泛喹酮在治疗阿尔茨海默氏病中的用途的制作方法

专利名称：泛喹酮在治疗阿尔茨海默氏病中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及已知的化合物在生产用于治疗或预防阿尔茨海默氏病的药用组合物中的用途。本发明还涉及用于此治疗或预防的药用组合物。本发明也涉及治疗或预防阿尔茨海默氏病的方法。
背景技术：
在工业化社会中为引起成人痴呆的一个主要原因的阿尔茨海默氏病(AD)为退行性脑疾病，其临床特征在于记忆的进行性丧失、意识模糊、痴呆并最终导致死亡。阿尔茨海默氏病的组织病理学特征为在新大脑皮质特别是海马中存在两种脑损害即在神经元中配对的螺旋丝(PHF)的神经纤维缠结(NFTs)和细胞外间隙的神经(老年)斑。老年斑的形成与症状的出现和疾病的征兆有关，包括记忆缺失。老年斑形成后，在神经元体中产生神经纤维缠结。神经纤维缠结的形成与记忆缺失的恶化以及痴呆的其它症状的恶化有关。
老年斑的主要成分为淀粉状蛋白沉积物。白内障为常常与阿尔茨海默氏病同时发生的疾病。它可发生于眼中并且也是由淀粉状蛋白沉积物所引起。因此，本说明书和权利要求书中公开的对患有阿尔茨海默氏病的患者的治疗方法同样可以用于治疗白内障。因此，如本说明书和权利要求书中所用，术语阿尔茨海默氏病也包括白内障。
淀粉状蛋白沉积物的主要成分为在此称为Aβ(β淀粉状蛋白)的多肽。正常情况下，Aβ为脑脊液的可溶性成分，其浓度约为3-5nm。在成熟状态下，Aβ可具有39-43个氨基酸，一般为40个氨基酸，并且作为蛋白酶剪切产物由称为淀粉样前体蛋白(APP)的细胞表面蛋白衍生而来(Kang等，1987，Nature325733-736)。
许多研究表明当将Aβ直接加至神经元细胞培养物中时，它具有体外毒性(Yankner BA，Duffy LK，Kirschner DA，Science 1990，250(4978)279-282；Koh JY，Yang LL，Cotman CW，Brain Res 1990，533(2)315-320；和Pike CJ，Burdick D，Walencewicz AJ，Glabe CG，Cotman CW，J.Neurosci 1993，13(4)1676-1687)。
人们发现Aβ的神经毒性位于氨基酸残基25和35之间的肽序列(Aβ(25-35))中。Aβ(25-35)在诱导神经元细胞死亡时与全长的Aβ(1-40)同样有效(Yankner BA，Duffy LK，Kirschner DA，Science 1990，250(4978)279-282)。目前人们还不知道Aβ的正常功能，但是可能是形成跨细胞膜的阳离子选择性通道(Kawahara M.等，1997，BiophysicalJoumal 73/1，67-75)。
已经表明合成的Aβ的沉淀是由多种环境因素引起的，这些因素包括低的pH、高的盐浓度以及存在金属如锌、铜和汞(Bush，A.I.等，1995，Science 2681921-1923)。人们报道Aβ本身在摩尔比为1∶1(Zn∶Aβ)下可以以高亲和力(KD＝107nM)特异性并饱和地与锌结合(Bush，A.I.等，1994，J.Biol.Chem.26912152-12158)。该结合在锌的生理浓度下即可产生(Bush，A.I.等，1994，Science 2651464-1467)。
人们推想从患有阿尔茨海默氏病的患者中去除淀粉状蛋白沉积物可以缓解阿尔茨海默氏病的症状。因此，人们进行了多种努力来制备这类药物，因为人们急需治疗阿尔茨海默氏病的方法。
国际专利申请公布号WO93/10459公开了通过给予锌结合剂治疗阿尔茨海默氏病的方法。作为优选的化合物，介绍了植酸、去铁胺、柠檬酸钠、EDTA、1，2-二乙基-3-羟基-吡啶-4-酮和1-羟乙基-3-羟基-2-甲基-吡啶-4-酮。
德国专利申请号DE3932338公开了使用铝螯合剂如8-羟基-喹啉治疗阿尔茨海默氏病。
美国专利号5,373,021公开了双硫仑及其盐和类似物的用途。根据该专利，可以使用公开的化合物来减少由阿尔茨海默氏病引起的神经损害。
国际专利申请公布号WO98/06403公开氯碘羟喹在生产用于治疗阿尔茨海默氏病的药用组合物中的用途。
目前已知的用于治疗阿尔茨海默氏病的化合物具有数种缺点，由此阻碍了它们的广泛使用。大多数此类化合物不能透过血脑屏障，因此不能容易地到达淀粉状蛋白沉积的区域。可以透过血脑屏障的双硫仑具有这样的缺点，即当患者将其与乙醇混合时，它可以引起严重的副反应，包括头痛、恶心、呕吐、出汗、渴感、虚弱及低血压。氯碘羟喹(5-氯-7-碘代-8-羟基喹啉)也可以透过血脑屏障，具有受到指责的历史，因为它具有引起亚急性脊髓视神经病(SMON)的副作用。
到目前为止，人们一直使用泛喹酮(4，7-菲咯啉-5，6-二酮)治疗各种疾病，如阿米巴病。泛喹酮由CIBA-GEIGY以ENTOBEX的商标出售。与氯碘羟喹相反，当以正常的剂量范围使用泛喹酮时没有检测到副作用。
过去，含有氯碘羟喹和泛喹酮的抗阿米巴药的药用制剂一直由CIBA-GEIGY以Mexafor的商标出售。然而，当人们意识到氯碘羟喹可以引起SMON时，停止将该制剂投放市场。
发明公开本发明的目的为提供用已知化合物治疗或预防阿尔茨海默氏病的新用途。本发明的另一个目的为提供治疗阿尔茨海默氏病的增强作用。另一个目的为避免阿尔茨海默氏病治疗或预防中的任何有害的副作用。
