专利名称：放射性标记的dna寡核苷酸,制备方法及其治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及放射性标记的DNA载体，其制备方法及利用这种物质来预防失控的细胞增殖。本发明还涉及用于失控的细胞增殖的治疗处理的包括上述放射性标记的DNA载体的装置。更具体地，本发明涉及通过在动脉扩张位点上放射性标记的DNA寡核苷酸的血管内运输来预防再狭窄。本发明还意在血管增殖性疾病和/或其它增殖性疾病例如癌症和相关的转移的一种治疗方法。更具体地，本发明涉及携带一种或多种放射性同位素的DNA序列的制备，其位于DNA序列内，并且通过放射活性的局部运输其在体外可预防细胞增殖，并且根据局部药物运输和全身运输，可以在体内预防细胞增殖，更具体地是再狭窄和恶性肿瘤。换句话说，就是本发明涉及放射性标记的DNA寡核苷酸的合成方法、稳定性数据，本发明细胞培养物中的体外有效性和该分子的体内运输。
虽然气囊血管形成术对非手术性治疗冠状和外周血管疾病时有良好的影响，然而其仍然具有无法估价的再狭窄高发性的妨碍。这阻止了预防该疾病的所有药理尝试。血管平滑肌细胞的增殖被认为代表了构成再狭窄基础的基本过程。低剂量的血管内照射，无论是基于导管还是斯滕特氏固定模，最近都被提议用于下述的气囊血管形成术，就象所发现的在各种诊断情形中抑制高度增生的伤口愈合反应中使用离子化照射可能有效一样。从192Ir源发射出的辐射(β和γ射线)、从90镱源发生的或从90锶/镱源(二者均为纯β发射体)通过导管系统导入一短时间并在血管形成术后立即除去，这在再狭窄的猪模型中抑制了其后的内膜增生。最近在申请人的实验室中用放射性的32P离子植入斯滕特氏固定模在冠状动脉得到了类似结果(RivardA等，1996,Circu lation,94(8):210)。其暗示了来自于β-发射丝的辐射可能已通过杀死祖代细胞或限制其复制能力而抑制了增生。基于32磷全身性注射的治疗目前用于治疗疾病，例如真性红细胞增多症、慢性髓细胞和淋巴细胞白血病和各种来源的骨骼转移灶。
经皮经腔壁血管形成术是一种治疗冠状和外周血管疾病的可接受形式。自从在1977年它被引入用于治疗冠状疾病以来，初期成功率已达到了相当高的水平(90％到95％)并且现在的标准是并发症率为1％到5％。但是观察到在用气囊血管形成术治疗的患者中有一特定的百分率，所治疗的狭窄在3到6个月之内在相同位置上可能可重新出现。血管造影研究说明在成功的气囊血管形成术后再狭窄发现的机率在冠状和外周动脉中可能会分别高达55％至65％。所有预防再狭窄产生的病理学方法都失败了。已开发和研究了许多气囊血管形成术的机械替代方法，仍然没有一种表现出在经皮血管再形成后能够确定性地减少再狭窄的发生，例外情况是在所选患者中用Palmaz-Schatz斯滕特氏固定模可得到少量的降低。这种效应的原因是该斯滕特氏固定模在紧接着该程序之后可通过限制弹性反冲(elastic recoil)现象而一致地大大增加(血管)腔的直径的倾向。虽然已认识到有许多再狭窄的风险因素存在，但绝大部分都不易产生影响。
经皮经腔壁血管形成术导致了不可避免的血管壁损伤。内皮和血管壁结构的破坏引发某些患者产生再狭窄的分子和细胞学事件。一些生长因子、细胞因子和细胞表面受体都已牵涉到此增殖过程中。在血管损伤的动物模型中，在由于弹性反冲所导致的腔直径的直接损失之后，一个重要的级联事件导致了血管形成术后24小时的平滑肌细胞(SMC)的增殖。SMC增殖似乎是对动脉气囊扩张和/或剥落的一致性反应。据报道在血管形成术后的七天中细胞复制达到高峰；血管形成术后28天，培养基和内膜中的SMC增殖似乎都已正常化了。在随后的几周中，然后将其进行基质沉淀。
在治疗局部癌瘤时也面临相同的问题，其中已发现不可能达到成功的局部放射治疗。
最近的研究指出在血管形成术期间或之后在有或没有应用斯滕特氏固定模的情况下通过冠内放射治疗(ICRT)可以减少动物模型中的再狭窄率。使用植入兔子中的低水平放射活性不锈钢斯滕特氏固定模的早期实验表明了对新生内膜细胞增殖的完全抑制(美国专利号5059166和5176617)。最近也已报道在猪实验中对新内膜增殖的抑制，其使用了14个钛斯滕特氏固定模，其中的7个大量植入32P以及中子，其被激活以产生低剂量的真正的β粒子的放射性同位素磷32(32P)。
