专利名称：刺猬蛋白的药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及刺猬蛋白(hedgehog proteins)的药物组合物及其特别在骨和软骨上局部释放这些蛋白质方面的应用。
人们认为刺猬(hh)蛋白是一族分泌性信号蛋白，它们导致胚胎发生中多种结构的形成(J.C.Smith，细胞(Cell)76(1994)193-196,N.Perrimon，细胞80(1995)517-520,C.Chiang等，自然(Nature)83(1996)407,M.J.Bitgood等，当代生物学(Curr.Biol.)6(1996)296,A.Vortkamp等，科学(Science)273(1996)613,C.J.Lai等，发育(Development)121(1995)2349)。在其生物合成期间，在信号序列的裂解以及自动催化裂解之后得到20kDN端结构域和25kDC端结构域。该N端结构域在其天然形式中被胆固醇修饰(J.A.Porter等，科学274(1996)255-259)。在高级生物形式中，该hh族至少包括三种，即发音的hh(sonic hh)、印度hh(indianhh)和荒漠hh(deserthh)(Shh、Ihh、Dhh；M.Fietz等，发育(增刊)(1994)43-51)。在原核生物和真核生物中生成之后，观察到重组产生的刺猬蛋白存在活性差异(M.Hynes等，神经元(Neuron)15(1995)35-44以及T.Nakamura等，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)237(1997)465-469)。
Hynes等将转化的人胚肾293细胞上清液中的hh(真核生物hh)的活性与从大肠杆菌(E.Coli)产生的hh作了比较，发现肾细胞系上清液中的hh活性高4倍。讨论了该增大的活性的原因是只在真核细胞中表达的潜在另外的辅助因子，翻译后修饰，不同的N端，因为从大肠杆菌分离的hh包含50％的携带两种另外的N端氨基酸(Gly-Ser)或被减短5～6个氨基酸的hh，或者更高的聚集状态(例如通过与镍琼脂糖珠结合)。
Nakamura等将转化的鸡胚成纤维细胞上清液中的shh的活性与从大肠杆菌分离的仍具有N端聚组氨酸部分的shh融合蛋白作了比较。对于C3H10T 1/2细胞中碱性磷酸酶(AP)的刺激来说，成纤维细胞的上清液中shh的活性比纯化的大肠杆菌蛋白的活性高7倍。认为例如骨形成蛋白(BMPs)这样的分子是增大的活性的原因，这种蛋白只存在于真核细胞上清液中并引起更强的AP诱导作用。
Kinto等在FEBS通讯(FEBS Letters),404(1997)319-323中描述，分泌hh的成纤维细胞诱导i.m.植入术中胶原上形成异位骨。因此刺猬蛋白具有骨诱导活性。
从WO 90/08551得到应用藻酸盐生产具有延迟释放功能的蛋白质送递系统的方法。在该方法中形成两相体系，第一相包含高浓度的蛋白质(饱和溶液)，第二相包含藻酸盐。然而，当大量生产药物组合物时，这种相分离困难，操作麻烦。
从Kikuchi,A.等，控制释放杂志(J.Controlled Release)47(1997)21-29得知从藻酸钙复合体脉动释放葡聚糖。但是Kikuchi未描述刺猬蛋白与这种复合体的偶合。
Robinson,C.J.等在生物技术趋势(Trends inBiotechnology)14(1996)451-452中描述了心室内植入藻酸盐微球作为局部应用NGF或NGF-分泌细胞的方法。但是，未描述关于刺猬蛋白的应用。
Downs,E.C.等在细胞生理学杂志(J.Cell.Physiol.)152(1992)422-429中描述了应用藻酸钙微球作为血管生成因子的送递系统。但是，未描述该方法或该送递系统对于刺猬蛋白的应用。