根据本发明，我们提供泛喹酮在生产用于治疗或预防阿尔茨海默氏病的药用组合物中的用途。
可以将泛喹酮以治疗或预防阿尔茨海默氏病的有效量给药。优选将泛喹酮以5mg-250mg的量并最优选以10mg-50mg的量每日给药1-3次。
在本发明的一个实施方案中，将选自下列的一种化合物或几种化合物的混合物在给予泛喹酮之前、与泛喹酮一起或在给予泛喹酮之后给予抗氧剂、乙酰胆碱增强剂、痕量金属、辅基和氯碘羟喹。
本发明也涉及药用组合物，它含有泛喹酮和选自下列的一种化合物或几种化合物的混合物抗氧剂、乙酰胆碱增强剂、痕量金属、辅基和氯碘羟喹，前提为当选择氯碘羟喹时，则至少再从上述化合物中选择另一种化合物。
优选所述抗氧剂为维生素C、维生素E、Q10或它们的组合。优选乙酰胆碱增强剂为μl激动剂或抗胆碱酯酶抑制剂。优选的抗胆碱酯酶抑制剂为他克林(商标Cognex)和donepezil(商标Aricept)。优选所述辅基为维生素B12。
在本发明优选的实施方案中，使用泛喹酮和氯碘羟喹来生产用于治疗或预防阿尔茨海默氏病的药用组合物。优选用泛喹酮、氯碘羟喹和维生素B12的组合来生产所述药用组合物。
可以将所述药用组合物配制为供口服、胃肠外或经皮给药的组合物。而且，可以将所述药用制剂配制为单一的药用组合物或配制为两个或多个单独的剂型用于顺序或基本上同时给药。
本发明也涉及治疗患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括给予所述患者有效量的泛喹酮以治疗或预防阿尔茨海默氏病。
附图简介

图1描述泛喹酮对PC12细胞中的Aβ(25-35)剂量-反应的作用。
图2描述泛喹酮对PC12细胞中的Aβ(25-35)诱导的毒性的作用。
图3描述泛喹酮和氯碘羟喹对Zn2+诱导的Aβ聚集的作用。
图4描述氯碘羟喹和泛喹酮对Cu2+诱导的Aβ聚集的作用。
图5描述三种溶液的NMR光谱。溶液a含有维生素B12(羟钴氨素)，浓度为2.6mM。溶液b含有2.6mM维生素B12和10mM葡糖苷酸氯碘羟喹(摩尔比约为1∶4)。溶液c含有10mM葡糖苷酸氯碘羟喹。
图6描述图5扩展的右半边以易于比较共振的位置。
图7描述图5扩展的左半边以易于比较共振的位置。
发明详述市场上需要引入有效的治疗或预防阿尔茨海默氏病的药物。根据本发明，我们提出已知的药物泛喹酮。
在实施例中表明PC12细胞中的Aβ(25-35)对细胞的氧化还原活性具有显著的作用。在实施例2使用的方法中，接触1μM Aβ(25-35)的细胞的氧化还原活性减少至正常水平的60％(见图2，空心圆)。然而，用不低于1μg/ml的泛喹酮处理经Aβ(25-35)处理的细胞时，可以恢复正常的氧化还原活性。这表明当将泛喹酮给予哺乳动物如人时，它可以缓解Aβ的不良作用。
尽管我们不想将本发明限制于任何特定的作用机制，但是我们目前认为是泛喹酮的抗氧剂作用阻止了Aβ对细胞氧化还原活性的作用。
通过共同给予另外的抗氧剂如维生素C、维生素E、维生素Q10或它们的组合可以提高泛喹酮的抗氧剂作用。
细胞外间隙中老年斑的存在可以阻止或抑制胆碱能神经系统中脉冲的传递。神经系统的功能依赖于乙酰胆碱递质。因此，可以将增强乙酰胆碱水平的化合物如通过乙酰胆碱酯酶阻止或抑制乙酰胆碱正常水解的化合物即所谓的抗胆碱酯酶抑制剂与泛喹酮一起给予，以提高作用。优选的抗胆碱酯酶抑制剂为他克林和donepezil。
在实施例报道的研究中，已经表明泛喹酮可以减少由Cu2+和Zn2+诱导的Aβ(1-40)的聚集。
下列提出的本发明的作用机制不用于将本发明局限于该机制。目前，申请者认为泛喹酮和Aβ可以竞争性地与锌、铜和其它的重金属螯合。泛喹酮具有通过血脑屏障的能力。当泛喹酮在细胞外间隙捕获了重金属离子时，它可以进入血并从体内清除。由于Aβ或其盐的聚集，重金属离子与游离的Aβ和重金属离子处于平衡状态，所以只要存在聚集的Aβ(即淀粉状蛋白)，那么泛喹酮则可继续捕获游离的重金属离子并将重金属离子运至血液中。游离的Aβ可以通过被动扩散而不是通过正常存在于细胞外间隙的蛋白水解酶的降解作用透过血脑屏障。因此，游离的Aβ或其变性的部分在被消化为无毒性的程度前，它们可潜在地破坏神经元细胞。同时，由于泛喹酮的对抗Aβ正常产生的氧化还原活性的还原作用的能力，因此它可以阻止或抑制Aβ的潜在的细胞毒作用。
泛喹酮引起的聚集的降低对Cu2+为50-60％，对Zn2+为10％。可以进一步证明氯碘羟喹具有相反的趋向。氯碘羟喹可将Zn2+诱导的Aβ(1-40)的聚集降低60％以上，而将Cu2+诱导的聚集降低约30％。换句话说，泛喹酮降低Cu2+诱导的Aβ(1-40)聚集最好，而氯碘羟喹降低Zn2+诱导的聚集最好。
由于Cu2+和Zn2+天然存在于患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病的患者体内，因此需要减少或再溶解两种离子诱导的聚集。所以，最好在给予泛喹酮前、与泛喹酮一起或在给予泛喹酮之后给予氯碘羟喹。
然而，由于氯碘羟喹引起SMON的副作用，所以氯碘羟喹的给药也是个问题。先有的研究(见WO98/06403)表明氯碘羟喹可能对维生素B12具有影响。