具192Ir的带的冠内辐射也有已报道能显著地减少猪中新内膜的形成。192Ir通过阴性β发射(最大能量为0.67MeV)以及一级γ放射(能量范围为0.3～0.6MeV)而衰变。半衰期为74.2天。其主要用在近距治疗中，使用的方法是将放射活性源直接植入瘤中或置入摘除位置上以给予给定的处理剂量随后除去。这种益处似乎可以保持6个月，而且没有晚其身照射后遗症的亦。
Waksman报道了他们用高活性192Ir源导入产生伤口后的猪冠状动脉中的实验(Waksman R．等，1995,Circulation,91:1533-1539)。他们表明内膜区到中层的折断长度是与不同的放射剂量负相关的，对所有剂量下的新内膜形成中与对照动脉相比时有显著的减少。一篇结合192Ir带的放射剂量运输的斯滕特氏固定膜植入的报道也指出在猪冠状动脉新内膜形成中的净减少。
最后，报道了有纯β发射体(90镱源)，(90锶/镱源)的丝或导管的用途(Verin等，1995,Circulation.92:2284-2290),Waksman R．等，1995,Circulation,92:1383-1386)。在超过28Gy剂量的情况下没有进一步的抑制效应，证明了剂量反应关系。
最近，在10名患者中将精确量的放疗经皮运输到人冠状动脉中。通过一个冠状导管系统可将铱-192源丝装载并且2000cGRy的处理剂量输送到每个冠状动脉区段的内膜，处理时间为5到15分钟。6个月时的血管造影术对照数据并未得到报道。从这个研究中可以断定经皮经腔壁冠状血管形成术(PTCA)-ICRT可以安全地运送到人上，但是在测试群体中ICRT在减少冠状动脉再狭窄的有效性上仍然是有待确定的。
所有这些结果都非常的鼓舞人心并且暗示通过PTCA后的ICRT可能会显著地降低再狭窄率。然而，目前在理想的放射活性源，剂量输送水平和所用方法方面还没有达成一致。
非常期望能够从靶组织本身内实施放疗而不是组织外的暴露。这可导致一种更为有效的策略来防止再狭窄和任何其它血管增殖疾病或/和治疗其它增殖过程例如癌症和相关转移。
为了实现放射活性的组织内运送，放射载体应当是能够偶联到放射性同位素上的分子，能有效地穿透靶组织，穿过细胞膜并能在靶组织中在体内保持足够长的时间以实现所需的剂量传送。DNA寡核苷酸可能有非常好的必需特质以满足成为有效的放射活性载体的要求。
在我们的实验室中我们已表明有或没有结合胆固醇的DNA寡核苷酸可被有效地在体内局部输送于血管壁，穿过细胞膜，在细胞内掺入并在体内保持的时间至少可长达一周。我们和其它人(Azrin M等，1997,Cathet.Cardiovasc.Dign.,41(3):231)已表明市场上可买到的导管例如Dispatch导管，(Scimed,MN,USA)或Infiltrator导管(Interventional Technologies,CA,USA)可以以上述方式在动物或人冠状动脉中实现寡核苷酸的局部药物输送。因此，如果可将放射性同位素和DNA寡核苷酸结合起来利用上述的局部药物运输导管将同位素运输到靶细胞中，就可以实现组织内放疗的构思。
随着对血管疾病的位点特异性药物运输的最新发展，根据本发明，通过在扩张位点的标记的DNA载体(例如寡核苷酸)而局部地运输磷32的分子放射性治疗的血管形成术位点的β辐射似乎是可行的并且能够防止平滑肌细胞增殖和再狭窄。
本发明还可与其它治疗方式结合，而这种其它治疗方式已在动脉中表现出了有效性，例如斯滕特氏固定模。这种基于本文所述的本发明的应用的局部药物输送策略可能应用到所有血管增殖疾病例如冠状和外周动脉再狭窄、动静脉瘘等以及癌和转移治疗因此，本发明的一个目的是提供一种新的和创新的方法以防止再狭窄和潜在的任何其它血管增殖疾病或/和治疗其它增殖过程例如癌和相关转移。
