专利名称：银杏提取物在药物组合物制备中的应用,以及银杏提取物用作美容性治疗的方法
技术领域：
本发明涉及在将可从银杏(Ginkgo biloba)获得的提取物用于免疫调节领域。这些提取物对于治疗、预防以及调节免疫紊乱的皮肤表现尤其有用。
银杏是一种雌雄异株树木，自然生存于远东，它的叶子可以用于制备医药。
银杏提取物已被提议用于改善以下疾病症状老年人的智力低下、间歇性跛行、管腔闭合性动脉病变和Rayaund氏病；在肾功能低下的病例中，也提倡使用它，银杏苦内酯族的成份更是与预期的活性密切相关。
出乎预料，本申请人发现从银杏得到的这些提取物有免疫调节作用。因此，本发明的主题就是利用至少一种可以从银杏提取的活性成份，制备一种通过局部途径给药有免疫调节活性的组合物。
免疫反应由复杂的系统来调节，它参与维持身体总的良好的状态。它们负责抵御外来物---尤其是病原物，或者抵御已经过成瘤性转化的宿主细胞。
这种防御涉及抗原的外源性的识别，以及细胞或体液中介物的激活。它依赖于遗传因素，通过组织主要相容性复合体起作用。
然而，有时，当这种反应太剧烈，或者是针对本质上无害的环境抗原时，这种反应机制并不为人所需。器官和组织移植时，也是如此。另外，一些功能缺陷也造成宿主错误识别自身细胞，这些细胞被宿主自己的免疫系统所破坏，能引起广泛的病理变化(比如播散性红斑狼疮、皮肤肌炎、风温性关节炎，或者某些类型的爆发性肝炎)。
还有观察报导，变态反应性病人中，大多数也有所谓的敏感性皮肤。总的说来，主诉这种皮肤的人越来越多。虽然它们的病因复杂，似乎总是牵涉到变态反应性或炎症性因素。
敏感性皮肤的含义包括一系列表现，包括易反应性皮肤和不易耐受性皮肤。诱发因素包括环境的刺激，比如风，污染，气温变化，过硬的水，以及不合适的卫生、美容或保健用品。这些现象或许还与明显的紧张或情绪变化，食入某些食物或使用医药用品有关。另外，还有个人的素因性因素(尤其是神经性或体液因素)，或一些家族性的素因性因素，这可以加强这些反应。
总之，这些个体感到皮肤不适，这可以有主观或客观的表现。皮肤容易有刺痛，发痒，钻痛的感觉，也可能有热，咬，烧灼的感觉。皮肤也容易发红或脱屑。干燥，脂溢性皮炎，毛细血管病，水疱，水肿也不定性出现。
这种状况可以表现在皮肤，粘膜或头皮水平。后一种情况可能伴有头屑或脱发。
如上提示，这种状况总是包含变态反应性成份。另外，它可以发展成变态反应性皮肤疾病，例如特应性皮炎，湿疹或神经性皮炎。
变态反应根据免疫反应的性质可以分为四种类型。它们起因于免疫性炎症机制。
现已发现，银杏提取物有免疫调节活性。这可以用混合淋巴上皮细胞培养来证明。
实际上，皮肤，尤其是上皮---Langerhans细胞的存在处，在免疫屏障中发挥着一定的作用。Langerhans细胞(LC)作为抗原呈递细胞的功能的确定，以及角质细胞可以产生因子参与免疫反应的事实，是皮肤免疫系统概念的起因。Langerhans细胞存在于外层，这要求它们负责制备抗原并将其呈递给淋巴细胞。抗原呈递涉及表达在Langerhans细胞表面的主要组织相容性抗原Ⅱ类分子(HLA-DR)与表达于CD4阳性的淋巴细胞表面的T受体之间的相互作用。致敏早期，Langerhans细胞在上皮内抓取抗原，并将其转化成免疫原性肽。通过Langerhans细胞表面的HLA-DR-免疫性肽复合物与CD4阳性淋巴细胞表面的T受体的相互作用，在神经节实现抗原向T淋巴细胞的呈递。
混合淋巴上皮细胞培养(MLECs)构成了一种模型。它通过测定在有和没有受试物处理时，抗原呈递同种异型上皮细胞诱导的淋巴细胞增生，使人们可以确定受试物改善皮肤的免疫平衡的的免疫调节活性。
抗变态反应的活性也在角质细胞和巨嗜细胞得到证明。因为存在于皮肤，巨嗜细胞尤其具有优势，它们不仅调节炎症反应，也通过它们呈递抗原以及产生众多细胞因子的能力调节着局部免疫。这些巨嗜细胞也参与与循环系统的通讯联系，后者在需要的时候可以释放不同类型的细胞(单核细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞)，这样可以增加所述组织的特异和非特异的防御能力。