人们已知氯碘羟喹由肾脏作为葡糖苷酸或磺酸酯衍生物排泄(Kotaki H.等Enterohepatic circulation of clioquinol in the rat，J.Pharmacobiodyn.1984年6月；7(6)420-5和Jurima M.等Metabolismof 14C-iodochlorhydroxyquinoline in the dog and the rat，J.Pharmacobiodyn.1984年3月；7(3)164-70)，如作为化合物(5-氯代-7-碘代-喹啉基-2’，3’，4’-三-O-乙酰基-吡喃葡糖苷)糖醛酸甲酯。为简化起见，在下文中将该化合物称为氯碘羟喹葡糖苷酸。
疏水性物质如氯碘羟喹的体内解毒作用主要发生于肝脏。因此，人们认为氯碘羟喹的清除按如下发生首先在肝脏中氯碘羟喹被转化为氯碘羟喹葡糖苷酸。形成氯碘羟喹葡糖苷酸后，水溶性的氯碘羟喹葡糖苷酸被分泌于胆汁中。胆汁进入肠，其中大部分的氯碘羟喹葡糖苷酸在粪便中被排泄。而一部分氯碘羟喹葡糖苷酸被从肠中再吸收进入血液。在肾脏中对血液中的氯碘羟喹葡糖苷酸进行过滤并在最终的尿中排出。
用氯碘羟喹对小鼠进行治疗并随后给予带有放射性同位素的维生素B12([57Co]-氰基钴氨素)，在国际专利申请公布号WO98/06403中表明在氯碘羟喹治疗的小鼠的脑和肝脏中维生素B12的浓度保持正常水平，而与正常水平相比这些小鼠肾脏中维生素B12同位素的浓度降低。而且，这些发现表明肾脏为靶器官，在肾脏中发生氯碘羟喹的依赖性代谢作用。
为研究氯碘羟喹葡糖苷酸和维生素B12之间的可能的相互作用，我们设计了一个试验，在该试验中将氯碘羟喹葡糖苷酸和维生素B12在水中混合。用1H NMR对该混合物进行分析。1H NMR光谱(见附图5-7)表明部分维生素B12的共振(相应于苯并咪唑部分)发生了位移，在氯碘羟喹葡糖苷酸的两个共振(相应于喹啉部分)中也观察到相同的现象。因此申请者认为使用游离的氯碘羟喹预期可获得相似的结果，但是不能将氯碘羟喹溶于水溶液中进行NMR检测。
结果表明氯碘羟喹葡糖苷酸和维生素B12之间的疏水相互作用可能是由于维生素B12的苯并咪唑部分和氯碘羟喹葡糖苷酸的喹啉部分之间的相互作用。
一般维生素B12是在过滤后从肾脏血浆中进行主动再吸收。以此方式机体可以回收大部分的维生素B12，否则将在尿中丢失。最近已有人证明维生素B12的再吸收是由膜蛋白megalin的作用所介导(Moestrup S.K.等Proc.Natl.Acad.Sci.1996；93(16)8612-7)。已经证明meglin对由维生素B12和转运蛋白钴胺传递蛋白形成的复合物的结合具有强的亲和力。
基于在此报道的新发现即维生素B12可以与氯碘羟喹葡糖苷酸结合，人们认为当维生素B12已经与氯碘羟喹葡糖苷酸结合后，它不能与megalin蛋白和/或钴胺传递蛋白结合。因此不能进行维生素B12的再吸收，所以一段时间后如果不通过正常饮食途径给机体提供足量的新维生素B12的话，则机体将患有维生素B12缺乏症。
由于人不能合成维生素B12，所以人的维生素B12的唯一来源为食物。由此，很明显低肉和/或微生物含量的饮食会引起维生素B12缺乏。如果给人提供过低维生素B12含量的饮食，那么由于氯碘羟喹与megalin的竞争性结合作用阻止了维生素B12的再吸收，给予氯碘羟喹将使该状况更加恶化。SMON仅在日本观察到而且日本人的饮食主要由蔬菜和谷类食物(特别是米饭)组成(KromhoutD等“Foodconsumption pattern in the 1960s in seven countries”，Am.J.Clin.Nutr.49889-894，1989)这一事实解释了SMON疾病局限于日本的原因。
为了对抗泛喹酮和/或氯碘羟喹给药的副作用，需要共同给予痕量金属和/或辅基。优选的辅基为维生素B12(氰基钴氨素)。
通过下列非限定性实施例说明，本发明的组合物、组合物的用途以及本发明的方法适用于1)诊断为患有阿尔茨海默氏病的任何临床阶段的患者，2)在早期或前驱症状或迹象的患者中预防阿尔茨海默氏病，和3)延缓阿尔茨海默氏病症状和迹象的出现或发展或恶化。因此，本发明的方法和组合物可以用于如治疗阿尔茨海默氏病、改善或缓解阿尔茨海默氏病的症状和迹象、改善阿尔茨海默氏病的任何病理或实验室结果、延缓阿尔茨海默氏病的发展、延缓任何阿尔茨海默氏病症状和迹象的出现、预防阿尔茨海默氏病的发生，以及预防阿尔茨海默氏病或帕金森病的任何症状和迹象的出现。
受试者或患者可以为动物，如哺乳动物，但优选为人，可以为胎儿、儿重或成人。
可以由医师根据常规试验来决定再溶解Aβ的泛喹酮的最佳体内剂量。此类试验的一个实例为监测脑脊液(CSF)中可溶性的Aβ的量(WO 93/10459,1993年5月27日，University of Melbourne)。由相对低的剂量(10-25mg/天)开始，医师可以监测患者CSF中溶解的Aβ的量。如果为锌-Aβ聚集物再溶解指标的溶解的Aβ没有相应于给予泛喹酮而增加，则可以提高泛喹酮的剂量至观察到溶解的Aβ增加为止。另一个实例为通过临床、行为以及心理测量观察和测定来监测疾病的临床迹象和症状。
在给予人类药物前，最好在动物模型中证明该药物的效能。可以使用本领域已知的任何阿尔茨海默氏病的动物模型。
根据本发明的药用组合物最好含有一种或多种药学上可接受的载体和活性组分。所述载体在与该组合物的其它组分相配伍并对接受者无害的意义上必须是“可接受的”。在优选的实施方案中，将药用组合物中的泛喹酮和任选的另外的活性组分进行纯化。