Crey,C.J.和J.Dowsett在生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)31(1988)607-612中描述了藻酸钙/藻酸锌微球作为胰岛素送递系统的应用。但是，从该文献未知该方法在生产刺猬蛋白送递系统方面的应用。
从Yang等，发育124(1997)4393-4404得知，要达到活体内药物上有效的活性，则体内作用部位上高局部刺猬蛋白浓度必须维持至少达16h。Yang等描述的载体系统类似于Marti等在自然375(1995)322-325中描述的装填刺猬蛋白的层析介质Affigel CM，镍-琼脂糖，或者Lopez-Martinez等在当代生物学5(1995)791-796中应用的Affigel Blue或其中应用的肝素-琼脂糖粒子，它们不适合药物应用，因为它们是免疫原性的因而能引起炎症反应。
本发明人发现，只要这些刺猬蛋白仅通过离子相互作用与载体结合，则Kinto等描述的有关hh-表达细胞的生物相容性和可生物降解性载体胶原也不适合刺猬蛋白的最佳局部药物应用。已发现当胶原载体在生理条件(pH约为7以及弱酸性(高达pH 4.5))下负载刺猬蛋白时，则大部分应用的刺猬蛋白在数分钟内就从基质释放出来。根据本发明人的发现，该不充分的结合是由于刺猬蛋白和载体之间缺乏足够的离子相互作用。至于在酸性条件(pH低于4.5)下负载，大量应用的刺猬蛋白被变性并且不可逆地与载体结合。
因此，本发明的目的是提供刺猬蛋白与生物相容性载体的药物组合物，其中该载体与呈活性、折叠结构的刺猬蛋白结合并能在活体内呈延迟方式以其活性形式释放刺猬蛋白。这种制剂尤其适合修复骨缺陷和软骨缺陷，但也能用于修复神经元缺损或用于系统送递。
该目的是通过刺猬蛋白的药物组合物达到的，该组合物的特征在于该刺猬蛋白与生物相容的亲水性载体结合，其中该载体是聚合物，它-作为带负电荷的载体通过离子相互作用与刺猬蛋白结合，-当刺猬蛋白与其结合时该载体不会使刺猬蛋白变性，-该载体在中性条件下每个单体至少含0.1～1个、优选0.1～2个带负电荷的残基，-该电荷介于酸性基团例如硫酸基、羧基或磷酸基形式中，-该载体的平均分子量至少是50,000Da。
意外地证明了，如果刺猬蛋白与带负电荷的可溶性或不溶性聚合物基质结合，则刺猬蛋白能在活体内呈延迟方式以活性形式可逆地从载体释放而不会引起活体内的均相反应和/或炎症反应。
优选地应用亲水性载体基质，特别优选的是可溶的或不溶的有机亲水性载体基质。该载体基质特别优选地包含阴离子型多糖，例如优选为透明质酸(及其化学交联的形式)、硫酸软骨素、聚硫酸乙烯酯、硫酸角蛋白、葡聚糖硫酸酯、果胶、角叉菜聚糖以及其它亲水胶体、硫酸化藻酸盐、硫酸皮肤素、藻酸盐(优选为藻酸钙)或者是至少两种这样的阴离子型多糖的组合或者是这些带电荷的多糖与其它聚合物(例如尤其是胶原)的组合，其中带电荷的多糖重量百分数是10～50％。本发明意义中的不溶性基质表示，在体外室温下10～20小时内该基质基本上不分解或者看不到溶于缓冲溶液中。在这一点上特别优选的是，本发明应用的载体包含少于50％、优选少于20％且特别优选大体上没有中性多糖。分子量至少为106道尔顿、尤其分子量为4×106道尔顿的透明质酸特别适合作为载体基质。
在进一步的实施方案中，已证实基于无机不溶性磷酸盐(如羟磷灰石或磷酸三钙)的亲水性载体也适合作为本发明的不溶性载体基质。
本发明的延迟释放应理解为刺猬蛋白在至少14小时规定期间以药理上有效剂量释放。药理效果应理解为对神经细胞的神经效果，软骨形成和/或诱导软骨形成以及优选为骨生成和/或骨诱导，例如Kinto等在FEBS通讯，404(1997)319-323中描述的骨诱导，Miao等在神经科学杂志(J.Neurosci.)17(1997)5891-5899中描述的对神经细胞的效果，以及Stott等在细胞科学杂志(J.Cell.Sci.)110(1997)2691-2701中描述的软骨细胞诱导。
