处理组用800nM的不同的反义核酸处理4小时，24小时后用MTT法测定反义核酸对细胞生长的抑制作用，用酶标仪于554nm处测定每一样的吸光值，数值高低线性反映出反义核酸对细胞生长的抑制作用。
图中竖直条图代表不同反义核酸样品对A549细胞生长的不同抑制程度。control表示阴性对照，其它数字表示不同的Pac系列反义核酸样品。实施例1．反义核酸攻击目标的确定及反义核酸的合成在c-raf基因图谱上选定反义核酸攻击的位点，所选择的位点均位于c-raf基因5′端非转译区及3′端非转译区。
使用美国PE公司应用生物系统部(AppliedBiosystems)制造的391-04型DNA-RNA合成仪及其配套试剂，以亚磷酰胺固相合成法合成硫代的(Phosphorothioate)所设计的反义核酸。合成原料均由合成仪生产厂商提供，主要原料有四种二异丙基β-氰乙基亚磷酰胺单体腺苷(A)，鸟苷(G)，胸腺嘧啶苷(T)，胞嘧啶苷(C)四种控制孔径玻璃粉(Control Pore Glass)固相合成载体(A,G,C,T)盖帽物试剂乙酸酐/二甲基吡啶/四氢呋喃，1-甲基咪唑/四氢呋喃硫代反应试剂二硫化四乙基秋兰姆(TETD)/乙腈脱三苯甲基试剂三氯乙酸/二氯甲烷液体溶剂乙腈和三氯甲烷合成规模为10微摩尔，固相载体量为50微摩尔，碱基单体溶于无水乙腈中，浓度为100毫摩尔，其它试剂浓度及用量均按照仪器手册进行。合成过程完全由电脑自动控制。
合成产物由浓氨水(28％)切割收集在密封耐压的玻璃瓶中，于55℃,15小时进行脱保护处理。脱保护结束后用旋转蒸发仪在40℃,0.1MPa负压下脱去粗产品中的氨，用Pharmacia的G-25分子筛葡聚糖凝胶层析，进行纯化脱盐去除不完全的短片断。层析产物冻干得白色粉末状物质，储存于-20℃。进行产品分析。1．用聚丙烯凝胶电泳方法鉴定纯度及分子量；2．DNA测序法确定序列；3．P31NMR(核磁共振)确定硫代程度。实施例2．以培养细胞初步筛选反义核酸选用人体肺癌A549肿瘤细胞株作为初步筛选试验的系统。参照Miwa,W.等的文献(Miwa,W.et,al.(1994)BiologicalChemistry Hoppe-Seyler,375(10):705-709)对培养于1640中的肿瘤细胞进行如下处理将A549细胞分成对照组(无处理)和反义核酸处理组。在1640培养基中，将细胞接种，培养至细胞总数培养至10万。加入浓度为10ug/ml的脂质体，处理组用800nM的反义核酸处理4小时。24小时后提取RNA进行c-raf基因mRNA的定量监测。制备c-raf基因的DNA探针与样品进行核酸杂交(Northernblot)。(Sambrook,J.,et,al.Molecular Colning:A Laboratory Manual.2nd.ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor,N.Y.)核酸杂交的结果由Pharmacia Image Master扫描仪定量得出。以对照组细胞的c-raf mRNA含量为100％，结果如图1所示。图中，0号样品为无处理组，10号样品为阳性对照，23号样品为阴性对照，其它为不同的Pac系列的反义核酸样品。从图1中可清楚地看到反义核酸Pac14,Pac16,Pac17,Pac18,Pac19,Pac21均具有不同程度的肿瘤抑制活性。实施例3．MTT法测量Pac系列反义核酸对肿瘤细胞A549生长的抑制作用将A549细胞分为对照组(无处理)及反义核酸处理组，在1640培养基培养至细胞总数为10万，加入浓度为10ug/ml的脂质体，处理组加入反义核酸处理4小时，24小时后用MTT法测定反义核酸对细胞生长的抑制作用，用酶标仪于554nm处测定每一样品的吸光值，数值高低线性反应出反义核酸对细胞生长的抑制作用。从图4中可以看出，Pac系列反义核酸对A549细胞生长具有不同程度的抑制作用，其中Pac14对细胞生长有最大的抑制活性。实施例4．Pac14的化学组成结构将Pac14经碘处理，将磷酸硫酯键转化为磷酸二酯键，然后用常规DNA测序方法测定Pac14的核苷酸组成，结果如下5′-GAG GGA GCC AGG CCG CCC CA-3′与设计序列一致。以10％聚丙烯酰胺凝胶电泳测定Pac14的分子量，结果为6500，与理论分子量6423相符。
