专利名称：生长激素释放肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生长激素释放肽及其在抗衰老、促进机体生长、促进创伤愈合和治疗垂体功能低下方面中的应用。
生长激素(Growth hormone,GH)是由垂体前叶分泌的一种单链多肽，具有重要的生理学功能。由于动物体内的生长激素对人类无活性，临床上曾微量使用的生长激素均是从人尸体中提取得到的，材料来源极其困难。后来，人们通过体内给予生长激素释放激素(Growth hormone releasing hormone,GHRP)促进生长激素释放来代替直接给予生长激素，但生长激素释放激素是一个具有44个氨基酸的大分子，也不宜长期使用。自1992年以来，国外，主要是美欧国家科学家采用基因工程方法生产重组的GH。我国也将基因工程方法生产GH作为国家“863”计划重点项目加以资助。目前，国内外用基因工程方法生产的GH均已进入临床研究阶段，但基因工程方法生产的GH存在如下不足首先是GH氨基酸的结构改变后，易于引起机体产生免疫识别；其次是产品价格太高，患者难以承受；第三是需注射给药，长期使用，患者不易接受。1984年，Bowers等对Dynorphin进行了改造，偶然发现这种改造后的物质能使血中生长激素浓度增加(BowersCY.Momany FA.Reynolds G.Hong A 1984,On the in vitro and in vivo activity of a new synthetic hexapeptidethat acts on the pituitary to specifically releasing growth hormone.Endocriniligy,114:1537-1545)，但当时Bowers等并未给予应有的重视。在此基础上，近几年相继发现数种能促进生长激素释放的结构，但这些结构对促进生长激素的释放作用均没能超过Bowers等报道的结果(P.M.Conn and Bowers CY.Science,273,923-924)。1992-1995年间，Patchett等发现两种椐称具有潜力的生长激素释放肽(Patchett et al Design and biological activities of L-163,191(MK-0677):apotent,orall active growth hormone secretagogues.Proc.Natl Sci USA.92:7001-7005,1995,Barry J et al Growth hormone response in man to L-692,429,a novelnonpeptide mimic of growth hormone-releasing peptide-6,J Clinical Endocrinol.And Metablim.77:1393-1397,1993)。并将他们试用于促进机体生长的应用研究。1996年，GHRP特异性受体也相继被发现，该受体是完全不同于垂体前叶somatotropes上的GH受体，亦不是生长抑素受体。这种新受体不但存在于somatotropes上，也存在于下丘脑GHRH能神经元上。GHRP不但能直接刺激垂体前叶生长激素细胞来促进GH的合成与释放，亦可通过刺激下丘脑GHRH神经元来促进GHRH的合成与释放，从而间接作用于垂体前叶，促进GH的合成与释放(P.M.Conn and Bowers CY.Science,273,923-924)。
本发明的一个目的是提供一类新的生长激素释放肽。
本发明的另一个目的是提供本发明的新的生长激素释放肽在抗衰老、促进机体生长、促进创伤愈合及治疗垂体功能低下中的应用。
为实现上述目的，几乎与国外研究同步，我们对现有技术GHRP的结构进行了大规模的改造，合成了一系列新的生长激素释放肽，并以文献报告的结构作对照，对这些生长激素释放肽进行了系统的药效学研究，发现一些结构不但具有文献报告的促进机体生长的作用，还具有肯定的抗衰老和促进创伤愈合等作用。
本发明的生长激素释放肽具有下式的结构，aa1-D-Trp-aa3-aa4-D-Phe-aa6-NH2其中，aa1代表His或Trp,aa3代表Ala或Gly,aa4代表His或Trp,aa6代表Lys或Arg。
优选aa1为D-His或D-Trp,aa3为D-Ala或D-Gly,aa4为D-His或D-Trp,aa6为D-Lys或D-Arg。