优选将可酶促降解载体用作该载体，它可被得自细胞的分泌性酶(例如蛋白酶)降解，对所述细胞进行该活体内局部应用。然而，载体的半寿命至少应为12h，但可以是数周。如果载体是由多糖构成的，则该载体优选被存在于细胞中并被分泌的糖苷酶和水解酶降解。不过，并非在各种情况中要求载体的这种可生物降解性。如果进行释放以治疗骨质疏松症或神经元疾病，就不需可生物降解性。然而，这类载体优选在生理条件下溶解性差，因而在较长时间(数周至数月)被身体吸收。
需要高浓度的刺猬蛋白溶液以便按这种方式生产涂覆了刺猬蛋白的载体基质，使得当局部应用时它们表现适当的药效。已证实涂覆了可药用的刺猬蛋白的载体应优选包含浓度为1～5mg/ml，优选为3mg/ml载体或更大的刺猬蛋白。包含浓度为10mg/ml或更大的刺猬蛋白的载体是特别优选的。刺猬蛋白本身溶解性差。然而，意外地已证实，在含精氨酸或精氨酸离子(优选为硫酸精氨酸)的溶液中刺猬蛋白的溶解性急剧增大。于是，本发明的又一主题是3mg/ml或更大浓度的刺猬蛋白的水溶液，该溶液含精氨酸和精氨酸离子并且优选被缓冲处理。本发明的又一主题是生产涂覆了刺猬蛋白的载体基质的方法，其特征在于该载体基质与3mg/ml浓度的、含精氨酸或精氨酸离子的刺猬蛋白溶液保温，再分离以这种方式涂覆的载体基质。
这类溶液适合生产含药物上有效浓度的刺猬蛋白的载体基质，而且该载体基质适合药物应用。这样，本发明的又一主题是载体基质，其中每ml载体基质含3mg或更多、优选含10mg或更多的刺猬蛋白，以及含精氨酸或精氨酸离子。精氨酸的浓度优选在10～500mmol/l，优选在6-8的pH范围内。
本发明意义中的活性应理解为多肽能在哺乳动物细胞中诱导的碱性磷酸酶(刺激碱性磷酸酶的表达)的活性(碱性磷酸酶分析中的活性)。为此，将小鼠间充质细胞系在含胎牛血清的培养基中培养。接着添加无菌过滤的样品，约5天后将细胞裂解，通过显色底物(pNP，对硝基苯酚)的裂解(J.Asahina，实验细胞研究(Exp.Cell.Res.222(1996)38-47以及T.Nakamura(1977))测定细胞裂解液中碱性磷酸酶的活性。
刺猬蛋白在本发明中应理解为分泌性信号蛋白，它导致胚胎发生中形成多种结构。发音的hh、印度hh或荒漠hh被特别优选应用(Fietz M.等，发育(增刊)(1994)43-51)。具有EMBL数据库中在No.L38518下所述序列的hh蛋白被优选应用。刺猬族蛋白质表现显著的氨基酸序列同源性，这就是为什么也优选表达编码刺猬蛋白的那些核酸，所述刺猬蛋白具有与前述发音刺猬蛋白的序列80％或更高的同源性。
人发音刺猬前体蛋白包括EMBL数据库中在No.L38518下所述序列的氨基酸1～462。氨基酸1～23代表信号肽，氨基酸24～197代表成熟的信号结构域，氨基酸32～197代表减短8个氨基酸的信号结构域，氨基酸198～462则代表自我蛋白酶解之后的自动加工结构域。
本发明的药物组合物优选含实际上起支持结构物质作用的另一种聚合物，它还优选具有粘附细胞的功能但不基于离子相互作用结合在刺猬蛋白上。优选地，该物质是可生物降解的蛋白质或水解降解产物，它可例如呈完整蛋白质纤维的形式用作溶解蛋白或部分水解蛋白。这些支持结构物质优选是胶原、明胶、弹性蛋白或纤维蛋白。该支持结构物质存在的量优选低于本发明的所述亲水性生物相容的载体。因此该支持结构物质的比率为30％或更少，优选为10％或更少。不过，该支持结构物质还可以高于亲水性载体的量存在。此时只需本发明的药物组合物中亲水性载体的量足够高以保证治疗有效量的刺猬蛋白与该亲水性载体结合。因而优选应用比刺猬蛋白至少多5倍的亲水性载体。此外，为制备药物组合物应在4.5或更大的pH下进行刺猬蛋白与载体的结合。如前所述，已发现刺猬蛋白在pH低于4.5时变性并且不可逆地结合蛋白质类载体(如胶原)。因此，刺猬蛋白与载体应在中性pH范围内进行结合。