本发明的另一目的是提供短的DNA序列，其能携带一种或几种放射性同位素，位于DNA序列内部，并且其可防止在体外细胞的增殖以及在局部药物输送后防止在体内再狭窄的产生。
本发明的其它目的将如下显现出来。
根据本发明，提供了包含放射性标记的DNA载体(例如寡核苷酸)的治疗剂，其中的放射性同位素优选位于DNA序列内部。该放射性同位素也可以位于DNA载体的未端部分(5′端或3′端)，由于从DNA载体上切下来，因此其可能有效性较低。
根据本发明，该DNA载体起到放射性同位素的载体的作用从而放射性同位素可以穿透细胞膜并留在细胞内，其时间足以使得放射性同位素产生足够剂量的治疗。
用于放射性标记本发明的载体(例如寡核苷酸)的同位素可以是α、β或γ放射体。根据本发明优选的放射性同位素包括但不限于32P、33P、125I、131I、35S、198AU、90Y、89SR、186Re、45Ca和153Sm。根据本发明优选使用的放射性同位素的半寿期应当在10小时到1000天的范围之间。
其上将结合有放射性同位素的寡核苷酸载体是双链DNA序列、单链DNA序列或其DNA类似物。单个的核苷酸可如下进行化学修饰。
1．核苷酸间键例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或任何其它能连接单个的核苷酸的共价键。
2．一般位于核苷酸的2′位置上的氢(H)可被其它化学部分例如2′-O-甲基、2′-O-丙基、2′-氟、2′-O-甲氧基乙基取代，并能因此被赋予增加了的代谢稳定性。
3．嘌呤和嘧啶碱也可被化学性地改变，原因如第2条中所述。
根据一个优选的实施方案，该寡核苷酸与其细胞特异性运输的抗体结合。
根据另一个优选的实施方案，该寡核苷酸与憎水部分例如胆固醇结合，可以有益地影响其药物动力学特性。
本发明的放射性标记的DNA载体在其被给药到患者之前可被包裹到脂质体制剂中。
本发明的放射性标记的载体(例如寡核苷酸)可以直接或间接地结合到斯滕特氏固定模的表面以防止在再狭窄情况下发生的失控的细胞增殖。
DNA载体序列可以是质粒，例如起源于病毒或细菌的环状质粒，其可以是完全或不完全的形式。根据本发明这样使用的病毒质粒可以是腺病毒。
根据本发明的另一个优选实施方案，寡核苷酸载体序列可以通过任何反义机制来标靶一个特定的基因，或者它可以是一个无关的序列。从至少两个核苷酸到约5000个核苷酸的DNA的任何序列都可以用作根据本发明的DNA或DNA类似物寡核苷酸，优选有25个核苷酸或更少的DNA序列。例如，可以使用下面的序列但不限于cmycCAC GTT GA*G GGG CAT(SEQ ID NO:1)cmyc有义ATG CCC C*TC AAC GTG(SEQ ID NO:2)FOS GCC CGA*GAA CAT CAT(SEQ ID NO:3)Jun CCT CGC*AGT TTC CAT(SEQ ID NO:4)
其中*代表放射性同位素的位置，例如32P，其中放射性同位素可能位于下划线区域的任何位置上。
虽然并不禁忌，但对本发明来说，特定的靶的反义序列并非必需。通过利用c-myc mRNA序列的有义或反义序列的寡核苷酸可以在体外获得类似的显著水平的平滑肌细胞的增殖抑制。有义和反义标记的序列都导致了相同水平的增殖抑制，原因是该分子的治疗成分是掺入到转染序列中的同位素(磷32)的β放射。
本发明还涉及制备放射性标记的DNA载体序列(例如寡核苷酸)的方法，其中同位素位于DNA序列内部，其包括的步骤有a)以至少两个部分合成DNA序列；b)以放射性同位素标记两个部分中一个的5′端；c)将步骤b)中的两个或更多个部分与在严紧条件下能杂交的序列杂交；以及d)将杂交的两个或更多部分连接起来以形成放射性标记的双链DNA寡核苷酸。
为了得到本发明的放射性标记的单链寡核苷酸，该方法在上述步骤d)之后进一步包括一个步骤e)，其包括e)分离杂交的DNA并回收放射性标记的单链DNA寡核苷酸序列。
同样，当期望的是双链都被放射性标记的双链寡核苷酸时，该方法在上述步骤e)之后进一步包括一个步骤f)，其包括f)将步骤e)的互补的放射性标记的单链DNA寡核苷酸杂交在一起。
