向非人脊椎动物导入编码非人脊椎动物肽激素或细胞因子的裸dna或rna的制作方法

专利名称：：向非人脊椎动物导入编码非人脊椎动物肽激素或细胞因子的裸dna或rna的制作方法
背景技术：
：对在人类(GH缺陷者)和动物(主要为肉用动物种类)上外源应用GH的结果的描述与其合成代谢潜能是一致的。因此正常GH水平的提高导致骨生长和质量的提高，瘦肉量的提高，以及脂肪组织的降低。在PNU已研究了给予重组猪生长激素(pST)或GHRH对猪的性能的效果，并已在文献中报导。如果将足够的GH连续给予生长期动物(例如，按天注射)，那么最终结果是瘦体重增加速率和效率的提高。如果将足够的外源GH连续给予哺乳期奶牛(例如按天注射)，其产乳效果明显表现为牛奶产量的提高。在引用的所有例子中，都需要在持续时期内给予大量GH以便看到合成代谢或产乳效果。其一方面的原因是大量外源GH会导致GH级联(促生长素抑制素和IGF1)的负效应，从而减少垂体前叶产生的内源GH。因此，所给外源GH必须不仅足够取代由垂体前叶产生的常规GH日量，还要使GH水平高于动物中正常情况下存在的GH。除了其合成代谢效应，文献中还报导过GH对免疫系统有积极效果。在淋巴细胞和网状内皮系统的细胞中已鉴定到了GH和IGF受体。体外研究表明用GH和IGF-1进行刺激后，都能提升淋巴细胞的增殖。已证明GH是胸腺细胞成为成熟T淋巴细胞的关键因素，并能使动物在用脂多糖处理后免于内毒素休克。基因免疫接种是直接将细菌质粒接种到哺乳动物宿主的组织中。当这些细菌质粒含有真核表达盒时，会表达基因产物，并产生几种生物效应之一。如果所编码的基因产物对于宿主是异源的，表达带来的一个后果是诱导免疫应答。基因免疫接种已成功地用于诱导抗体以及针对多种潜在病原微生物的基因产物的细胞毒性T淋巴细胞应答。表达产物的其他生物学后果取决于基因产物是否为激素的一个酶。那样的话，表达产物会作用于宿主中存在的其正常生理目标。少有对利用基因免疫接种来递送生物活性分子的报导，但已描述过编码激肽释放酶的cDNA对血管高血压的缓解作用。虽然经基因免疫接种施用的质粒DNA在宿主中保持时间长，但并未显示出能在体内表达显著量的所编码的基因产物。因此，在一个象GH级联这样的生物系统中，当由于外源供应(例如GH)而导致介导物水平提高时，造成生理产量下降，基因免疫接种也许不能产生足够的蛋白质来代替内源水平并使其水平高于正常生理标准。在过去几年内，全世界已有许多研究人员相当成功地利用裸DNA(含有编码目的蛋白质的真核表达盒的细菌质粒)来免疫动物。优选的递送技术是肌内注射DNA溶液，或将金颗粒包裹DNA的轰击递送至动物的真皮内。我们已初步成功地用编码病毒糖蛋白、细胞因子或牛生长激素(bST)的裸DNA免疫接种了鼠或猪。但是，几乎没有国外研究人员或者我们自己也不能最终证明，通过这一机制递送的细胞因子或生长激素能在宿主内达到足够高的血清水平，从而诱导适当的生物应答(例如由于外源生长激素造成的性能增强)。今年早先在猪中注射编码bST的质粒的实验表明，产生了足够的牛生长激素从而在约50％的免疫动物之血清中诱导出高滴度抗bST抗体。由于外源给予该蛋白质造成内源生长激素血清水平的少量提高，用足量粗蛋白质喂养的猪生长率提高，我们决定利用一种已充分表征并且灵敏的生长筛选模型来确定肌内(i.m.)注射裸质粒pST-DNA是否能提高猪的平均日增重(ADG)和饲料利用率(FE)。直接用编码真核表达盒的细茵质粒接种动物已被证明是一种能产生针对多种蛋白质抗原(Rev1)的免疫应答的有效方法。通过简单的盐溶液注射或通过粒子轰击递送DNA沉积其上的小惰性(金)珠，就可以用纯化过的质粒DNA接种组织。任何一种类型的递送之后，接种位点周围的主要细胞型通常都被转染，并表达真核表达盒所编码的基因产物。在注射针递送的情况下，接种的一般途径是肌内，肌细胞是主要的转染细胞。