可以理解所需的用于所述治疗或预防的泛喹酮和任选的另外的活性组分的量随下列因素而变化给药途径，所治疗的疾病，受试者的身体状况、年龄、病史以及所述药用组合物的盖仑制剂等。当对诊断患有阿尔茨海默氏病的患者进行治疗时，泛喹酮的量最好为增加该患者脑脊液中Aβ-聚集物溶解性的有效量。
一般而言，所述药用组合物中泛喹酮的适当的治疗有效量为如5-250mg、优选10-50mg。选自抗氧剂、μl激动剂、抗胆碱酯酶抑制剂、痕量金属、辅基和氯碘羟喹的化合物或这些化合物的混合物在所述药用组合物中的适当量为如5μg-250mg、优选0.5-1mg。如果选择氯碘羟喹和维生素B12，那么氯碘羟喹的量最好为治疗或预防阿尔茨海默氏病的有效量，而维生素B12的量最好为抑制给予氯碘羟喹的有害负作用的有效量。氯碘羟喹和维生素B12的量分别为优选5mg-250mg、最优选10mg-50mg和5μg-2mg，最优选0.5mg-1mg。
实际给予的泛喹酮和任选的另外的活性组分如氯碘羟喹和维生素B12的量可以由监护医师决定。如果除泛喹酮外该药用组合物还含有另外的活性组分，那么它们可以在同一组合物中用于同时给药，或者在不同的组合物中用于基本同时但单独或顺序给药。
治疗用制剂包括那些适于胃肠外(包括肌内和静脉)、经口、直肠或透皮给药的制剂，尽管经口给药为优选的途径。因此，可以将所述药用组合物配制为片剂、丸剂、糖浆剂、胶囊剂、栓剂、透皮使用的制剂、粉剂(特别是用于静脉注射的、用载体复制的冻干粉剂)等。
所述术语“载体”指与治疗剂一起给予的稀释剂、辅助剂、赋形剂或溶媒。所述药用组合物中的载体可以包括粘合剂如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvidone或povidone(聚维酮))、黄蓍树胶、明胶、淀粉、乳糖或乳糖一水合物；崩解剂如藻酸、玉米淀粉等；润滑剂或表面活性剂如硬脂酸镁或十二烷基硫酸钠；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；和/或矫味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙矫味剂。
适合经口给药的治疗用制剂如片剂和丸剂可以通过压片或模塑获得，任选含有一种或多种辅助组分。通过将组分混合并将该混合物在适当的设备上压制为具有一定大小的片剂来制备压制片剂。在混合前，可将泛喹酮与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或崩解剂混合并将另外任选存在的其它组分与稀释剂、润滑剂和/或表面活性剂混合。
在优选的实施方案中，将自由流动的泛喹酮粉与粘合剂(如微晶纤维素)和表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)混合至获得均一的混合物。随后，在搅拌下将另一种粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮转移至该混合物中。达到均匀分布后，在恒定搅拌下加入维生素B12的水溶液。使该混合物通过制粒筛并脱水干燥，然后在标准的压片设备上压制为片剂。
在第二个优选的实施方案中，将自由流动的泛喹酮粉与表面活性剂和/或乳化剂如Sapamine(N-(4’-硬脂酰氨基苯基)-三甲基铵甲基硫酸)和乳糖一水合物混合至达到各种组分均匀分布。将含有崩解剂如玉米淀粉的第二种制备物在连续搅拌下加至泛喹酮混合物中。通过将过量沸腾的水加至悬浮于冷水中的玉米淀粉中制备该第二种制备物。如上对最终混合物进行制粒和干燥，并与玉米淀粉和硬脂酸镁混合，最后在标准设备上压制为片剂。
可以对片剂进行包衣或不进行包衣。不包衣的片剂可以为刻痕片。包衣片剂可以用糖、紫胶、膜或其它肠包衣剂包衣。
适合胃肠外给药的治疗制剂包括所述活性组分的无菌溶液或悬浮液。可以使用水性或油性载体。此类药用载体可以为无菌液体如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。胃肠外给药的制剂也包括含有泛喹酮和任选的另外的活性组分的冻干粉剂，可以将该冻干粉剂溶于溶解所述活性组分的药学上可接受的载体(如羧甲基纤维素和十二烷基硫酸钠的水溶液)中进行复制。
当所述药用组合物为胶囊剂时，它可以含有液体载体如脂肪油如可可脂。
适当的药用赋形剂包括淀粉、葡葡糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇(propylene，glycol)、水、乙醇等。这些组合物可以为溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、延释制剂等。用常规的粘合剂和载体如甘油三酯可以将所述组合物配制为栓剂。