从银杏提取的活性成份的活性评价是在人类角质细胞和巨嗜细胞培养物上进行的，这些细胞先经过刺激或经IL-4处理---这可以诱导细胞表面的CD23受体----然后由IgE免疫复合物处理。这类刺激诱发过敏性炎症(IgE)；它将细胞置于超氧反应(产生超氧负离子或NO自由基，其量可以从测定氮衍生物的产生来衡量)和免疫性炎症反应(产生细胞因子，例如TNF-α)的环境下。
另外，从银杏提取的活性成份对炎症有局部的非特异作用，这也加强了这种免疫调节活性。
需要强调的是，根据本发明，这种(些)有用的活性成分作为银杏提取物形式存在于组合物中的。多种银杏提取物可能适合本发明。在这些提取物中，萜的浓度最好少于7％(w/w)。
实际上，银杏有复杂的化学组成包括脂族醇、碳水化合物、甾体、氨基酸、多酚-例如毛地黄黄酮(luteolin)、栎醇和更特异的从穗花杉双黄酮衍生的双黄酮(白果黄素(bilobetin)，银杏黄素(ginkgetin))；它还包含银杏酸和含倍半萜链的漆树衍生物，从柠烯(limonene)衍生的萜类和有叔丁基的萜类(白果内酯和银杏苦内酯)。
适于本发明的提取物中萜类衍生物含量应该少于干重大约3％w/w，最好少于1％w/w，少于0.05％w/w更好。
叶绿素，脂类，蜡，植物血凝素最好从所用提取物中基本除去。
提取物也基本上不含银杏酸，双黄酮类，或游离甙配基。
原花色素类浓度最好少于提取物干重的5％w/w。
根据本发明，可用的提取物杂甙黄酮(flavone heteroside)含量应大于干重的24％w/w，大于28％w/w更好，29-35％w/w更有利。
杂甙黄酮是糖基配基为黄酮醇的化合物，如栎精、堪非醇或异鼠李黄素。它们是单糖，三糖尤其是四糖甙，它们的基本糖组成是葡萄糖和鼠李糖。它们主要以栎精和堪非醇葡萄糖鼠李糖甙的香豆素酯形式存在。
尤其适于本发明的银杏提取物应含水少于3％w/w，杂甙黄酮32±3％w/w，银杏酸浓度少于10ppm，原花色素类少于5％w/w，以及萜类少于0.5％w/w。
本发明涉及利用从银杏提取的至少一种活性成份，来制备一种能够预防，治疗和/或改善以上所述的敏感性皮肤反应的组合物。
根据本发明的另一个特征，本发明涉及利用从银杏提取的如上所述活性成份，制备组合物来治疗或预防以下疾病群的某一种状态特应性皮炎，白斑，牛皮癣，多形性红斑，神经性皮炎，干皮病，红斑痤疮，荨麻疹，天疱疮，红斑狼疮，皮炎，良性夏季光照性皮炎和湿疹。
与本发明相应，通过调节剂量，银杏提取物可以用来调节特定的免疫机制。
这样，可以建议用它们来治疗AIDS伴发的皮肤状况；例如Kaposi病，它通常表现为四种临床形式(据推测疱疹类病毒感染是致病因素)，目前对它的认识是主要由炎性细胞组成的增生物。
本发明的组合物中，银杏提取物最好占0.0001-10％w/w，0.01-2％w/w之间更好。
提取物可以这样在组合物中使用，也可预先与磷脂混合使用。脂质体或Phytosome载体可以提高它们的生物利用度。
本发明的另一个主题是提供一种超反应性皮肤的美容处理的方法。其特征在于通过局部途径使用从银杏提取的一种以上的活性成份。
本发明的组合物最终加入美容学上和皮肤病学上可以接受的赋形剂成形。本行业的专业人士熟知这些赋形剂。
下面这些例子用来说明本发明。
在这些例子中，对这些图将有说明。
图不同浓度银杏提取物下淋巴上皮细胞的增生例一1．材料和方法产品下列产品在研究中使用过IL-4购自Immugenex(Los Angles，加州)，采用10ng/ml；单克隆IgE购自Stallergene(Fresnes，法国)；抗IgE购自Nordic(Tilburg，荷兰)。
角质细胞培养原代角质细胞培养物来源于新生儿包皮，用不含小牛血清的培养液在体外保持增生。融合的培养物用胰酶消化后，以105细胞/ml/孔的密度，用新培养液转入24孔板。细胞表面的IgE受体(CD23)用免疫标记法确证。