转染的方法有争议，但似乎肌细胞能从胞外环境中活跃地摄取注射的DNA(2-4)。相反，粒子轰击递送能将DNA导靶到表皮，主要的细胞型是角质细胞(5)。粒子轰击递送比针头递送更加有效，只要1/1000倍至1/100倍的DNA，主要是因为DNA被直接注入角质细胞的胞浆(6，7)。这两种DNA免疫接种方法的另一显著差别反映了转染的原代细胞型的体内半寿期。接种到肌肉组织的质粒DNA仍是可测的，并在1年甚至更长时间内保持转录活性(8，9)。而粒子轰击递送的DNA多数在接种几周内由于宿主表皮层的自然脱落过程而丢失。对于DNA免疫接种应用的多数描述集中在其诱导针对所编码蛋白质的抗体(Ab)和细胞毒性T淋巴细胞(Tc)的能力上(Rev1)。有趣的是这些免疫反应的诱导基本上不依赖于接种位点周围的转染细胞，而是主要取决于来源于宿主骨髓的体细胞。这暗示负责诱导免疫反应的转染细胞是位于接种位点的转染了的抗原递呈细胞(apc)(10)。更可能或更起作用的效果是某些DNA被导向从接种位点流出的淋巴组织，并转染那里的长寿命、有效的apc(比如树突细胞)。很少有研究人员描述过DNA免疫接种作为调节蛋白质(比如激素和细胞因子)的持续递送载体的用途。文献中少有成功的报导涉及在大鼠中脱辅基脂蛋白A的血清水平上升(11)，通过将编码鼠白细胞介素10的质粒接种至感染小鼠角膜来下调疱疹性基质角膜炎(12)，以及表达激肽释放酶基因作为心血管和肾脏疾病中高血压的疗法(13)。考虑到我们利用DNA免疫接种成功地给猪和啮齿动物接种疫苗的初步成功，我们决定研究将这项技术作为牛生长激素的递送方法。优选加入本发明所述组合物的蛋白质或肽是胰岛素和胰岛素样生长因子、干扰素、生长激素释放因子、白细胞介素等。最优选的是生长激素或促生长素，尤其是牛和猪的促生长素，以及生长激素释放因子。所述蛋白质或肽可以得自天然组织(“天然的”)或者通过重组技术产生(“重组的”)，并且包括具有修饰或改变的氨基酸序列的蛋白质或肽。关键特征是蛋白质或肽能在其给药的物种中保持生物活性。发明概述本发明提供了一种将编码非人脊椎动物肽激素或细胞因子的裸DNA或RNA分子导入非人脊椎动物，以完成所述非人脊椎动物肽激素或细胞因子的递送的方法。在一个实施方案中，本发明涉及一种将所需生理活性蛋白质、多肽或肽生长激素或细胞因子递送至非人脊椎动物的方法，包括将与启动子可操纵地连接在一起的非感染性、非免疫原性、非整合性DNA序列注射到所述脊椎动物肌肉内，其中所述DNA序列编码生长激素或细胞因子，其中DNA序列不与协助转染蛋白质、病毒颗粒、脂质体制剂、带电荷脂类和磷酸钙沉淀剂结合，籍此所述DNA序列得以表达。在一个优选实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物。在另一个优选实施方案中，所述生长激素或细胞因子选自猪生长激素、牛生长激素、犬生长激素、牛IGF-1、猪IGF-1、犬IGF-1、牛生长激素释放因子、猪生长激素释放因子以及犬生长激素释放因子。在一个更优选的实施方案中，所述生长激素或细胞因子具有与所述脊椎动物的天然生长激素或细胞因子相同的氨基酸序列。发明详述本发明涉及将编码非人脊椎动物肽激素或细胞因子的裸DNA或RNA分子导入非人脊椎动物，从而递送所述非人脊椎动物肽激素或细胞因子。在一个实施方案中，本发明涉及一种将所需生理活性蛋白质、多肽或肽生长激素或者细胞因子递送至非人脊椎动物的方法，包括将与启动子可操纵地连接在一起的非感染性、非免疫原性、非整合性DNA序列注射到所述脊椎动物肌肉内，其中所述编码生长激素或细胞因子的DNA序列不与协助转染的蛋白质、病毒颗粒、脂质体制剂、带电荷脂类和磷酸钙沉淀剂结合，所述DNA序列从而得以表达。