除了亲水性载体外还包含支持结构化合物的载体例如有蛋白质/多糖复合物。优选的复合物描述于美国专利4,614,794中。
该药物组合物是通过将刺猬蛋白与亲水性载体在4.5或更大的pH下、优选在中性范围内的pH(pH6～8)下保温而制备的，由此实现刺猬蛋白与载体的结合。优选在缓冲溶液中进行保温。当应用另外还包含可生物降解的蛋白质(如胶原)的基质作载体时，在pH为4.5或更大时保温将保证避免刺猬蛋白(它在更低pH值下变性)与可生物降解蛋白的不可逆结合。已发现只要刺猬蛋白不含疏水性修饰，则在这些条件下刺猬蛋白与可生物降解蛋白不发生结合或者只发生可忽略的结合，于是可生物降解蛋白只起支持结构物质的作用。
疏水性修饰的(亲脂的)刺猬蛋白是这种刺猬蛋白，即与未修饰的hh蛋白(例如在原核生物中重组产生的蛋白)相比显示表面疏水性的增大。蛋白质的亲脂度是按Haque,Z.等在农业食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)30(1982)481中所述方法通过在脂质层中整合而测定的。这种亲脂性hh蛋白按本发明按照与非亲脂性hh蛋白相同的那种方式和亲水性载体结合，但它们还与可生物降解蛋白通过疏水性相互作用结合。
要生产该药物组合物，另外优选添加下列辅助物质例如糖(甘露糖醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖，优选20-100mg/ml)，或者氨基酸如甘氨酸或精氨酸，以及抗氧剂如EDTA，柠檬酸盐，聚乙二醇(1-10wt％)，洗涤剂，优选是非离子型洗涤剂(优选0.005～1wt％)如聚山梨醇酯(Tween20或Tween80)或聚氧化乙烯，抗炎组分，局部麻醉剂，抗生素和/或稳定剂如脂质、脂肪酸和甘油。
在另一优选的实施方案中，本发明的刺猬蛋白药物组合物与苏拉明结合是优选的，这可有效地应用。
该药物组合物可包含其它药物辅助物质。
在一优选的实施方案中，该药物组合物含浓度为0.1～100mg/ml的刺猬蛋白。
在一优选的实施方案中，该药物组合物另外含药物上可接受的生物相容性缓冲剂，该缓冲剂优选在pH4和pH10之间的范围内，更优选在pH6和pH8之间的范围内，特别在约pH7的pH值。该药物组合物的pH值应在pH4以上较合适，以防变性以及刺猬蛋白中复合的锌的移除。缓冲剂的浓度优选为1～500mmol/l，更优选为5～150mmol/l，特别优选为10～100mmol/l。在一合适的实施方案中，将20mmol/l磷酸钾缓冲剂(pH7.2)，或100mmol/l氯化精氨酸(pH7.2)用作缓冲剂。
如下实施例、文献和图进一步阐释本发明，本发明的保护范围由权利要求书决定。所述方法应理解为甚至在更改后仍描述本发明的主题的实施例。
图1从胶原基质体外释放shh。图2从藻酸钙胶囊体外释放shh。图3从透明质酸凝胶体外释放shh。图4从藻酸盐/胶原基质体外释放shh。
实施例实施例1含hh蛋白的藻酸盐凝胶的制备搅拌hh蛋白溶液(1mg/ml shh在50mg/ml蔗糖、50mM磷酸钾中的溶液，pH7.2)等分液与藻酸钠贮备液(Pronova,Biopolymer,NO)(于水中，大于0.1％)使之形成胶状藻酸盐蛋白质混合物。可直接将该凝胶用作可注射的基质或者进一步加工成藻酸钙胶囊或者以冻干物形式贮存。实施例2含hh蛋白的胶原混合物的制备(比较实施例)将100μl于下列物质中的hh溶液(1mg/ml hh)a)20mM磷酸钾， pH7.4或b)50mM乙酸钠， pH4.5或c)0.1％三氟乙酸，pH2滴加到大小为10×10×3mm的胶原海绵状物(Helistat,IntegraLife Sciences,USA)上。然后冷冻(-70℃)该负载的载体，冻干后分析。为此，将该负载的海绵状物在37℃下适当体积的缓冲液(10mmol/l磷酸钾，150mmol/l NaCl,pH7.2)中保温。通过RP-HPLC法测定释放的hh量。