巨嗜细胞培养巨嗜细胞从正常(非变态反应者)供体的外周血获得。单核细胞用Ficoll梯度分离，回收淋巴细胞环，洗涤三次，然后培养细胞，让巨嗜细胞细胞贴壁。培养一小时后，回收细胞，以106细胞/ml/孔培养。在IL-4刺激前，用免疫标记法确证细胞表面的IgE受体(CD23)。
细胞活化细胞先用IL-4活化以诱导CD23，然后用含IgE的免疫复合物刺激3-5天，再回收各种上清液。氮衍生物用Griess分析，TNF分析采用购自Medgenix(Fleurus，比利时)的分析试剂盒。
2．结果银杏提取物对IL-4刺激的角质细胞和巨嗜细胞的作用将干银杏叶用乙酮-水混合物在真空下反复抽提，通过多次去除溶剂合叶绿素、脂类、蜡、植物血凝素和一些特定物质，然后得到一种称为H-37的提取物。
它以细粉末形式存在，规格如下-残留溶剂·乙醇＜3％·丙酮＜0.1％·丁醇＜0.1％·乙酸乙酯＜0.1％-硫酸盐灰分 ＜1.5％-水含量 ＜3％-原花色素 ＜5％-萜类 ＜0.5％-银杏酸 ＜10ppm-重金属 ＜20ppm-杂甙黄酮 32±3％它可在PEG400中溶解6％w/w，可在90％乙醇中溶解4％w/v。
细胞用10ng/ml的IL-4刺激48小时，以诱导其表面的IgE低亲合力受体(CD23)。培养期末，30-80％的角质细胞和巨嗜细胞表达CD23。个体变异不反映这些个体的变应状态的差别。不管什么情况，在诱导期，受试物不调节CD23的诱导。少于5％的降低观察不到(n=8)。
表1在10mg/ml H37存在下，IL-4刺激诱导不同细胞的CD23表达
*细胞在有或无10ng/ml IL-4以及有无不同的产物下刺激48小时，ND=未检测到。
CD23被IgE免疫复合物结合，诱导许多介质和细胞因子(尤其是TNF)以及氧代谢产物，如含氮衍生物产生。这种刺激在体外重建了变态反应型炎症反应。
获得的结果在以下两个表格作一总结。
表2AIgE免疫复合物±10mg/ml H37刺激后的氮衍生物产量(NO2-μM)
*括号中是未经IgE免疫复合物刺激的细胞的测值。
H37产品对IgE免疫复合物刺激的巨嗜细胞和角质细胞氮衍生物的产生有抑制作用。
表2BIgE免疫复合物±10mg/ml H37刺激后TNF(pg/ml)的产量
*括号中是未经IgE免疫复合物刺激的细胞的测值，ND=未测到。
H37产品轻微降低IgE免疫复合物刺激的巨嗜细胞和角质细胞TNF的产生。
因此看起来，H37有变态反应性抗炎活性。这个特征非常重要，因为炎症，尤其是变态反应性炎症的严重程度取决于这些细胞氧代谢不平衡程度。尤其是，这种不平衡决定了，至少部分决定了与这些反应相关的免疫现象的调节。对特定的变态反应和细胞因子的产生就是如此。
例二H37对同种异型混合淋巴上皮细胞培养(MLEC)(向T淋巴细胞呈递抗原)的作用研究混合淋巴上皮细胞培养(MLEC)的原理与混合淋巴细胞培养相同，唯一的区别是刺激细胞群是全上皮细胞(角质细胞，Langerhans细胞及其他细胞)。因为这种共培养使评价Langerhans细胞向T淋巴细胞呈递抗原的能力成为可能，它对于检测分子或强刺激调节皮肤免疫反应的能力尤其有用。
简言之，多批作为对照的全上皮细胞，和多批上皮细胞与淋巴细胞培养；在共培养时，用外源分子处理；然后上皮细胞诱导的淋巴细胞增生。用这个方法可以监测淋巴细胞上皮细胞共培养时，Langerhans细胞的免疫功能和外源分子对其的调节。
这个研究在同种异型(T淋巴细胞和上皮细胞来源于不同的供体)的情况下，用从乳房成形手术获得的新鲜全上皮细胞来进行的。
程序这个研究是用从2-3个不同供体的上皮细胞来完成的。
上皮细胞与同种异型的T淋巴细胞在96孔板共培养全上皮细胞的数目和T淋巴细胞相同(105上皮细胞-105T淋巴细胞)。
共培养共耗时6天，氚标胸苷在培养结束前18小时(第5天)掺入。
通过测定用氚标胸苷的掺入来测定淋巴细胞的增生(将培养板粉碎来进行放射性活性测定)。
在上皮细胞和同种异型T淋巴细胞共培养时，加入外源分子(提取物H37或环孢菌素)。