在一个优选实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物，生长激素或细胞因子选自猪生长激素、牛生长激素、犬生长激素、牛IGF-1、猪IGF-1、犬IGF-1、牛生长激素释放因子、猪生长激素释放因子以及犬生长激素释放因子。在一个更优选的实施方案中，所述生长激素或细胞因子具有与猪生长激素、牛生长激素、犬生长激素、牛IGF-1、猪IGF-1、犬IGF-1、牛生长激素释放因子、猪生长激素释放因子以及犬生长激素释放因子相同的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中，所述生长激素或细胞因子具有与所述脊椎动物的天然生长激素或细胞因子相同的氨基酸序列。在美国专利5580859中描述了实施本发明所需的材料和方法，此处以及以下的实施例中全文引用该专利。当然，本领域的技术人员利用完善和常规技术，很容易将编码目的生长激素和细胞因子的DNA或RNA替换为美国专利5580859或以下实施例中描述的一个载体。毫无疑问，目的生长激素或细胞因子的氨基酸序列已知时，通过化学合成或者利用与该氨基酸序列的一部分对应的简并合成探针从基因组或cDNA文库中分离目的基因，从而获得编码它们的DNA或RNA对于本领域技术人员是公知常识。下列生长激素的氨基酸序列，以及在某些情况中是编码这些生长激素的多核苷酸分子的核苷酸序列在以下出版物(其内容此处全文引作参考文献)中可以找到猪生长激素EP0104920；犬生长激素DE4303744；牛生长激素释放因子EP0212531；猪生长激素释放因子Bvaskin等，动物科学杂志(1997)75(8)2285。由于猪、牛和犬的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的氨基酸序列与人IGF-1相同(Weller等，生物化学遗传学12047105，1994)，知道了人IGF-1的氨基酸序列就能合成编码猪、牛或犬的IGF-1基因，这对本领域技术人员来说是显而易见的。在美国专利5070075中公开了人IGF-1的氨基酸序列。提供以下实施例作为例证而非意在限制。实施例实施例1制备表达猪细胞因子基因的质粒裸DNA技术可用于免疫接种(Donnelly,Ulmer等，1994；Hassett和Whitton,1996；Fazio1997；RobinsonGinsberg等，1997)和作为蛋白质递送系统(Hengge,Chan等，1995；Wang,chao等，1995；Lawson,Yeow等1997)。为了利用裸DNA技术在猪体内表达调节分子，比如细胞因子，构建了一系列为表达猪细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFNK、IL-1υ、IL-5、IL-6和GM-CSF基因而设计的质粒。材料与方法材料利用NaOH/SDS从大肠杆菌中分离质粒DNA，随后通过CsCl梯度离心或QIAGEN柱进行纯化。从琼脂糖凝胶中电洗脱片段，并用NACS52PREPAC柱(GIBCOBRL)纯化。所有限制和修饰酶依照制造商的说明使用。细胞因子基因由D.Strom提供，收到时是克隆在基于pUC的载体中的BamHI/EcoRI片段。含有来自假狂犬病病毒(PRV)的gⅢ基因的质粒pSph2B9由D.Thomsen惠赠。在补充有10％热灭活胎牛血清的DMEM中培养PK15和Vero细胞。依照制造商建议的方案用LIPOEFCTAMINEReagent(GIBCOBRL)转染PK15和Vero细胞。48和/或72小时后检测细胞和培养物上清液中gⅢ和细胞因子的表达。ELISA方法按照前面的描述采用双层夹心ELISA检测细胞上清液中的IFNK。病毒抑制实验将以每毫升2.5×105个细胞的密度重悬的PK15细胞分装入6孔培养板，每孔2ml，并使其生长过夜。