本发明的生长激素释放肽可用合成仪自动合成、手工固相或液相方法合成。本发明采用手工方法合成，用Fmoc保护氨基酸，连接在Rink酰胺化树脂上。合成方法参照文献Cai et al,Proc Natl Acad Sci USA 1986；83:1890-1990。进行。
除多肽本身外，本发明的生长激素释放肽可以其与本领域中常用的有机酸或无机酸，如盐酸、枸橼酸形成盐加以使用。
研究结果表明，本发明的生长激素释放肽具有抗衰老、促进机体生长、促进创伤愈合和治疗垂体功能低下的作用，可用于制备抗衰老、促进机体生长、促进创伤愈合和治疗垂体功能低下的药物。
下面的实施例将对本发明作进一步的阐述，但并不限制本发明。
图1为本发明的GHRP高效液相色谱分析结果。
图2为本发明的GHRP质谱分析结果。
图3为本发明的GHRP对同窝大鼠生长的影响。
图4为本发明的同窝不同大小大鼠自然生长情况，作为图3对照。
图5为本发明的GHRP对正常群的大鼠生长的影响。
图6为本发明的GHRP对动物游泳耐力的影响。
图7为本发明的GHRP对大鼠软组织创伤修复的影响。
图8为本发明的GHRP对24月龄老年皮毛外观的影响。
图8.1为24个月龄GHRP处理组小鼠(上下两张照片为不同放大倍数)。
图8.1为24个月龄的对照组小鼠(上下两张照片为不同放大倍数)。
图9为本发明的GHRP对24个月老年小鼠生育能力的影响。
图9.1为24个月龄GHRP处理组雌性小鼠与青年雄性小鼠共育后代。
图9.2为24个月龄GHRP处理组雌性小鼠与24个月GHRP处理组雄性小鼠共育后代。
实施例1．生长激素释放肽的筛选实验组成年大鼠48只，体重180g分为8组。实验组皮下分别注射上述类似物10ug/只。对照组动物6只，皮下注射同容积的生理盐水。测得注射后30分钟时动物血中GH浓度如表1。经筛选，确定His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Arg-NH2、His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2和His-D-Trp-Ala-His-D-Phe-Arg-NH2为最有效结构。
表1．不同类似物对动物血中GH浓度组别例数 平均值g/kg 标准差A 6 31.6 2.46874B 6 42.6 3.46784C 6 40.5 2.28954D 6 26.4 3.46213E 6 22.1 2.16784F 6 14.6 3.45224G 6 36.4 4.27894H 6 12.4 2.45785表中，A:Trp-D-Trp-Ala-His-D-Phe-Lys-NH2,B:His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2,C:His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Arg-NH2,D: His-D-Trp-Gly-Trp-D-Phe-Lys-NH2,E:His-D-Trp-Gly-His-D-Phe-Lys-NH2,F:His-D-Lys-Gly-His-D-Phe-Lys-NH2,G:His-D-Trp-Ala-His-D-Phe-Arg-NH2,H:His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2。
实施例2．生长激素释放肽的确认根据上述筛选结果，用Fmoc保护氨基酸，连接在Rink酰胺化树脂上(参照文献Cai et al,Proc Natl Acad Sci USA 1986；83:1890-1990。进行)用手工方法较大量地合成了多肽B和C，两种多肽经脱盐纯化后，用质谱生物重构和高效液相色谱(HPLC)分析确认，冰冻干燥法脱去水分(详细可参照文献Cai et al,Proc Natl Acad Sci USA 1986；83:1890-1990。进行)。
实施例3．药理作用研究药理学研究用上述序列的C，同时将B作为参照。发现两种结构在药理学作用上几乎完全相同。
1促进机体生长作用方法一将同窝幼年大鼠(雌雄不拘)按体重分为两组体重轻的一组经皮下注射GHRP，体重重的一组给生理盐水。
结果三周后，注射GHRP的体重轻的大鼠体重明显全面高于同窝体重较重的一组(P＜0.05)。而未经处理的同窝大鼠，两组大鼠间体重差距明显加大(p.＜0.01)，见附图3、4。
方法三将同窝幼年大鼠(雌雄不拘)按体重大小分为两组，让两组动物自然生长。
结果三周后，同窝幼年大鼠体重大的一组与小的一组体重差距加大，差别非常明显。