在另一个实施方案中，可以用控释系统来传递治疗用化合物。在一个实施方案中，可以使用泵(见Langer，上文； Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等，Surgery 88507(1980)；Saudek等N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(见Medical Applicatins of Controlled Release，Langer and Wise(编辑)，CRC Pres，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen and Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；也见Levy等，Science 228190(1985)；During等，Ann.neurol.25351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71105(1989))。在另一个实施方案中，可以将控释系统置于治疗剂靶即中枢神经系统附近，如此仅需要全身给药剂量的一部分(如见Goodson，Medical Applications of ControlledRelease，上文，第2卷，第115-138页(1984))。
在Langer的综述中讨论了其它的控释系统(Science 2491527-1533(1990))。
在本发明药用组合物的一个实施方案中，将泛喹酮和另外的活性组分配制为独立的药用制剂。例如，一种制剂可以含有泛喹酮和氯碘羟喹，而另一种制剂可以含有维生素B12。可以将两种制剂同时或顺序给药。如可以先给予含有泛喹酮和氯碘羟喹的制剂，然后在给予氯碘羟喹和泛喹酮一天、一周或一月内给予维生素B12。如果将两种制剂顺序给予，那么最好将含有泛喹酮和氯碘羟喹的制剂给药1-3周后有一个1-4周的清除期，在此期间给予含有维生素B12的制剂，但是不给予含有氯碘羟喹的制剂。清除期后，重复所述治疗。
本发明也提供含有一个或多个容器的药盒或试剂盒，所述容器内含有一种或多种本发明药用组合物的组分。此类容器内任选带有由调节生产、药品或生物学产品的使用或销售的管理机构描述的通知，该通知反映了所述机构对人类用药的生产、使用或销售的许可。
结合下面的实施例和通过实例说明本发明原理的附图，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
实施例实施例1泛喹酮对PC12细胞中Aβ(25-35)剂量-反应的作用Aβ(25-35)由Bachem(CH)或Sigma(USA)提供，在使用前2小时，将其溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中。Aβ的神经毒性位于氨基酸的残基25和35之间序列(Aβ(25-35))，含有该区域的十肽在诱导神经细胞死亡方面与全长的Aβ(1-40)同样有效(Yankner，DuffyLK，Kirschner DANeurotrophic and neurotoxic effects of amyloid βproteinreversal by tachykinin neuropeptides.Science 1990；250(4978)279-282)。
使大鼠PC12嗜铬细胞瘤细胞在含有下列物质的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中于5％CO2调湿培养箱中生长1％青霉素-链霉素、5％胎牛血清和10％马血清。
将PC12细胞接种于含有100μl合适培养基的96孔微量滴定板中。24小时后，单独或与指定浓度的泛喹酮一起加入指定浓度的Aβ(25-35)肽。继续孵育24小时。孵育后，根据生产商(BoehringerMannheim)的指示，用通用可行的测定方法测定MTT还原。将单独使用溶媒获得的测定值定义为100％。
MTT为细胞内和浆膜(plasma membrane)氧化还原酶的作用底物，并被广泛用于测定细胞氧化还原活性的还原作用。人们发现该细胞氧化还原活性的还原作用为Aβ介导的细胞死亡的早期指标(Shearman MS，Ragan CI，Iversen LLInhibition of PC12 cell redoxactivity is a specific，early indicator of the mechanism of β-amyloid-mediated cell death，Proc.Naatl.Acad.Sci.USA 1994；91(4)1470-1474)。
为检测泛喹酮对Aβ(25-35)诱导的PC12细胞毒性的作用，使PC12细胞与浓度为0-10μM的Aβ(25-35)肽接触。当泛喹酮不存在(即仅加入溶媒)时，Aβ(25-35)对MTT还原产生剂量依赖性抑制作用(附图1，实心圆)。低至0.01μM的Aβ(25-35)浓度即可产生显著的降低作用，Aβ(25-35)浓度在0.1μM或以上时，MTT还原最大可减少约50％。
在每ml 10μg泛喹酮存在下，Aβ(25-35)的毒性作用实际上消除(图1，空心圆)。即使在Aβ浓度高至1μM时，泛喹酮的存在也可完全对抗Aβ的毒性作用。只有在Aβ的最高浓度(10μM)下，Aβ才对MTT还原产生轻微的抑制作用。然而，该抑制作用为中等的，与不存在泛喹酮(约50％)相比仅为约10％。
实施例2泛喹酮对Aβ(25-35)诱导的在PC12细胞中的毒性的作用在该研究中使用与实施例1相同的物质和方法，但是使PC12细胞与1μM的固定浓度的Aβ接触，而且泛喹酮的浓度在0-10μg/ml之间变化。不存在泛喹酮时，Aβ(25-35)对MTT还原产生约40％的抑制(图，空心圆)。在每ml中含有高达0.1μg泛喹酮下仍维持该抑制作用。将泛喹酮的浓度增加至0.1μg/ml以上时对Aβ(25-35)的毒性作用产生显著性降低。泛喹酮的浓度为0.1μg/ml和以上时，Aβ(25-35)的毒性作用完全消除。