当步骤a)的两个部分形成反义序列时，步骤c)的可以杂交的序列是一相应的有义序列。
当步骤a)的两个部分形成有义序列时，步骤c)的可以杂交的序列是相应的反义序列。
本发明进一步涉及在哺乳动物中防止失控的细胞增殖的方法，其包括将上述定义的治疗物质输送到发生失控的细胞增殖的地点。例如，当失控的细胞增殖是血管形成术后的再狭窄时，治疗物质通过位点特异性血管内输送，例如前述来进行输送。
另外一种可能性是当失控的增殖是癌或恶性瘤时。在这种情形下，治疗物质被偶联到抗体或肽部分上这类肽部分包括但不限于转化生长因子α(TGFα)，TGFβ、细胞因子和任何生长因子。偶联的放射性标记寡核苷酸可以以位点特异性的方式局部给药或全身给药。
这种治疗的内部放射性标记的寡核苷酸可以与其它部分结合，例如胆固醇、油酸或亚油酸，这种接合可以有利地影响其血管药物动力学特性。其还可与抗体结合以提高其细胞特异性。只作为放射性同位素载体的DNA序列可以是已知遗传靶的一有义或反义序列。所用的序列并非代表分子的治疗部分。该分子的抗增殖活性来源于结合到该DNA上的分子。
图1描述了通过经腔的方法以80微摩尔的荧光标记15mer的DNA寡核苷酸感染的兔颈动脉组织切片；图2描述了在局部体内转染后15mer的DNA寡核苷酸在血管壁上的保留。
图3是根据本发明的一个实施方案的32P标记的DNA寡核苷酸序列的扼要说明；图4表明了在体外暴露于内切酶和外切酶后32P标记的寡核苷酸(SEQID NO:1)的稳定性。
图5表明了将32P标记的寡核苷酸(SEQ ID NO:2)加入到体外平滑肌后的剂量反应曲线。
图6表明了对平滑肌细胞增殖具有相同的抑制能力的32P标记的寡核苷酸的有义或反义序列；图7表明了在防止平滑肌细胞增殖时与未标记的寡聚体相比，标记的寡核苷酸的显著的优越性。
图8表明了其中使用了斯滕特氏固定模的对照的猪冠状动脉组织学切面。
图9表明了处理的猪动脉的组织学切面，其中在80微摩尔的32P标记的寡核苷酸(15mer,SEQ ID NO:1)的局部输送之后使用了斯滕特氏固定模。
前面所述的涉及保持在靶细胞外的源的使用32P的绝大部分方法部已获得了专利，而且有几种，即所谓的基于斯滕特氏印膜的方法，在日常操作中由于实际的原因而非常难于实施。申请人已在局部药物输送领域获得了重要的专门知识。β-发射源和DNA载体或寡核苷酸的两种预防再狭窄的技术被以一种独特而又创意的方法结合在一起。
图1表明兔颈动脉，其已被80微摩尔的DNA寡核苷酸(15mer，硫代磷酸酯)转染30分钟。超过90％的细胞都被有优选核定位的寡核苷酸转染，从而证明了这种寡聚体在体内在局部输送后透过血管组织和穿透细胞的能力。IEL代表内部弹性层，M代表血管的血管中层。包含于动脉血管中层的细胞中超过90％已成功地被荧光标记寡核苷酸转导。
图2表明了在兔颈动脉的局部转染后，转染的DNA寡聚体可留在血管壁中长达一周。转染可通过结合有胆固醇或未结合有胆固醇的寡核苷酸完成。在体内，在处理的血管位点，短的DNA序列可保留长达一周的时间。
根据本发明，优选的放射性同位素是32P，其为纯β发射体，平均能量为0.69MeV，最大能量为1.71MeV(软组织中最大范围为～8mm)，半衰期为14.3天。利用32P的有效组织载体使得可以在血管壁内并且有可能在细胞内实现放疗。
根据本发明，携带原癌基因c-myc的有义或反义序列的15mer的寡核苷酸被用于证实放射性标记的(32P标记)寡核苷酸抑制细胞的增殖的潜力。
在分子生物学中用放射性同位素(32P)进行寡核苷酸末端标记是一种非常普通的反应。然而，与磷酸二酯寡核苷酸相比，使用硫代磷酸酯更难以完成末端标记。而且，磷酸二酯寡核苷酸在转染后可很容易地在体内被核酸酶降解(几个小时之内)。寡核苷酸的5′端或3′端的标记并不表现出强的稳定性，而且只要其与细胞一起温育，标记就可以从该寡核苷酸上被切割下来。使用了一种在内部位置寡核苷酸的方法。图1中简要描述了制备这种放射性标记的寡核苷酸的扼要示意图。