第二天，用补充2％热灭活胎牛血清的DMEM洗细胞。用750ml相同培养基加上250ml来自瞬时表达培养物的培养物上清液将细胞预处理过夜。阴性上清液来自模拟转染。阳性对照含有不同量的纯化的、来源于杆状病毒的蛋白质。预处理后，用培养基洗涤细胞，然后用PRV的稀释液感染1小、时，稀释液设定每孔产生大约50个噬斑。然后用含有1.5％LMP琼脂糖的Gibco培养液199覆盖孔，并再温育2天。通过用含有1.5％LMP琼脂糖和0.01％酚红的Gibco培养液199覆盖来使病毒噬斑显迹。噬斑在5-6小时内可见。转染细胞单层的免疫过氧化物酶染色按照以上描述转染Vero细胞。等表达一段时间，48-72后，将细胞洗涤并固定在培养板底部。然后用特异于目的蛋白质的初级抗体处理培养板。将培养板洗涤，利用标记HRPO的抗种属IgG偶联物来检测结合的抗体。用于最终检测步骤的底物是溶于含有过氧化氢的乙酸盐缓冲液的3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)。拍摄记录数据。质粒构建重新设计质粒p3CI和p3CL有两个目的。第一个是使几个以BamHI/EcoR1片段存在的细胞因子基因容易克隆。第二是制备能表达与这些细胞因子符合读框地融合在一起的部分PRVgⅢ蛋白的第二代载体(图l和2)。如下达到这些目的。将质粒p3CI用EcoR1消化，用Klenow补平末端，并连接。这去掉了CMV启动子5，方向的唯一的EcoR1位点，并以XmnI位点代替。然后用HindⅢ和SalI消化该质粒p3CIa1，将其连接至接头PFR1-2从而产生质粒p3CIa。按照以上描述操作质粒p3CL以产生p3CLb。这些质粒适合克隆BamHI/EcoR1细胞因子片段(图3)。然后将包含去掉跨膜区域的完整PRVgⅢ基因的HindⅢ腿paI片段导入p3CIa和p3CLb，从而制备到质粒p3CIag和p3CLbg。克隆到该质粒中的BamHI/EcoR1细胞因子片段将表达为gⅢ-细胞因子融合蛋白(图4)。免疫刺激基元免疫刺激或CpG基元是通常遵循通式5’-PurPurCGPyrPyr-3’的短核苷酸序列。据报导，存在于注射DNA中时，这些基元能增强对所表达基因产物的TH1应答(SHa，Beard等，1977；Krieg，Yi等，1995；Krieg，1996；Pisetsky,1996；Yi,Chace等，1996；Klinman，Yamshchikov等，1997；Roman，Martin-Orozco等，1997)。甚至已表明缺少这些CpG基元的DNA不能刺激典型的TH1细胞因子反应曲线(Sato，Roman等，1996)。我们分析了p3CIa和p3CLb的序列是否存在免疫刺激或CpG基元。分析是用威斯康星大学GCG包的Findpatterns程序进行的。在每个质粒中检测7例该基元。体外表达采用LIPOFECTAMINEReagent用p3CIa、p3CIa/IFNg、p3CIag、p3CIag/IFNg、p3CLb、p3CLb/IFNg，p3CLbg和p3CLbg／IFNg转染Vero细胞。通过ELISA检测培养物上清液中IFNg的表达(图5)。从p3CIa/IFNg和p3CLb/IFNg转染的培养上清液中很容易检测到IFNg。来自包含携带gⅢ-IFNg融合体之质粒的转染物的结果较不显著。检查被转染的细胞单层，以便确定在上清液中检测到的gⅢ-IFNg融合蛋白水平较低是由于蛋白不能运输到细胞外。从培养板中吸出培养物上清液后，将细胞固定并利用gⅢ和IFNg的单克隆抗体进行免疫过氧化物酶染色。结果支持了这一想法，即gⅢ和gⅢ-IFNg融合蛋白没有IFNg本身那么容易外运。证明了gⅢ、IFNg和gⅢ-IFNg基因的表达后，我们想检测体外产生的基因产物是否有生物活性。