-用待测分子处理的样品通过少量逐渐增加(四倍终浓度)的待测分子溶液得到的含待测分子浓度逐渐增高的上皮细胞和同种异型T淋巴细胞的共培养物。对于可溶于水的H37，储存液用水配制，以此加入培养液；对于可溶于DMSO的环孢菌素，储存液用DMSO配制，然后用子液加入培养液。
在培养孔中有少量的DMSO(作为对照的DMSO和环孢菌素组中DMSO终浓度均为0.1％)。
阴性对照如下-未处理的单独T淋巴细胞(对照EC)-未处理的单独上皮细胞(对照PBMC)其它对照单独上皮细胞，用DMSO(环孢菌素的溶剂)处理；单独T淋巴细胞，用DMSO(环孢菌素的溶剂)处理；单独上皮细胞，用最高浓度的分子处理；单独T淋巴细胞，用最高浓度的分子处理；阳性对照如下-上皮细胞+同种异型T淋巴细胞(EC=对照PBMC)-上皮细胞+用0.1％的DMSO(环孢菌素的溶剂)处理的T淋巴细胞标准品为环孢菌素(Cyclo)106M。
产品H37用以下浓度10.03％20.01％30.001％40.0001％结果初步实验显示，H37产品，用到0.03％的浓度，对淋巴细胞和上皮细胞均未显示细胞毒性。
MLEC结果显示在附页的图中。
下面的符号代表PBMC 单独T淋巴细胞EC 单独全上皮细胞同种异型PBMC+EC全上皮细胞和T淋巴细胞结果以氚标胸苷掺入百分比(％)来表示。100％相当于EC+PBMC系统(全上皮细胞加同种异型血T淋巴细胞)无任何产品(对照)添加时氚标胸苷掺入的水平。
此处说明的实验显示的是，全上皮细胞存在时，T淋巴细胞增生(以氚标胸苷的掺入代替)。淋巴细胞增生的放大与所用的上皮细胞有关，它在每次实验中是不同的。这个诱导的增生代表了制备的全上皮细胞中Langerhans细胞向T淋巴细胞呈递抗原的能力。
环孢菌素，这个已知的免疫调节剂，抑制淋巴细胞增生(抑制70％)。
产品H37在浓度1(0.03％)和浓度2(0.01％)时在MLEC实验中，对淋巴细胞增生有明显的抑制作用。
这些结果显示，在体外MLEC实验证明，H37有免疫调节活性。
权利要求
1．至少一种可从银杏提取的活性成份在制备一种通过局部途径给药有免疫调节作用的组合物的应用。
2．权利要求1所述至少一种可从银杏提取的活性成份的应用，其特征在于该组合物目的是预防或治疗免疫依赖性的皮肤反应。
3．权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于活性成份以银杏叶提取物的形式存在于组合物中。
4．权利要求3所述的应用，其特征在于银杏提取物的萜类含量少于干重的3％w/w。
5．权利要求3和权利要求4所述的应用，其特征在于银杏提取物杂甙双黄酮的含量多于干重的24％w/w。
6．权利要求1到权利要求4所述的应用，其特征在于该组合物的目的是治疗或预防皮肤和粘膜的不耐受和/或变态反应。
7．权利要求1到权利要求6所述的应用，其特征在于该组合物的目的是治疗和预防以下疾病群的某一种状态特应性皮炎，白斑，牛皮癣，多形性红斑，神经性皮炎，干皮病，红斑痤疮，荨麻疹，天疱疮，红斑狼疮，皮炎，良性夏季光照性皮炎和湿疹，以及AIDS相关的皮肤表现。
8．权利要求7所述的应用，其特征在于银杏提取物在该组合物中的浓度在0.0001％到10％w/w之间。
9．权利要求3到权利要求8所述的应用，其特征在于银杏提取物在该组合物中的浓度在0.01％到2％w/w之间。
10．美容性治疗高反应性皮肤的方法，其特征在于经局部途径使用至少一种从银杏提取的活性成份。
11．权利要求10所述的方法，其特征在于用银杏提取物与皮肤可接受的赋形剂结合制成一种可通过局部途径给药的皮肤美容组合物。
全文摘要
该发明是关于从银杏提取物得到的最少一种活性成分来制备一种有免疫调节活性的组合物。该发明也关于敏感性皮肤的美容处理。
文档编号A61K8/97GK1211925SQ97192462
公开日1999年3月24日 申请日期1997年10月21日 优先权日1996年10月22日
发明者D·卡斯特利, L·弗里特奥, G·里斯 申请人:Roc公司