方法二体重相似的雄性大鼠40只，给药组注射GHRP(20ug/d/rat)，另一组注射生理盐水对照。同时，每天称重并记录。结果用药一周后，给药组大鼠体重明显高于给盐水的对照组。停止给药后，处理组动物体重在一周内仍保持继续加大趋势，但这种加大趋势渐缓和。两周后两组动物体重增加比相同。两组大鼠绝对体重，GHRP组明显高于对照组(P＜0.001)，见附图5。
测量治疗和未治疗两组动物的脂肪/肌肉比例，治疗组明显低于对照组。
2增进耐力研究方法动物分为治疗组(12只)和正常对照组(12只)。治疗组动物连续每天给GHRP，一次(20ug/day)，共14天。对照组动物注射生理盐水。注射时间同治疗组。两组动物配对，采用游泳耐力实验，记录每只大鼠死亡时间，GHRP可明显提高游泳生存时间，方差分析结果P＜0.01，见附图6。
3促进创伤愈合方法动物分为GHRP组(24只)和对照组(24只)，雌雄各半。动物分别在戊巴比妥麻醉下，左下肢手术创伤，深至骨。GHRP组每天注射GHRP20μg/200μl/只，对照组注射生理盐水200μl/只。每组动物又分为三组，分别在第五天，七天，九天深麻醉下处死，取下手术部位，浸泡固定。石蜡切片，H.E.呈色。结论研究了软组织损伤后，GHRP对伤口愈合情况的影响。结果GHRP组动物伤口愈合明显增快，治疗组5天伤口与对照组7天伤口一致(见附图7)。说明具有明显的促进创伤愈合作用。
4抗衰老研究动物使用18个月和23个月龄的老年小鼠各120只。其中各80只注射GHRP,40只注射盐水对照。青年对照组用雌性青年小鼠44只，其中24只用于生育研究，20只用于行为学观察；雄性青年小鼠32只，其中12只用于生育研究，20只用于行为学观察。处理注射GHRP组老年动物注射GHRP10ug/次/天，连续30天；用于对照组的老年动物和行为学观察组的青年动物注射生理盐水，连续30天。然后观察记录其行为特征。
4.1使老年动物活动明显增加，攻击性增强，使老年动物皮毛光滑。GHRP治疗组老龄大鼠与对老年照组老龄大鼠外观照片明显不同。
4.2对性行为的影响使18个月雄性大鼠爬背次数明显增加；22个月大鼠不同程度仍有爬背能力，而对照组动物几乎完全丧失了爬背能力。雌性动物(18,22个月)发情次数增加，而22个月对照组雌性动物几乎完全丧失发情能力。
4.3对生育能力的影响为进一步证明GHRP对动物生育能力的影响，我们观察了老龄大鼠的生育能力。将给药组、对照组23个月龄大鼠分别与正常青年雌雄大鼠，或相同处理的同龄大鼠共同喂养一周，然后再次分开喂养。分组及20天后动物生育情况如下第一组老龄给药组雄性大鼠6只与青年雌鼠12只第二组老龄对照组雄性大鼠6只与青年雌鼠12只第三组老龄雌性给药组大鼠12只与青年雄大鼠6只第四组老龄雌性对照组大鼠12只与青年雄大鼠6只第五组老龄给药组雌雄大鼠各12只第六组老龄对照组雌雄大鼠各12只
20天后，1.3.5.组大鼠分别生下正常幼鼠，而2.4.6.组则未生育，各组动物产子情况统计如下。
表2、各组小鼠妊娠及产子情况统计表组别 妊娠大鼠数量妊娠大鼠比率 平均每胎产子数1 1010/12=83％92 00 03 8 8/12=67％ 74 00 05 7 7/12=60％ 86 00 04.4、对血清过氧化物岐化酶(SOD)活力的影响方法给药组(16只)与对照组(11只)23个月雄性大鼠摘除眼球采血。血液分为两份。一份用肝素抗凝，另一份自然凝固。双盲法送301医院老年病中心做血液学检查。血清SOD检查采用生物发光法测定SOD活力(请参照李益新等报告文献超氧化物歧化酶活力测定的新方法—化学发光法。生物化学与生物物理学进展，1983,2:59-62)表3、老年小鼠血清SOD活力
方差分析差别明显(P＜0.0040)4.5、对全血谷光甘肽过氧化物酶活力的影响方法测定全血GSH-PX活力采用DTNB显色法测定，具体方法见OhkawaHet al Annal Biochem 1979,95:351。
结果检查结果如表4表4老年小鼠全血谷光甘肽过氧化物酶活力组别 例数 平均值标准差Control14 22.7172727 5.32159768GHRP 16 31.0992857***3.03958364方差分析治疗组明显高于对照组(p＜0.0001)4.6、对血清中过氧化物酶含量的影响方法用钼酸铵显色法测定血清。具体方法参见董泗建等报告文献一种测定过氧化轻酶活性的新方法。军事医学科学院院刊，1995,19:130-132结果检查结果如表5表5老年小鼠血清中过氧化物酶含量组别 例数 平均值 标准差Control14 87.6500000 13.6424983GHRP 16 99.4653846*15.3184271方差分析，差别显著(P＜0.05)。