在病毒抑制实验中使用了来自PK15细胞转染物的上清液。由IFNg质粒产生的转染上清液与模拟转染物以及纯化IFNg处理相比，确实使PRV噬斑数量减少。而gⅢ-IFNg融合转染物并未显示出任何显著的抑制(图6)。这可以归因于在这些构建体中看到的低表达水平。也可能是融合蛋白本身就比天然蛋白活性低。其余Vero细胞用携带IL-2、IL-4和IL-10细胞因子的质粒进行转染。按照以上的描述对细胞单层做免疫过氧化物酶染色。转染了p3CLb*质粒并用预期基因产物的特异性抗体检测的细胞被染色。在不同转染物之间可看到表达差异，这一点由染色总量可以证明。用p3CIa*质粒进行的转染和染色得到了类似的结果。参考文献Chan,H.W.,M.A.Israel等(1979)“多瘤病毒DNA在大肠杆菌中的分子克隆λ噬茵体载体系统，”科学203887-892。Donnelly,J.J.,J.B.Ulmer等(1994)“DNA免疫接种”免疫学方法杂志176(2)145-52。Fazio,V.M.(1997)“用于基因免疫接种抗感染性疾病疫苗的裸DNA转移技术”反转录病毒学148(2)101-8。Hassett,D.E.和J.L.Whitton(1996)“DNA免疫接种”微生物学进展4(8)307-12。Hengge，U.R.，E.F.Chan等(1995)“注射裸DNA后细胞因子基因在表皮中表达的生物学效应”自然遗传学10(6月)161-166。Israel，MA.，H.w.Chan等(1979)“多瘤病毒DNA在大肠杆茵中的分子克隆λ噬茵体载体系统”，科学203887．892。Klinman，D.M.，G.Yamshchikov等(1997)℃pG基元对DNA疫苗的免疫原性的影响”免疫学杂志158(8)3635-9。Krieg，A.M.(1996)“原核DNA中的CpG二核苷酸基元对淋巴细胞的激活”微生物学进展4(2)73-6。Krieg，A.M.，A.K.Yi等(1995)“细菌DNA中的CpG基元触发直接B细胞活化”自然374(6522)546-9。Lawson，C.M.，W.Yeow等(1997)“通过肌内注射裸DNA在体内表达感染素α基因”感染素和细胞因子研究杂志17255-2610Pisetsky,D.S.(1996)“DNA的免疫学特性”免疫学杂志156(2)421-3。Robinson,H.L.，H.s.Ginsberg等(1997)DNA用于免疫的科学前景，http//www.asmusa.org/acasrc/acal.htm．Roman，M.，E.Martin-Orozco等(1997)“免疫调节性DNA序列作为T辅助细胞-1-增强佐剂”自然药物3(8)849．854。sato，Y.，M.Roman等(1996)“有效皮内基因免疫接种所需的免疫调节性DNA序列”科学273(5273)352-4。Sun,S.，C.Beard等(1977)“来自不同生物的DNA”免疫学杂志1593119-3125。wang,C.，L.Chao等(1995)“人组织激肽释放酶的直接基因递送降低了自发高血压大鼠的血压”临床研究杂志95(4月)1710-1716。will，H.，R．cattaneo等(1982)“克隆的HBVDNA引发黑猩猩肝炎”自然299740-742。Yi，A.K，J.H.Chace等(1996)“IFN-γ促进应答细菌DNA和寡核苷酸中的CpG基元时IL-6和IgM的分泌免疫学杂志156(2)558-64。实施例2向小鼠和猪中注射仅表达抗原的质粒或者既表达细胞因子又表达抗原的质粒裸DNA技术，或者按照现在所称的基因免疫接种，是由哺乳动物细胞自主摄取和表达被注射的DNA从而产生免疫应答。