实施例3泛喹酮和氯碘羟喹对Zn2+和Cu2+诱导的Aβ聚集的作用在每次试验前，将冻干的肽溶于0.01MHCl中，随后用0.01MNaOH以1∶1稀释得到中性pH来新制备5mg/ml的Aβ(1-40)(由Bachem(CH)提供)储备液。将各等份Aβ(1-40)用PBS(pH7.4)稀释为100μM并以总体积为30μl、于室温下孵育24小时。共孵育试验时，加入指定浓度的金属离子和/或各等份受试化合物。加入受试化合物至最终摩尔浓度为10μg/ml。
通过硫黄素T荧光测定对淀粉状蛋白的形成进行定量。硫黄素可以特异性地与淀粉状蛋白结合，这使得其发射光谱产生位移，而荧光信号与淀粉状蛋白形成的量成比例。孵育后，将Aβ(1-40)肽加至PBS(pH6.0)和3μM硫黄素T中，最终体积为1ml。用Fluoroscan II荧光计(Molecular devices，UK)于454nm激发和482nm发射下检测荧光。进行荧光时间扫描，在衰变达到平台(约5分钟)后减去3μM硫黄素T的背景荧光，计算三个值的平均值。共孵育试验时，测定单独的受试化合物的荧光。样品以一式三份进行。在图(图3和4)中示出典型试验的平均值±SD。
测定泛喹酮和氯碘羟喹阻止Aβ(1-40)聚集为淀粉状蛋白结构的能力。已知氯碘羟喹为治疗阿尔茨海默氏病的化合物(见国际公布号WO98/06403)，在该试验中对该化合物进行原始测定以用于对比。
研究了所述两种化合物是否对金属离子催化的Aβ聚集，特别是由Zn2+和Cu2+引起的聚集具有作用。试验结果示于图3和图4中。
从图3和图4中可以看出，相对于自发聚集，Cu2+和Zn2+在较小程度上可以增加Aβ聚集为淀粉状蛋白结构。在10μg/ml浓度的泛喹酮和氯碘羟喹存在下，金属离子诱导的Aβ聚集显著降低。
在10μg/ml受试浓度的泛喹酮存在下，Cu2+诱导的聚集可降低50-60％，而Zn2+诱导的聚集仅适度地被抑制约10％。出人意料地是氯碘羟喹显示相反的倾向。氯碘羟喹对Zn2+诱导的Aβ(1-40)聚集降低60％以上，而对Cu2+催化的聚集约降低30％。因此，含有泛喹酮和氯碘羟喹的药用组合物比仅含有一种化合物的药用组合物具有更广泛的用途。
实施例4在该实施例中，合成氯碘羟喹代谢物。
人们已知氯碘羟喹可以作为氯碘羟喹的葡糖苷酸衍生物由肾脏排泄(Kotaki H.等“Enterohepatic circulation of clioquinolin the rat”，J.Pharmacobiodyn.1984年6月；7(6)420-5和Jurima M.等“Metabolism of 14C-iodochlorhydroxyquinoline in the dog and therat”，J.Pharmacobiodyn.1984年3月；7(3)164-70)。人们设想氯碘羟喹向相应的葡糖苷酸的转化在肝脏发生。氯碘羟喹葡糖苷酸在肝脏形成后，它最终被转移至肾脏随尿排泄。
根据下列反应流程制备氯碘羟喹的葡糖苷酸衍生物(5-氯代-7-碘代-喹啉基-2’，3’，4’-三-O-乙酰基-吡喃葡糖苷)糖醛酸甲酯

于室温下，将5-氯代-8-羟基-7-碘代-喹啉(50mg，0.164mmol)、1-溴代-1-脱氧-2，3，4-三-O-乙酰基-D-吡喃葡糖苷糖醛酸甲酯(65mg，0.164mmol)、硫酸钙一水合物(35mg)和吡啶(1.5ml)搅拌20分钟。向该反应混合物中加入新制备的碳酸银(35mg)，于室温下将悬浮溶液在暗处搅拌20小时。随后用1N氢氧化钠水溶液对反应产物进行脱乙酰化。
用二氯甲烷(10ml)稀释该反应混合物，过滤并减压蒸发溶剂。将上述产物经快速层析(TLC二氯甲烷/甲醇99/1，洗脱剂二氯甲烷/甲醇99.5/0.5)纯化。
NMR(400MHz，CDCl3)2.04(s，3H，Ac)，2.09(s，3H，Ac)，2.13(s，3H，Ac)，3.68(s，3H，Me)，3.99(d，1H，5’-H)，5.40-5.52(m，3H，2’，3’，4’-H)，6.29(d，1H，1’-H)，7.56(m，1H，3-H)，7.99(s，1H，6-H)，8.52(d，1H，4-H)，8.93(s，1H，2-H)。
该化合物在下面称为氯碘羟喹葡糖苷酸。
实施例5用核磁共振(NMR)光谱研究维生素B12与实施例4制备的氯碘羟喹葡糖苷酸的相互作用。
由于氯碘羟喹葡糖苷酸可溶于水，因此该研究在pH为6.5的缓冲水溶液中进行。制备三种不同的溶液，于20℃，在DRX400MHz光谱仪上记录它们的1HNMR光谱。溶液a)含有浓度为2.6mM的游离的维生素B12(羟基钴氨素)。溶液b)含有2.6mM维生素B12和10mM氯碘羟喹葡糖苷酸混合物(摩尔比约为1∶4)。溶液c)含有10mM氯碘羟喹葡糖苷酸。
在图5中，表示三种溶液光谱的芳族区域(5.5-9.8ppm)。它们之间的差异非常小，但是分别在扩展的图6和图7中很明显。维生素B12的部分共振(相应于苯并咪唑部分)产生了位移(见图6)，氯碘羟喹葡糖苷酸的两个共振(相应于喹啉部分)也观察到相同的现象(见图7)。