4.7、对血清中酯褐素(LPO)含量的影响方法用磷钨酸沉淀，TBN显色测定LPO。具体参见文献Balge JTMicrosomal lipid peroxidation methods.Enzymology,1987,52:302，周翔等血清过氧化脂质的测定和意义。白求恩医科大学学报，1985,11:358-361结果检查结果如表6表6老年小鼠血清中LPO含量组别 例数 平均值标准差Control 13 136.85090929.2700412GHRP 15 91.660667***26.9361071方差分析，差别非常明显(P＜0.0004)结论从上述行为学、生育能力和4项血清学检查看，GHRP具有非常明确而强大的抗衰老作用。
4.8、对老年小鼠死亡率的影响方法老年(23个月)小鼠共90只，其中30只注射GHRP,30只注射盐水对照，30只不作任何处理。观察用药一个月时生存和死亡动物数量。
结果发现GHRP小鼠死亡数量明显低于其他两组。(见表7)表7、23-24个月龄小鼠在1个月间死亡情况表<
4.9对老年小鼠学习记忆的影响方法将23个月龄的给药组和对照组小鼠进行学习记忆研究。方法主动回避实验—穿梭箱(Shuttle box)实验对动物条件回避反应能力进行评价。实验由8个箱体构成。实验箱通过一个主控器与计算机相连。由微机发出指令控制实验进程。记录60次试行周期内动物条件刺激期避免电击次数(条件性回避反应)和逃避电击的反应时间(条件回避反应潜伏期)。
结果条件性回避次数和条件回避反应潜伏期时间见表8:GHRP可使动物条件回避反应潜伏期缩短，方差分析结果差别明显(P＜0.05)(见表9)，而对条件性回避反应能力无明显(P＞0.05,P=0.064)改善作用。结果说明GHRP对老年动物的主动回避反应有一定的促进作用。以上研究说明，GHRP能缩短动物条件回避时间。对于条件回避即学习能力差异并不显著。
表8、条件性回避反应组别 例数 平均值 标准差Control12 7.000000 7.89706505GHRP 17 8.76470588 4.71075116表9、条件回避反应潜伏期AN Mean SDControl12 51.91666677.83301095GHRP 16 42.8125000**9.82662200
权利要求
1．具有下式序列的多肽或其与酸形成的盐，aa1-D-Trp-aa3-aa4-D-Phe-aa6-NH2其中，aa1代表His或Trp,aa3代表Ala或Gly,aa4代表His或Trp,aa6代表Lys或Arg。
2．按照权利要求1所述的多肽或其与酸形成的盐，其特征在于aa1代表D-His或D-Trp,aa3代表D-Ala或D-Gly,aa4代表D-His或D-Trp,aa6代表D-Lys或D-Arg。
3．按照权利要求1所述的多肽或其与酸形成的盐，其序列为His-D-Trp-Gly-Trp-D-Phe-Lys-NH2。
4．按照权利要求1所述的多肽或其与酸形成的盐，其序列为His-D-Trp-Gly-His-D-Phe-Lys-NH2。
5．按照权利要求1所述的多肽或其与酸形成的盐，其序列为His-D-Lys-Gly-His-D-Phe-Lys-NH2。
6．按照权利要求1所述的多肽或其与酸形成的盐，其序列为His-D-Trp-Ala-His-D-Phe-Arg-NH2。
7．按照权利要求1所述的多肽或其与酸形成的盐，其序列为His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Arg-NH2。
8．按照权利要求1所述的多肽或其与酸形成的盐，其序列为His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2。
9．按照权利要求1所述的多肽或其与酸形成的盐，其序列为Trp-D-Trp-Ala-His-D-Phe-Lys-NH2。
10．权利要求1所述的多肽在制备抗衰老、促机体生长、促进创伤或骨折愈合、治疗垂体功能低下药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及生长激素释放肽及其在抗衰老、促进机体生长、促进创伤愈合和治疗垂体功能低下方面的应用。它们的结构为aal－D－Trp－aa3－aa4－D－Phe－aa6－NH
文档编号A61P5/02GK1224725SQ9910074
公开日1999年8月4日 申请日期1999年2月13日 优先权日1999年2月13日
发明者刘少君 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所