该技术近来非常流行，并已被应用于多种病毒和某些细菌、寄生虫(Lopez-Macias，Lopez-Hernandez等，1995；Yang，Waine等1995；Huygen，Content等，1996；Tascon，Colston等，1996；Kurar和Splitter,1997；Lai，Pakes等，1997；Luke，Carner等，1997；Strugnell，Drew等，1997)。在对注射的应答中几乎总能看到特异抗体的产生，并且经常伴有CTL应答。许多情况中，这会产生针对所研究病原体的攻击的防护作用(Robinson，Ginsberg等，1997)。关于将细胞因子与质粒DNA共同给药的报导表明有可能根据所用细胞因子来调节免疫应答(Irvine，Rao等，1996；Ramsay和Ramshaw1997)。其他研究人员曾尝试通过同时注射细胞因子和抗原DNA(Stevenson，zhu等，1995；Xiang和Ertl1995)或表达抗原/细胞因子融合体的DNA(Maecker,Umetsu等，1997)，利用细胞因子改变免疫应答。导入编码细胞因子或其他蛋白质的DNA已用于医疗目的(Raz，watanabe等，1993；Raz,Dudler等，1995；Sun,Burkholder等，1995；Keller,Burkholder等，1996；Vermeij和Blok1996；Daheshia，Kuklin等，1997)。材料与方法质粒用于该项研究的质粒在以上实施例1中已描述。采用NaOH／SDS从大肠杆菌中分离质粒DNA，随后经CsCl梯度离心或QIAGEN柱纯化。要储存时，将DNA以高浓度重悬于TE(10mMtris0.1mMEDTA，pH=8．0)。要注射给动物，则将DNA在PBS中稀释至所需浓度。EISA方法按照前面的描述，用结合在微量培养板上的纯化过的蛋白质经间接ELISA检测抗-IFNK和抗KⅢ。接种动物在用质粒DNA接种前7天用PBS或布比卡因(％)将小鼠预处理。DNA经4次25μl注射导入四头肌。用18号注射针将DNA在大腿经肌肉注射给猪。检查各种参数以便确定能得到最佳结果的技术(图2)。在这些实验中以针全长的深度每次2mi注射1mgDNA。结果与讨论小鼠实验我们首先在小鼠中研究了我们的构建体之体内表达情况。这样做的主要原因考虑是实验规模。用小鼠我们能考察更多参数，比如有或没有内含子的质粒以及每次注射DNA用量不同。我们还能评估有关注射到再生肌肉组织比正常肌肉基因表达更高的报道(Acsadi,Dickson等，1991；Wang,Ugen等，1993；Danko和Wolff，1994；Wang，Merva等，1994)。按照以上描述，在注射7天前，用PBS或布比卡因预处理小鼠。然后给它们注射不同量的8种质粒(p3CIa、p3CIag、p3CIa/IFNg、p3CIag/IFNg、p3CLb、p3CLbg、p3CLb/IFNg、p3CLbg/IFNg)。2周后给小鼠取血，经ELISA检测针对PRVgⅢ的抗体(图7)。DNA用量增加产生更强的免疫应答。我们没有看到由质粒是否含有内含子造成的应答的差异。可能最感兴趣的结果是注射前用PBS或布比卡因处理产生的应答。在布比卡因组中没有显著提高。实际上，某些组对PBS显示出更强的应答。这是出乎意料的，并且与已公开的报道相反。因此注射技术和持续击打肌肉的必要性与应答直接相关。猪实验对注射技术进行研究以便确定注射的次数、深度或体积对gⅢ质粒DNA引发的免疫应答是否有影响。给猪肌肉内注射1mgp3CIag或p3CLbgDNA，每次DNA浓度为0.5mg/ml。对在不同深度和不同体积进行的多次与一次注射进行了比较(图8)。3周后动物接受一次加强免疫。首次注射后3周和6周给动物取血，经ELISA检测抗gⅢ抗体。最终结果表明使用18号注射针以全长进行的2ml单次注射得到最佳结果。在猪中进行一次与在小鼠中做的类似的实验，但规模没有这样大。