专利名称：靶向c－raf癌基因的反义硫代寡核苷酸,含它们的药物组合及其用于治疗癌症的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及靶向c-raf癌基因的反义硫代寡核苷酸，含它们的药物组合物及其用于治疗癌症的用途。
癌是由至少两种癌基因经多阶段变化而引起的，传统的基于细胞毒化学治疗具有选择性差、毒副作用强等缺点，寻找特异性强、尤其是干扰与肿瘤行为密切相关的基因表达的药物是人们所希望的。反义药物是利用Watson-Crick碱基配对原理与靶mRNA结合，干扰特定基因翻译的脱氧寡核苷酸类药物。反义药物在治疗基因异常表达或外来基因组表达所致疾病(如癌症和病毒感染)有着广阔的前景。Raf基因包括三个成员，即A-raf、B-raf、C-raf。c-raf基因表达的蛋白激酶，在调节细胞增生的信号传导过程中起重要的作用。许多人肿瘤细胞中有C-raf基因的突变激活(5’端缺失)或过度表达(Rapp et al.，The oncogenne handbook，EPReddy，AM Skalka and T Curran，eds.Elsevier Science Publishers NewYork，1988，pp.213-253)。1996年Monia等选择c-raf mRNA上5’端、3’端和蛋白编码区的34个位置作为靶点设计了靶向c-raf mRNA的反义硫代脱氧寡核苷酸，但只有个别(ISIS132)的有较强的体内外抗肿瘤效应(BP monia et al.Nat Med 1996；2(6)668～675)。反义脱氧寡核苷酸的设计体现为在mRNA上选择不同的位置，在一个靶mRNA(如c-raf mRNA含2977个碱基)上可设计出千万个不同长度的反义寡核苷酸，通常一个碱基的差别往往会表现为药效相差很大。人们认为反义寡核苷酸的设计、开发有较大的随机性(W Roush Science 1997；2761192～1193)，因此反义药物的选择还缺乏理论指导。
本发明的目的是寻找靶向c-raf癌基因的反义核苷酸药物。
本发明者经广泛深入研究，通过固相合成法合成了一系列硫代寡核苷酸并进行了筛选。现已发现下面四个对癌症中c-raf基因异常表达如肺腺癌A549细胞株和胃癌BGC细胞株有良好抑制作用的反义硫代寡核苷酸。
因此，本发明第一方面涉及的是具有下面序列1-4的靶向c-raf癌基因的反义硫代寡核苷酸序列15’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，今后简称为BIRM2480-20，序列25’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，今后简称为BIRM 2482-24，序列35’-AAAGTCCCGCCTGTGACATG-3’，今后简称为BIRM2488-20，序列45’-GCATACGACGCATAGTCAAA-3’，今后简称为BIRM762-20。
本发明再一方面涉及的是药物组合物，其包括具有下面序列的反义硫代寡核苷酸及药用载体和赋形剂。
序列15’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，今后称为BIRM2480-20，序列25’-ATTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，今后简称为BIRM 2482-24，序列35’-AAAGTCCCGCCTGTGACATG-3’，今后简称为BIRM2488-20，序列45’-GCATACGACGCATAGTCAAA-3’，今后简称为BIRM762-20。
本发明再一方面涉及的是下列序列的反义硫代核苷酸用于治疗癌症的用途本发明再一方面涉及的是上述下列序列的反义硫代核苷酸用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
根据本发明，本发明的反义硫代寡核苷酸序列1-4是以c-raf mRNA的3’-非翻译端(5’-GAGGAATGCATGTCACAGGC-3’，5’-GGAATGCATGTCACAGGCGGGACT-3’，5’-CATGTCACAGGCGGGACTIT-3’)和蛋白编码区(5’-TTTGACTATGCGTCGTATGC-3’)为靶点，设计合成与以上靶点反向互补的硫代脱氧寡核苷酸，其对肺腺癌A549细胞株和胃癌BGC细胞株有良好的抑制作用，因此本发明的靶向c-raf癌基因的反义硫代寡核苷基因的反义硫代寡核苷酸可用作抗癌药物。
在本发明的优选具体实施方案中，优选作用于肺腺癌A549细胞株的本发明序列2的反义硫代寡核苷酸(BRIM2482-24)。
在本发明另一具体优选方案中，优选作用于胃癌BGC细胞株的本发明序列1和序列2的反义硫代寡核苷酸。
根据本发明，本发明的药物组合物中还有含有作用于靶点其它靶点的反义寡核苷酸。
根据本发明，本发明药物组合物优选含有序列2的反义硫代寡核苷酸。
根据本发明，本发明药物组合物优选含序列1和/或2的反义硫代寡核苷酸。
根据本发明，优选将本发明序列2反义硫代寡核苷酸用于制备用于治疗肺癌的药物。
根据本发明，优选将序列1和2的反义硫代寡核苷酸用于制备用于治疗胃癌的药物。
下面的实施例是对本发明的进一步说明，但不意味着对本发明任何限制。
实施例一反义硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODN)的设计和合成1.人肿瘤细胞系(A549等)的培养及反义寡核苷酸的处理接种细胞于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中(补充青、链霉素各100ku·L-1)培养器皿置于37℃含有5％CO2的细胞培养箱中。培养细胞达到50～60％融合时，用无血清培养基冲洗2遍。按Gibcl BRL公司脂质体转染说明书的要求，将反义寡核苷酸导入到肿瘤细胞内。将脂质体/无血清培养基＝1/5的比例，配制成脂质体溶液，室温下静置30～40分钟。等体积混合用无血清培养基溶解的不同浓度的反义寡核苷酸，静置10～15分钟后，加入到培养器皿中，迅速补充4倍的无血清培养基。置于37℃含5％CO2的培养箱中6小时后，换正常培养基，培养48～72小时后MTT法测定细胞活度。对照组仅含等浓度的脂质体。