用于完成此证明的终产物的序列为CACGTTGA(*)GGGGCAT(SQ IDNO:1)(*表示具放射活性磷原子的位置)。为了得到此结果，下面表1中的3个不同寡核苷酸被使用。表1寡核苷酸序列 特征序列号1．c-myc19 ATGCCCCTCAACGTGAAAA 硫代磷酸酯或SEQ ID NO:5磷酸二酯2．c-myc1 CACGTTGA 硫代磷酸酯 SEQ ID NO:63．c-myc2 GGGGCAT 硫代磷酸酯- SEQ ID NO:7磷酸二酯第三个寡核苷酸(c-myc2)是混合的硫代磷酸酯-磷酸二酯分子。头2个核苷酸间键为磷酸二酯，而剩下的键为硫代磷酸酯。内部标记寡核苷酸的合成涉及到c-myc2的5′端标记，随后是c-myc2和c-myc1与c-myc19的退火，接着是c-myc2与c-myc1的连接，最后是将c-myc2-c-myc1与c-myc19分离开来。
第一个反应是c-myc2寡核苷酸在5′端的标记。该标记通过将50～100pmol的寡核苷酸与50μCi的g32P-ATP及2单位的T4聚核苷酸激酶在37℃下温育2×30分钟(激酶的第二次加入是在头30分钟之后)进行。通过凝胶过滤从混合物中除去未掺入的32P。
对退火而言，将32P标记的c-myc2回收，并且在有12.5mM TRIS-HCl(pH8.5)、12.5mM MgCl2存在的条件下，将与等摩尔量的C-myc19和C-myc1在55℃下温育30分钟，然后冷却至室温。
通过将退火混合物在有33mM CH3COOK、1mM ATP和14单位的TDDNA连接酶存在下在16℃温育过夜进行C-myc2和C-myc1的连接。
为了从C-myc19上分离连接好的c-myc2-c-myc1，将等体积的甲酰胺缓冲液(80％甲酰胺、10mM EDTA、1mg/ml溴酚蓝、二甲苯苯胺)加到连接混合物中，然后将样品于65℃加热5分钟，并上样到20％聚丙烯酰胺-尿素凝胶中进行电泳。迁移后，将相当于连接后的C-my2-myc1(15个碱基长)从凝胶上切下来。将所切得的凝胶块破碎成细末，并将该细末与2倍体积的TE(10mM TRIS-HCl(pH7.5),1mM EDTA)在55℃下温育30分钟。离心后回收洗脱物并通过亲和层析脱盐。用这种方法就有可能产生内部32P标记的寡核苷酸。所回收的寡核苷酸的活性的数量级约为1.2μCi。
所有的寡核苷酸的合成都是在寡核苷酸合成仪中进行的，该仪器由Applied Biosystems以392 DNA/RNA SynthesizerTM的名称出售。合成后，用购自Glen Research的Poly-PakTMⅡ柱纯化该寡核苷酸。另外，它们可通过HPLC(高效液相色谱)纯化。
内部32P标记的寡核苷酸的效应的验证在平滑肌细胞生长上进行。为了测定平滑肌细胞的增殖，使用了含氚胸腺嘧啶掺入实验。通过将细胞温育于饥饿培养基中使其静止。通过增加培养基中的胎牛血清含量可活化增殖。在活化时将标记好的寡核苷酸加到四联体孔中的细胞上。活化后12小时在培养基中加入含氚胸腺嘧啶，在进一步温育12小时之后确定细胞掺入含氚胸腺嘧啶的量。在有平滑肌细胞存在下，温育一个0.2μCi的剂量的寡核苷酸也可评价32P标记的寡核苷酸的稳定性。温育7天之后，通过聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳确证了32P标记的寡核苷酸的完整性(图4)。该分子显示了至少七天的稳定性。
利用上述方法得到了猪和人类平滑肌细胞增殖的抑制的剂量反应曲线(图5)。该实验通过向体外生长的平滑肌细胞中加入32P-标记的寡核苷酸(SEQ ID NO:2)而进行。
β-放射对细胞增殖指标的抑制效应是与非照射的对照细胞相比在处理细胞中得到的增殖的相对百分比。未标记的寡核苷酸(4,8和20nmol/L、SEQ ID NO:2，对c-myc有义)对细胞增殖的效应估计少于10％。然而用32磷标记的寡核苷酸(SEQ ID NO:2)以剂量依赖性的方式(0.4到8.7Gy)得到了对猪和人平滑肌细胞增殖的显著抑制。在有义和反义序列中同时看到这种抑制(图6)支持了一个事实，即本发明的治疗特性是基于DNA载体所携带的放射性同位素而非该寡核苷酸的序列特异性所引述的。这也解释了一个事实，即该分子的治疗成分来自于插入到DNA序列中的放射性同位素所发射出的放射活性。