实施例33.1藻酸钙胶囊的制备在连续搅拌下，将实施例1中所述含hh蛋白的藻酸盐凝胶滴加到CaCl2溶液(约1.5％)中。自发形成含该蛋白质的藻酸钙复合物。形成的胶囊大小取决于滴加液滴的大小且可按所需改变。在CaCl2溶液中保温5～10分钟后，过滤出胶囊，在缓冲液(20mmol/l磷酸钾，pH7.2)中洗涤。这些胶囊可直接作为植入物应用或者可通过冻干法被进一步加工。3.2冻干在-70℃下冷冻该藻酸钙胶囊，接着冻干。冻干可稳定贮存该胶囊，另外也便于植入，因为呈干燥态的胶囊易于操作。实施例4体外释放Shh体外释放动力学分析表明，Shh以延迟方式在至少70h期间从藻酸钙胶囊被释放(图2)，而shh从胶原基质在数分钟到约20分钟内被释放(图1)。将包含shh的冻干的藻酸盐球状物在37℃下的10mM磷酸钾、150mM NaCl,pH7.2(Rotatherm)中保温。在5分、1h、5h、10h、1d、34h、2d、3d和6d后取样，通过SDS聚丙烯酰胺电泳法分析它们的shh含量(图2)。将从藻酸盐胶囊释放的累积shh量对时间绘图。
应用低分量型(LMW；分子量约为1.3×106Da)或高分子量型(HMW；分子量约为4×106Da)透明质酸检测从2.5％透明质酸凝胶释放shh的动力学示于图3。为此将负载了shh的透明质酸凝胶装入透析管(分离大小为300,000Da)，将透析管在37℃下的PBS中保温。在所述时间取释放介质样品，通过反相HPLC法分析它们的shh含量。显然，负载的刺猬蛋白部分呈延迟方式被释放。该蛋白质的另一部分仍保持与透明质酸结合并且可在活体内通过透明质酸的降解被释放。
检测从胶原-藻酸盐基质(FibracolTM，参见美国专利4,614,794)释放shh的动力学示于图4。为此将Fibracol海绵状物(1×1×0.3cm)在PBS中负载0.2mg的hshh。将负载的海绵状物冷冻(-70℃)，冻干后在37℃下适当体积的PBS中保温。在所述时间取释放介质的样品，通过反相HPLC法分析它们的shh含量。显然只有约10～20％负载的刺猬蛋白被释放入介质，而主要部分则仍保持与胶原-藻酸盐基质结合。该部分可通过基质的降解在活体内被释放。
参考文献表Asahina,J.，实验细胞研究(Exp.Cell.Res.)222(1996)38-47Bitgood,M.J.等，当代生物学(Curr.Biol.)6(1996)296Chiang,C.等，自然(Nature)83(1996)407Crey,C.J.等，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)31(1988)607-612Downs,E.C.等，细胞生理学杂志(J.Cellular Physiology)152(1992)422-429Fietz,M.等，发育(增刊)(Development(Suppl))(1994)43-51Haque,Z.等，农业食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)30(1982)481Hynes,M.等，神经元(Neuron)15(1995)35-44Karablis等，基因及发育(Genes and Development)8(1994)277-289Kikuchi,A.等，控制释放杂志(J.Controlled Release)47(1997)21-29Kinto等，FEBS通讯(FEBS Letters),404(1997)319-323Lai,C.J.等，发育(Development)121(1995)2349Lopez-Martinez等，当代生物学，5(1995)791-796Marti等，自然375(1995)322-325Miao等，神经科学杂志(J.Neurosci.)17(1997)5891-5899Nakamura,T.等，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)237(1997)465-469Perrimon,N.，细胞(Cell)80(1995)517-520