简言之，以2ml体积将5个不同浓度的质粒p3CIag和p3CLbg注射到猪体内(见上文)。3周时，将动物加强免疫，6周时，经ELlSA检测针对PRVgⅢ的抗体(图9)。可见到针对DNA浓度增加导致应答增强的一般趋势，但对相同处理的个体之间的应答差异很大。同样，构建体中有或没有内含子没有明显影响。设计了两个实验来考察注射携带细胞因子基因的质粒DNA的生物学效果。一项研究包括给猪注射质粒p3CIa/GM-CSF，并查找PMN数量和条带的变化。对照只注射PBS。每组中有6头猪。每天给猪取血，确定PMN的数量和条带。预期的结果是在GM-CSF组中看到PMN增加。个体应答之间的巨大差别使得不能得出任何统计学显著性结论。但在GM-CSF组中的确呈现PMN的少量压抑(图10)。另一项研究比较了用p3CIag、p3CIag/IL-1B、p3CLbg、p3cLbg/IL-1B和PBS对猪体温的影响。除了不注射组为3头猪，每组包含6头猪。在15天内每天给猪测量体温，在实验的最后一天取血。为了证实嵌合gⅢ/IL-1B蛋白质的表达，还用PRVgⅢ的特异性抗体进行测量。同样，个体应答的不一致使得不能对IL-1υDNA的可能影响作出任何有意义的结论(图11)。然而，所有处理组中都存在PRVgⅢ的特异性抗体，表明在注射了质粒DNA的猪中都产生了gⅢ和嵌合gⅢ/IL-1B蛋白质(图12)。参考文献Acsadi，G.，G.Dickson等(1991)，“肌内注射DNA构建体后mdx小鼠中人肌营养不良蛋白的表达”，自然352(6338)815-8。Daheshia,M.，N.Kuklin等(1997)，‘局部给予编码IL-10的质粒DNA来抑制进行性眼部炎症”，免疫学杂志159(4)1945-52。Danko,I.和J.A.Wolff(1994)，“将基因直接转移至肌肉”疫苗12(16)1499-502。Huygen，K.，J.Content，等(1996)，“肺结核DNA疫苗的免疫原性和预防效果，”自然药物2(8)893-8。Irvine,K.R.,J.B.Rao，等(1996)，“DNA免疫接种使细胞因子增强导致有效治疗已有的肺部转移性病灶”，免疫学杂志156(1)238-45。Keller,E.T.,J.K.Burkholder等(1996)，“向犬的口腔粘膜和表皮进行的体内颗粒介导的细胞因子基因转移，”癌症基因疗法3(3)186-91。Kurar.E.和G.A.Splitter(1997)“核酸接种布鲁氏杆菌流产胎核糖体L7/L12基因引发免疫应答，”疫苗15(17-18)1851-7。Lai,W.C.,S.P.Pakes等(1997)，“DNA免疫接种对感染了支原体肺炎的遗传易感性小鼠的医疗效果，”免疫学杂志158(6)2513-6。Lopez-Macias,C.,M.A.Lopez-Hernandez等(1995)，“通过裸DNA免疫接种诱导抗伤寒沙门氏杆菌OmpC孔蛋白的抗体”，AnnNYAcadSci772285-8。Luke,C.J.,K.Carner等(1997)，“基于OspA的DNA疫苗保护小鼠抗burgdorferi疏螺旋体传染，”传染病杂志175(1)91-7。Maecker,H.T.,D.T.Umetsu等(1997)，“DNA免疫接种细胞因子融合构建体使对卵清蛋白的免疫应答改变，”疫苗15(15)1687-96。Ramsay,A.J.和I.A.Ramshaw(1997)，“细胞因子使免疫应答增强对免疫避孕重要性”ReprodFertilDev9(1)91-7。Raz,E.,J.Dudler,等(1995)，“通过递送细胞因子基因调节鼠类系统红斑狼疮的疾病活性(diseaseactivity)，”狼疮4(4)286-92。Raz,E.,A.Watanabe，等(1993)，“注射到骨骼肌的细胞因子基因的系统免疫学效应，”美国科学院学报90(10)4523-7。