如图7所示，在对平滑肌细胞的增殖的抑制上32P标记的寡核苷酸要比未标记的DNA有效得多得多这些结果证明用标记的DNA载体处理细胞的显著优势。
为了证实32P标记的寡核苷酸(SEQ ID NO:2)在防止体内平滑肌细胞增殖方面的有效性，我们测定了这些药剂在猪冠状动脉再狭窄模型中的有效性。通过在猪冠状动脉中以冠状斯滕特氏固定模的过度缝合产生了再狭窄损害。所导致的伤口反应诱导了新内膜平滑肌细胞的增殖和腔区域的减少。在对照动脉中，所使用的斯滕特氏固定模与动脉的比率为1.3/1，所使用的是传统的血管形成术气囊导管。对动物没有进行更进一步的处理。四周之后，该动物被屠宰，以斯滕特氏固定模处理的动脉用以进行组织学分析。如图8所示，可以看到对斯滕特氏固定模过度延展的强烈反应的同时形成一个重要的新内膜层，它显著地减少了腔的区域。注意到在形成显著地减少腔区域的重要的新内膜层时的28天中强烈的增殖反应。
与此形成对照的是，将猪冠状动脉以相同的方式进行斯滕特氏固定模处理，同时也以2微居的32P标记的寡核苷酸(SEQ ID NO:2)局部给药处理，于是其表现出了显著的降低，在斯滕特氏处理之后(图8)常见到新内膜增生中有超过85％的降低(图9)。在斯滕特氏固定模植入和放射活性寡核苷酸的局部输送中后28天中，与对照动脉中所看到的相比，新内膜层形成有显著的降低(图7)。在用Dispatch导管定位的斯滕特氏固定模之前，寡核苷酸被运输到猪冠状动脉中。局部运输在15分钟之内即已完成。
硫代磷酸酯寡核苷酸已被证明是一种相当好的候选物来获得组织间载体用于放疗，原因是在转染后其稳定性已被证明可至少达7天。该结果证实了这种方法的可行性。体外数据表明·放射性标记(32P)的寡核苷酸产生了对平滑肌细胞增殖的剂量依赖性抑制；·用标记的DNA介导的8.7Gy剂量，该抑制水平常常达到100％；·高效抑制并不依赖于DNA的序列，但依赖于给予细胞的放射活性水平；·用放射性标记的(32P)的寡核苷酸所得的平滑肌细胞增殖的抑制水平与用非放射活性的相同的DNA序列相比具有极大的优越性，在此情况下所用的DNA量是相同的；以及·用放射性标记(32P)的寡核苷酸所得的最高的抑制水平(在8.7Gy时为100％抑制)，然而用传统的寡核苷酸却从未观察到这种抑制水平。
根据这些数据以及将放射性标记(32P)的寡核苷酸局部输送到血管形成术位置处的可行性的证实，可以合乎情理地断定可以期望在局部输送放射性标记的寡核苷酸后在体内防止平滑肌细胞的增殖。利用市场上可买到的局部药物输送导管，例如“Dispatch”,“Transport”导管或“Infiltrator”导管可以在冠状和外周动脉中进行这种局部的、位点特异性的输送。
上述的以预防其通过核酸酶降解方式用32P放射性标记DNA载体或寡核苷酸的方法也可应用到肿瘤学中去，从而提供了一种方法将治疗有效量的放射剂量特异性地输送到肿瘤上并尽可能地减少了正常组织对它的暴露。
这点是可以达到的，例如首先放射性标记与癌细胞遗传物质具有高亲和性的DNA载体序列或寡核苷酸。然后该放射性标记的DNA或寡核苷酸序列被结合到识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体(MoAb)上。这种在放射性标记的DNA序列和MoAb之间的键可以通过利用为此目的而特异设计的“肽核酸”(PNA′S)的氨基连接臂来完成。
虽然本发明已与其特定实施方案一起进行了描述，应当理解可进一步改进而且这种应用意欲覆盖一般而言如下的根据本发明的原则的发明的任何变化、用途或适应性的改变，并且包括那些诸如源于在本发明相关的领域内的已知的常规的手段，以及可应用于此前建立的基本特征上，以及如下位于所附的权利要求的范围内的对本公开的背离。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)姓名ANGIOGENE CANADAINC.