结果显示氯碘羟喹葡糖苷酸和维生素B12之间产生了相互作用，可能是由于维生素B12的苯并咪唑部分和氯碘羟喹葡糖苷酸的喹啉部分之间的疏水性质。
人们认为维生素B12与氯碘羟喹葡糖苷酸的疏水性结合是引起维生素B12与氯碘羟喹葡糖苷酸一起从体内排泄的原因，因此阻止了维生素B12的再吸收，最终导致维生素B12缺乏。所以，人们认为维生素B12缺乏至少在一定程度上是引起SMON的原因。从而，当给予氯碘羟喹时，应该保证所治疗的受试者中存在一定水平的维生素B12以避免其缺乏。这可以通过将氯碘羟喹与维生素B12共同给予完成。
实施例6制备含有泛喹酮的药用组合物将250g泛喹酮与200g sapamine(N-(4’-硬脂酰氨基-苯基)-三甲基铵甲基硫酸)以及1025g乳糖一水合物混合5分钟。向100g玉米淀粉和100g冷水的混合物中一次性加入300g沸腾的水。在连续搅拌下，将冷却至40℃的玉米悬浮液加至含有泛喹酮的粉末混合物中。用2.5mm筛对该混合物进行制粒并于40℃干燥18小时。将干燥的颗粒与400g玉米淀粉和20g硬脂酸镁混合。将最终的混合物配制为直径为8.0mm、重量为200mg的片剂。
实施例7制备含有泛喹酮、氯碘羟喹和维生素B12的药用组合物将250g泛喹酮和250g氯碘羟喹与200g sapamine(N-(4’-硬脂酰氨基-苯基)-三甲基铵甲基硫酸)以及1025g乳糖一水合物混合5分钟。向100g玉米淀粉和100g冷水的混合物中一次性加入300g沸腾的水。在连续搅拌下，将冷却至40℃的玉米悬浮液加至含有泛喹酮和氯碘羟喹的粉末混合物中。接着加入5g维生素B12的水溶液。用2.5mm筛对该混合物进行制粒并于40℃干燥18小时。将干燥的颗粒与400g玉米淀粉和20g硬脂酸镁混合。将最终的混合物配制为直径为8.0mm、重量为200mg的片剂。
在此引用的各种公开物，其公开内容通过引用作参考。
由此描述了本发明，很明显可以以各种方式对其进行改变。我们认为此类改变不偏离本发明的宗旨和范围，所有对本领域技术人员而言显而易见的修改均包括在下列权利要求书的范围内。
权利要求
1.泛喹酮在生产治疗或预防阿尔茨海默氏病的药用组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中将泛喹酮以5mg-250mg的量每日给药1-3次。
3.权利要求1或2中任何一项的用途，其中将泛喹酮以10mg-50mg的量每日给药1-3次。
4.权利要求1-3中任何一项的用途，其中将选自下列的一种化合物或几种化合物的混合物在给予泛喹酮之前、与泛喹酮一起或在给予泛喹酮之后给予抗氧剂、乙酰胆碱增强剂、痕量金属、辅基和氯碘羟喹。
5.泛喹酮和选自下列的一种化合物或几种化合物的混合物在生产治疗或预防阿尔茨海默氏病的药用组合物中的用途抗氧剂、乙酰胆碱增强剂、痕量金属、辅基和氯碘羟喹。
6.含有泛喹酮和选自下列的一种化合物或几种化合物的混合物的药用组合物抗氧剂、乙酰胆碱增强剂、痕量金属、辅基和氯碘羟喹，前提为当选择氯碘羟喹时，则至少再从上述化合物中选择另一种化合物。
7.权利要求4或5的用途或权利要求6的药用组合物，其中所述抗氧剂为维生素C、维生素E、Q10或它们的组合。
8.权利要求4、5或7的用途或权利要求6或7的药用组合物，其中所述乙酰胆碱增强剂为donepezil。
9.权利要求4、5、7或8的用途或权利要求6-8中任何一项的药用组合物，其中所述乙酰胆碱增强剂为他克林。
10.权利要求4、5、7、8或9的用途或权利要求6-9中任何一项的药用组合物，其中所述乙酰胆碱增强剂为维生素B12。
11.权利要求4或5，或权利要求7-10中任何一项的用途，其中使用泛喹酮和氯碘羟喹来生产药用组合物。
12.权利要求4或5，或权利要求7-11中任何一项的用途，其中使用泛喹酮、氯碘羟喹和维生素B12来生产药用组合物。
13.权利要求6-10中任何一项的药用组合物，它含有泛喹酮、氯碘羟喹和维生素B12。
14.权利要求1-5和权利要求7-13中任何一项的用途或权利要求6-10中任何一项或权利要求13的药用组合物，其中将所述药用组合物配制为经口、胃肠外或经皮给药的组合物。
15.权利要求1-5和权利要求7-13中任何一项的用途或权利要求6-10中任何一项或权利要求13的药用组合物，其中将所述药用组合物配制为单一药用组合物。
16.权利要求4或5或权利要求7-11中任何一项的用途或权利要求6-11中任何一项或权利要求13的药用组合物，其中将所述药用组合物配制为两个或多个独立的药用剂型供顺序给药或基本上同时给药。
17.治疗患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括给予所述患者有效量的泛喹酮以治疗或预防阿尔茨海默氏病。
18.治疗患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括给予所述患者有效量的泛喹酮以增加β-淀粉状蛋白(Aβ)在所述患者的脑脊液中的溶解性。
19.治疗患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括给予所述患者(a)有效量的泛喹酮以治疗或预防阿尔茨海默氏病，和(b)一定量的选自下列的一种化合物或几种化合物的混合物抗氧剂、乙酰胆碱增强剂、痕量金属、辅基和氯碘羟喹。
20.权利要求19的方法，其中(b)中的化合物的总量足以增加预防或治疗阿尔茨海默氏病的作用或抑制任何有害的负作用。