Pac14是20个脱氧核苷以磷酸硫酯键相连的寡聚脱氧核苷，其攻击位点位于c-raf基因5′端非转译区。实施例5．含寡核苷酸的药物组合物作为动物(包括人类)体内给药的反义核酸药物组合物组成如下寡核苷酸Pac14 10mg/ml一水合磷酸-氢钠1.73mg/ml七水合磷酸氢二钠 14.33mg/ml氯化钠 4.4mg/ml注射用水 适量本发明中其它几种反义寡核苷酸可采用同样配方。
勿用赘言，本发明的反义核酸具有很大的可能通过不同的化学修饰，采用不同的长度和不同程度同源性的序列发展为具有临床应用价值的抗肿瘤药物。单独使用或与其它药物联合使用进行肿瘤病的治疗，这些在本领域的普通技术人员看来是显而易见的。序列表(1)．一般情况Ⅲ．序列总数6(2)．序列情况Ⅰ．序列特性A．长度20碱基B．类型核酸C．链接单链C．构型线型Ⅱ．分子类型脱氧核糖Ⅳ．是否反义核酸是Ⅵ．序列说明第1号序列Pac145′-GAG GGA GCC AGG CCG CCC CA-3′20mer(2)．序列情况Ⅰ．序列特性A．长度20碱基B．类型核酸C．链接单链C．构型线型Ⅱ．分子类型脱氧核糖Ⅳ．是否反义核酸是Ⅵ．序列说明第2号序列Pac165′-AAT CCC ATG TGT CTC CAC CT-3′20mer(2)．序列情况Ⅰ．序列特性A．长度20碱基B．类型核酸C．链接单链C．构型线型Ⅱ．分子类型脱氧核糖Ⅳ．是否反义核酸是Ⅵ．序列说明第3号序列Pac175′-AGA TGC ATT CCT CCA GAA CC-3′20mer(2)．序列情况Ⅰ．序列特性A．长度20碱基B．类型核酸C．链接单链C．构型线型Ⅱ．分子类型脱氧核糖Ⅳ．是否反义核酸是Ⅵ．序列说明第4号序列Pac185′-TGA AGA AAG TCC CGC CTG TG-3′20mer(2)．序列情况Ⅰ．序列特性A．长度20碱基B．类型核酸C．链接单链C．构型线型Ⅱ．分子类型脱氧核糖Ⅳ．是否反义核酸是Ⅵ．序列说明第5号序列Pac195′-TGT GCA AAA TGT CTG GCG CT-3′20mer(2)．序列情况Ⅰ．序列特性A．长度20碱基B．类型核酸C．链接单链C．构型线型Ⅱ．分子类型脱氧核糖Ⅳ．是否反义核酸是Ⅵ．序列说明第6号序列Pac215′-GGC CAG AGT CTC GGC AGT CC-3′ 20mer
权利要求
1．一种寡聚反义脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，其特征在于可特异性结合c-raf基因mRNA的不同区域，所述寡核苷酸序列选自1．Pac14:5′-GAG GGA GCC AGG CCG CCC CA--3′2．Pac16:5′-AAT CCC ATG TGT CTC CAC CT-3′3．Pac17:5′-ACA TGC ATT CCT CCA GAA CC-3′4．Pac18:5′-TGA AGA AAG TCC CGC CTG TG-3′5．Pac19:5′-TGT GCA AAA TGT CTG GCG CT-3′6．Pac21:5′-GGC CAG AGT CTC GGC AGT CC---3′及其同源序列。
2．权利要求1中的反义寡核苷酸，其中所述同源序列与序列1-6有至少70％的同源性。
3．权利要求1中的反义寡核苷酸，其中所述同源序列与序列1-6有至少80％的同源性。
4．权利要求1中的反义寡核苷酸，其中所述同源序列与序列1-6有至少90％的同源性。
5．含有权利要求1中的反义寡核苷酸序列及可药用载体的药物组合物。
6．权利要求1的寡核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。
全文摘要
本发明阐述用化学方法合成一系列序列特异的反义寡核苷酸,其碱基排列顺序与人体内c－raf基因的一段序列互补,这些寡核苷酸可在细胞内特异地与人体c－raf基因的信使核糖核酸(mRNA)杂交,从而阻止c－raf基因编码的c－raf激酶的表达,达到抑制肿瘤细胞增长的作用。这些反义寡核苷酸可用来发展成为抑制人体肿瘤生长的药物。
文档编号A61K48/00GK1221749SQ97125789
公开日1999年7月7日 申请日期1997年12月30日 优先权日1997年12月30日
发明者胡前进 申请人:杭州赛狮生物技术开发有限公司北京分公司, 梁民