2.靶向c-raf mRNA的反义硫代寡核苷酸对肿瘤细胞的抑制作用将对数生长期的肺腺癌A549细胞或其它的细胞接种于96孔培养板中，4000个细胞/孔。培养18～24小时，按上述方法，加入不同浓度的反义寡核苷酸反应终体积均为200μl。换正常培养基继续培养48～72小时，弃上清。每孔加入200μl新鲜配制的含0.5mg/ml四氮唑盐(MTT)的无血清培养基，37℃培养4小时后弃上清。以200μl DMSO溶解甲月替。轻度振荡后，用酶标仪在检测波长为570nm、参比波长为450nm下测定光吸收值。
本发明反义硫代寡核苷酸(BIRM2480-20～BIRM762-20等)对肺腺癌A549细胞系、胃癌BGC细胞系有较强的抑制作用。
表1～4显示本发明反义硫寡核苷酸对A549肺腺癌细胞体外增殖的抑制作用，并与对照核苷酸序列ISIS5132进行了比较。表明BIRM2482-24效应大于国外对照ISIS5132，其它与ISIS5132的效应接近(N＝4，对照组为脂质体对照)。
表1 BIRM2480-20(n＝4)
表2 BIRM2482-24
表3 BIRM 2488-20<
表4 BIRM762-20
表5显示反义硫代寡核苷酸对BGC胃癌细胞体外增殖的抑制作用，并与国外的阳性药ISIS5132的效应进行比较。表明BIRM2480-20和BIRM2482-24对BGC胃癌细胞系的体外抑制作用大于ISIS132(n＝4，对照为完全空白)。表5
合成方法简介寡核苷酸固相合成亚磷酰胺法，使用美国ABI公司生产的ABI 390Z核酸合成仪的25umol合成程序合成程序合成。主要原料为四乙基秋兰姆(TETD)、亚磷酰胺单体(phosphoramidite monomers)。制备时，将固相支持物连接保护的、通过固相合成的含本发明核苷酸序列的硫代寡核苷酸脱保护，从固相支持物上切离。用HPLC法进行纯化。
序列表(1)一般资料I.序列数量4(2)序列BIRM2480-20的资料II.序列特征a)核苷酸长度20b)类型核酸c)链型单链d)拓扑特征链状III.是否反义反义IV.序列描述BIRM 2480-20GCCTGTGACA TGCATTCCTC 20(2)序列BIRM2482-24的资料II.序列特征a)核苷酸长度24b)类型核酸c)链型单链d)拓扑特征链状III.是否反义反义IV.序列描述BIRM 2482-24AGTCCCGCCTGT GACATGCATTCC 20(2)序列BIRM2488-20的资料II.序列特征a)核苷酸长度20b)类型核酸c)链型单链d)拓扑特征链状III.是否反义反义
IV.序列描述BIRM 2488-20AAAGTCCCGC CTGTGACATG 20(2)序列BIRM762-20的资料II.序列特征a)核苷酸长度20b)类型核酸c)链型单链d)拓扑特征链状III.是否反义反义IV.序列描述BIRM 762-20GCATACGACG CATAGTCAAA 20
权利要求
1.靶向癌基因c-raf基因的未修饰或修饰的具有序列1-4的反义硫代寡核苷酸序列1 5’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，序列2 5’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，序列3 5’-AAAGTCCCGCCTGTGACATG-3’，序列4 5’-GCATACGACGCATAGTCAAA-3’。
2.权利要求1的反义硫代寡核苷酸，其中反义硫代寡核苷酸具有序列1和2序列1 5’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，序列2 5’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，
3.权利要求2的反义硫代寡核苷酸，反义硫代寡核苷酸具有序列1 5’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，
4.权利要求2的反义硫代寡核苷酸，反义硫代寡核苷酸具有序列2 5’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，
5.药物组合物，其包括作为活性成份的具有序列1-4的反义硫代寡核苷酸和可药用载体。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述反义硫代寡核苷酸具有序列1和2序列1 5’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，序列2 5’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，
7.权利要求6的药物组合物，其中所述反义硫代寡核苷酸具有序列1序列1 5’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，
8.权利要求6的药物组合物，其中所述反义硫代寡核苷酸具有序列2序列2 5’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，
9.具有序列1-4的反义硫代寡核苷酸用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
10.治疗癌症的方法，其中包括给患有癌症的动物治疗有效量的权利要求1中具有序列1-4的反义硫代寡核苷酸或权利要求5的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及靶向c－raf癌基因的反义硫代寡核苷酸,含它们的药物组合物及其用于治疗癌症的用途。
文档编号A61K31/519GK1270173SQ9910495
公开日2000年10月18日 申请日期1999年4月12日 优先权日1999年4月12日
发明者袁守军, 汤仲明, 宋海峰, 朱宝珍 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所