21.权利要求19的方法，其中所述(b)中的化合物的量为5μg-250mg。
22.权利要求19的方法，其中所述抗氧剂选自维生素C、维生素E、Q10或它们的组合。
23.权利要求19的方法，其中所述乙酰胆碱增强剂为他克林。
24.权利要求19的方法，其中所述乙酰胆碱增强剂为donepezil。
25.权利要求19的方法，其中所述辅基为维生素B12。
26.治疗患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病的方法，包括给予所述患者(a)有效量的泛喹酮以治疗或预防阿尔茨海默氏病，和(b)氯碘羟喹和维生素B12的混合物，有效量的氯碘羟喹以治疗或预防阿尔茨海默氏病和有效量的维生素B12以抑制给予氯碘羟喹的有害的负作用。
27.权利要求26的方法，其中氯碘羟喹的量为5mg-250mg。
28.权利要求26的方法，其中氯碘羟喹的量为10mg-50mg。
29.权利要求26的方法，其中维生素B12的量为5μg-2mg。
30.权利要求26的方法，其中维生素B12的量为0.5mg-1mg。
31.权利要求19或26的方法，其中(a)泛喹酮和(b)所述化合物包含于单一药用组合物中。
32.权利要求19的方法，其中将(a)泛喹酮和(b)所述化合物基本上同时给予。
33.权利要求19的方法，其中将(a)泛喹酮和(b)所述化合物顺序给予。
34.权利要求26的方法，其中将氯碘羟喹和维生素B12顺序给予，将泛喹酮与氯碘羟喹、维生素B12一起给予或单独给予。
35.权利要求26的方法，其中将氯碘羟喹在第一阶段给予、随后在第二阶段给予维生素B12，将泛喹酮与氯碘羟喹、维生素B12一起给予或单独给予。
36.权利要求35的方法，其中所述第一阶段为1-3周，第二阶段为1-4周。
37.权利要求17-36中任何一项的方法，其中所述患者为人。
38.权利要求17的方法，其中给予泛喹酮多至10年。
39.权利要求17、19或26的方法，其中将泛喹酮配制为经口给药。
40.权利要求17、19或26的方法，其中将泛喹酮配制为胃肠外给药。
41.权利要求17、19或26的方法，其中将泛喹酮配制为经皮给药。
42.药用组合物，包括(a)治疗或预防阿尔茨海默氏病有效量的泛喹酮和(b)选自下列的一种化合物或几种化合物的混合物抗氧剂、乙酰胆碱增强剂、痕量金属、辅基和氯碘羟喹，前提是当选择氯碘羟喹时，则至少再从上述化合物中选择另一种化合物。
43.权利要求42的药用组合物，其中(b)中的化合物的总量足以增加治疗阿尔茨海默氏病的作用或抑制任何有害的负作用。
44.权利要求42的药用组合物，其中所述(b)化合物的量为5μg-250mg。
45.权利要求42的药用组合物，其中所述抗氧剂选自维生素C、维生素E、Q10或它们的组合。
46.权利要求42的药用组合物，其中所述乙酰胆碱增强剂为他克林。
47.权利要求42的药用组合物，其中所述乙酰胆碱增强剂为donepezil。
48.权利要求42的药用组合物，其中所述辅基为维生素B12。
49.药用组合物，它包括(a)治疗或预防阿尔茨海默氏病的有效量的泛喹酮和(b)氯碘羟喹和维生素B12的混合物。
50.权利要求42或49中任何一项的药用组合物，它还包括药学上可接受的载体。
51.权利要求42、49或50中任何一项的药用组合物，其中泛喹酮的量为5-250mg。
52.权利要求42、49或50中任何一项的药用组合物，其中泛喹酮的量为10mg-50mg。
53.权利要求42、49或50中任何一项的药用组合物，它包括提高对阿尔茨海默氏病治疗或预防有效量的氯碘羟喹。
54.权利要求42、49或50中任何一项的药用组合物，它包括抑制给予氯碘羟喹有害的负作用的有效量的维生素B12。
55.权利要求42、49或50中任何一项的药用组合物，其中氯碘羟喹的量为5mg-250mg。
56.权利要求42、49或50中任何一项的药用组合物，其中氯碘羟喹的量为10mg-50mg。
57.权利要求49或50的药用组合物，其中维生素B12的量为5μg-2mg。
58.权利要求49或50的药用组合物，其中维生素B12的量为0.5mg-1mg。
59.权利要求42、49或50的药用组合物，其中将所述组合物配制为胃肠外给药的组合物。
60.权利要求42、49或50的药用组合物，其中将所述组合物配制为经皮给药的组合物。
61.权利要求42、49或50的药用组合物，其中将所述组合物配制为经口给药的组合物。
62.权利要求42、49或50的药用组合物，其中将所述组合物配制为片剂。
63.权利要求42、49或50的药用组合物，其中将氯碘羟喹和维生素B12配制为单独的药物剂型，将泛喹酮与氯碘羟喹、维生素B12一起配制或单独配制。
64.试剂盒，它在一个或多个容器中含有治疗或预防阿尔茨海默氏病有效量的泛喹酮和氯碘羟喹以及抑制给予氯碘羟喹的有害的负作用的有效量的维生素B12。
全文摘要
公开泛喹酮在生产预防或治疗阿尔茨海默氏病的药用组合物中的用途。也公开治疗或预防阿尔茨海默氏病的方法。
文档编号A61K31/714GK1267218SQ98808292
公开日2000年9月20日 申请日期1998年7月17日 优先权日1997年8月21日
发明者M·希利纳斯, P·N·格罗利马托斯 申请人:P·N·杰罗里马托斯有限公司