(B)街道12359 rue Crevier(C)城市Montreal(D)省Quebec(E)国家Canada(F)邮编(ZIP)H4K 1R3(G)电话(514)333-6369(H)电传(514)333-1859(A)姓名CENTRE DE RECHERCHE DU CENTRE HOSPITALIERDEL′UNIVERSITE DE MONTREAL(B)街道3850 rue St-Urbain(C)城市Montreal(D)省Quebec(E)国家Canada(F)由编(ZIP)H2W 1T8(G)电话(514)843-2737(H)电传(514)843-2753(A)姓名LECLERC,Guy(B)街道327 Lorraine(C)城市Rosemere(D)省Quebec(E)国家Canada(F)由编(ZIP)J7A 4K1(A)姓名MARTFL,Remi(B)街道4865 Lafontaine
(C)城市Montreal(D)省Quebec(E)国家Canada(F)邮编(ZIP)H1V 1R5(ⅱ)发明名称放射性标记的DNA寡核苷酸，其制备方法及治疗用途(ⅲ)序列数7(ⅳ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Rekase#1.0，版本1.30(ⅴ)当前申请数据(A)申请号(B)申请日(ⅵ)在先申请数据(A)申请号US08/756,728(B)申请日1996年11月26日(2)序列1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)假拟结构无
(ⅳ)反义是(ⅹⅰ)序列描述序列1:CACGTTGAGG GGCAT(2)序列2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)假拟结构无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)序列描述序列2:ATGCCCCTCA ACGTG(2)序列3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)假拟结构无(ⅳ)反义是(ⅹⅰ)序列描述序列3:GCCCGAGAAC ATCAT(2)序列4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)假拟结构无(ⅳ)反义是(ⅹⅰ)序列描述序列4:CCTCGCAGTT TCCAT(2)序列5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)假拟结构无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)序列描述序列5:ATGCCCCTCA ACGTGAAAA(2)序列6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)假拟结构无(ⅳ)反义是(ⅹⅰ)序列描述序列6:CACGTTGA(2)序列7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7bp(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)假拟结构无(ⅳ)反义是(ⅹⅰ)序列描述序列7:GGGGCAT
权利要求
1．预防失控的细胞增殖的抗增殖物质，其包括放射性标记的DNA载体，其中放射性同位素位于DNA序列内部，在其5′端或3′端，而且其中所说的放射性标记的DNA载体穿透了细胞膜，并保留在细胞内足够的时间以使放射性同位素产生有效的剂量治疗。
2．根据权利要求1的抗增殖物质，其中所说的载体是寡核苷酸。
3．根据权利要求2的抗增殖物质，其中所说的寡核苷酸是线性的。
4．根据权利要求1的抗增殖物质，其中所说的载体是质粒。
5．根据权利要求4的抗增殖物质，其中所说的质粒是环状的。
6．根据权利要求5的抗增殖物质，其中所说的质粒源自病毒或细菌。
7．根据权利要求1的抗增殖物质，其中所说的放射性同位素选自32P、33P、125I、131I、35S、198AU、90Y、89SR、186Se、45Ca和153Sm。