Porter,J.A.等，科学(Science)274(1996)255-259Robinson,C.J.等，生物技术趋势(Trends inBiotechnology)14(1996)451-452Smith,J.C.，细胞76(1994)193-196Stott等，细胞科学杂志(J.Cell Sci.)110(1997)2691-2701美国专利4,614,794Vortkamp,A.等，科学273(1996)613WO 90/08551Yang等，发育124(1997)4393-440权利要求
1．刺猬蛋白的药物组合物，其特征在于该刺猬蛋白与生物相容的亲水性载体结合，其中该载体是聚合物，它-作为带负电荷的载体通过离子相互作用与刺猬蛋白结合，-当刺猬蛋白与其结合时该载体不会使刺猬蛋白变性，-在中性条件下每个单体至少含0.1～2个带负电荷的残基，-含呈酸性基团形式的电荷，-具有的平均分子量至少是50,000Da，-并且不含琼脂糖。
2．权利要求1的药物组合物，其中该载体包括有机亲水性载体基质或无机不溶性磷酸盐。
3．权利要求1或2的药物组合物，其中该载体包括阴离子型多糖或无机不溶性磷酸盐。
4．权利要求1-3的药物组合物，其中该亲水性载体是透明质酸。
5．权利要求1-4的药物组合物，其中该药物组合物含浓度为0.1-100mg/ml的刺猬蛋白。
6．权利要求1-5的药物组合物，其中该组合物在pH4-10的范围内被缓冲处理。
7．权利要求1-6的药物组合物，其中该组合物含精氨酸或精氨酸离子。
8．制备含刺猬蛋白的药物组合物的方法，该刺猬蛋白结合在生物相容的亲水性载体上，其中该载体是聚合物，它-作为带负电荷的载体通过离子相互作用与刺猬蛋白结合，-当刺猬蛋白与其结合时该载体不会使刺猬蛋白变性，-在中性条件下每个单体至少含0.1～2个带负电荷的残基，-含呈酸性基团形式的电荷，-具有的平均分子量至少是50,000Da，-并且不含琼脂糖，其中药物上有效量的刺猬蛋白被用作该药剂的基本成分。
9．权利要求8的方法，其中应用浓度为0.1～100mg/ml的刺猬蛋白。
10．在人体内延迟释放刺猬蛋白的方法，其中该刺猬蛋白在人体内以权利要求1-6的药物组合物形式被局部应用。
11．权利要求10的方法，其中该刺猬蛋白在0.1～100mg/ml的浓度下被应用。
12．权利要求8-11的方法，其中该亲水性载体是透明质酸。
13．权利要求8-12的方法，其中刺猬蛋白与亲水性载体的结合是通过在4.5或更大的pH下保温而进行的。
14．不溶性载体基质，其中每ml载体基质含至少3mg刺猬蛋白以及至少10mmol/l精氨酸或精氨酸离子。
15．制备含刺猬蛋白的不溶性载体基质的方法，其中将该载体基质与含浓度为3mg/ml或更大的刺猬蛋白以及浓度为10mmol/l或更大的精氨酸或精氨酸离子的溶液保温，接着分离以该方式涂覆的载体基质。
16．权利要求15的方法，其中刺猬蛋白与亲水性载体的结合是通过在4.5或更大的pH下保温而进行的。
全文摘要
刺猬蛋白的药物组合物,其特征在于该刺猬蛋白与生物相容性且可生物降解的亲水性载体结合,其中该载体是聚合物,它作为带负电荷的载体通过离子相互作用与刺猬蛋白结合;当刺猬蛋白与其结合时该载体不会使刺猬蛋白变性;在中性条件下每个单体至少含0.1～2个带负电荷的残基;含呈酸性基团形式的电荷;平均分子量至少是50,000Da;不含琼脂糖。在活体内从载体以延迟的方式可逆地并主动地释放刺猬蛋白。
文档编号A61K31/00GK1228994SQ9910176
公开日1999年9月22日 申请日期1999年2月4日 优先权日1998年2月4日
发明者K·兰格, A·帕普迪米卓奥 申请人:伯伦格曼海姆有限公司