8．根据权利要求3的抗增殖物质，其中所说的寡核苷酸为双链的DNA序列或单链的DNA序列。
9．根据权利要求3的抗增殖物质，其中所说的寡核苷酸与细胞特异性运输的抗体结合。
10．根据权利要求8的抗增殖物质，其中所说的DNA寡核苷酸序列是杂交到特定遗传靶子上的单链有义DNA序列。
11．根据权利要求8的抗增殖物质，其中所说的DNA寡核苷酸序列是杂交到特定遗传靶子上的单链反义DNA序列。
12．根据权利要求1的抗增殖物质，其包括至少约为2到约5000个核苷酸的DNA序列。
13．根据权利要求12的抗增殖物质，其中的DNA序列选自CAC GTT GA*G GGG CAT(SEQ ID NO:1)ATG CCC C*TC AAC GTG(SEQ ID NO:2)GCC CGA*GAA CAT CAT(SEQ ID NO:3)CCT CGC*AGT TTC CAT(SEQ ID NO:4)其中放射性同位素在核苷酸4和12之间的任何位置上。
14．根据权利要求3的抗增殖物质，其中的寡核苷酸结合到至少一个选自下列的物质斯滕特氏固定模表面、胆固醇、油酸、亚油酸、TGFα、抗体、TGFβ、细胞因子和生长因子。
15．根据权利要求13的抗增殖物质，其中放射性同位素选自32P、33P、125I、131I、35S、198AU、90Y、89SR、186Re、45Ca和153Sm。
16．制备其中放射性同位素位于DNA序列内部的放射性标记的DNA载体序列的方法，其包括步骤a)以至少两个部分合成DNA序列；b)以放射性同位素标记所说两个部分中一个的5′端；c)将步骤b)的所说两个部分与在严紧条件下能杂交的序列杂交；以及d)将所说杂交的两个部分连接起来。
17．权利要求16的方法，其在步骤d)之后进一步包括一个步骤e)以获得一个单链放射性标记的DNA载体，其包括e)将杂交DNA分离开并回收放射性标记的DNA载体序列。
18．权利要求12的方法，其在步骤e)之后进一步包括一个步骤f)以得到两条链都被放射性标记了的双链载体，其包括f)将步骤e)的互补的放射性标记的单链DNA载体杂交在一起。
19．权利要求18的方法，其中所说的放射性同位素选自32P、33P、125I、131I、35S、198AU、90Y、89SR、186Re、45Ca和153Sm。
20．权利要求18的方法，其中所说的步骤a)的两个部分形成反义序列而且所说的步骤c)的能杂交的序列是一相应的有义序列。
21．权利要求18的方法，其中所说的步骤a)的两个部分形成了有义序列而且步骤c)的所说的能杂交的序列是相应的反义序列。
22．在哺乳动物中预防失控的细胞增殖的方法，其包括将根据权利要求1的治疗物质原位运输到所说哺乳动物的所说失控的细胞增殖发生的地方。
23．根据权利要求22的方法，其中所说的失控的细胞增殖是血管形成术后的再狭窄，并且所说的治疗物质是通过位点特异性血管内运输来进行运输的。
24．根据权利要求23的方法，其中治疗物质偶联到了抗体上。
25．根据权利要求22的方法，其中所说的失控的细胞增殖是癌或恶性肿瘤，并且所说的治疗物质偶联到了肽部分上。
26．根据权利要求25的方法，其中所说的肽部分选自抗体、TGFα、TGFβ、细胞因子和任何生长因子。
全文摘要
本发明涉及放射性标记的DNA载体，其制备方法以及这种物质在预防失控的细胞增殖的用途。本发明还涉及用于治疗失控的细胞增殖的掺入了上述放射性标记的DNA载体(例如寡核苷酸)的装置。更具体地，本发明涉及在动脉扩张位点进行血管内运输放射性标记的DNA载体来预防再狭窄。本发明还意在一种治疗血管增殖疾病和/或其它增殖疾病例如癌和相关迁移的方法。更具体地，本发明涉及制备携带一个或多个放射性同位素的DNA序列，该同位素位于DNA序列内并能在体外预防细胞增殖，以及按照局部药物运输和/或全身性药物运输，能在体内预防细胞增殖，更具体地预防再狭窄和恶性肿瘤。换言之，本发明涉及放射性标记的DNA载体的合成方法、稳定性数据，本发明在体外的细胞培养物中的有效性，以及该分子在体内的运输。
文档编号A61K48/00GK1238702SQ97180068
公开日1999年12月15日 申请日期1997年11月26日 优先权日1996年11月26日
发明者盖伊·莱克勒克, 雷米·马特尔 申请人:安乔吉恩公司, 蒙特利尔大学看护中心的研究中心