Robinson,H.L.,H.S.Ginsberg，等(1997)，DNA用于免疫的科学前景，http//www.asmusa.org/acasrc/acal.htmStevenson,K.,D.Zhu等(1995)，“一种给B细胞淋巴瘤特应接种的基因方法，”AnnNYAcadSci772212-26。Strugnell,R.A.,D.Drew，等(1997)，“用于细菌感染的DNA疫苗”，免疫细胞生物学75(4)364-9。Sun.W.H.,J.K.Burkholder，等(1995)，“通过基因枪进行的体内细胞因子基因转移减少小鼠中的肿瘤生长，”美国科学院学报922889-93。Tascon,R.E.,M.J.Colston，等(1996)，“DNA注射抗肺结核免疫接种，”自然药物2(8)888-92。Vermeij,P.和D.Blok(1996)，“新的肽和蛋白质药物，”药物世界科学18(3)87-93。Wang,B.,M.Merva，等(1994)，“DNA接种诱导体内免疫应答对用HIV-1抗原表达细胞刺激的细胞的保护，”AIDS研究人类反转录病毒10(2)S35-41。Wang.B.,K.E.Ugen等(1993)，“基因接种产生对1型人类免疫缺陷病毒的免疫应答”美国科学院学报90(9)4156-60。Xiang,Z.和H.C.Ertl(1995)，“通过共接种表达细胞因子的质粒来调节对质粒所编码的病毒抗原的免疫应答，”免疫2(2)129-35。Yang,W.,G.J.Waine等(1995)，“接种核酸所诱导的Schistosomajaponicum(亚洲血吸虫)副肌球蛋白的抗体，”生物化学与生物物理研究通讯212(3)1029-39。实施例3编码pST的裸DNA导入猪的效果材料与方法从PNU饲养场获得80只断奶的杂种约克郡猪(40只母猪，40只公猪)。当动物体重(BW)达到25-30kg时，将它们按体重和性别分成5群，每群每种性别8头猪。在每群中，将每种性别两头猪随机分配到每群4个圈中的一个。从适应期(给予pST或基因免疫接种前1周)开始让猪随意取食24％的粗蛋白(CP)。这个量的粗蛋白能保证供给充足的氨基酸以防止由外源pST处理造成的主动取食减少。7天的适应期后，将猪称重(0天)，然后一群内的每圈猪(pen)或者不注射(对照)，或者在42天内每天肌内注射1-2ml含有60μg/ml重组pST/kgBW的盐水，3只每两周肌内注射2ml含有1mg裸质粒pSTDNA的盐水，或5只每周肌内注射2ml含有100μg裸质粒pSTDNA+8μg布比卡因。后一种配方是希望利用最近报道的一种现象，即低浓度布比卡因在与DNA混合时能自动形成脂质体。每一群内的处理圈在处理的第一天随机分配。每周测定猪的日均增重(ADG)。，通过实验结束时饲料的重量与开始时重量加上添加的饲料之比来确定饲料利用情况。饲料利用率BW的增加代表饲料效率。13周后当多数动物接近110-120kg时结束实验。通过测量第1、10和最后一块(lumber)肋骨、以及第10和11肋骨之间的腰眼区域的背部脂肪厚度来分析对照组和裸DNA处理组的公猪的畜体质量。结果示于表1。结果在实验的前10个周内，与对照相比DNA处理组均显示出升高的体重增加。从第11周，它们保持先前取得的体重优势，但与对照相比不再有提高。较之对照，饲养效率没有明显的变化。因此它们与普通猪吃了相同量的食物而产生这样的体重变化。每天给予pST可能导致食欲下降，因为DNA处理猪食量没有减少，它们的pST水平不会接近注射60μg/kg蛋白pST产生的pST水平。对照与裸DNA处理组在畜体组成上没有明显变化。这可能有几种解释。裸DNA处理组在最后三周的生长方式似乎没有差别。如果裸DNA停止产生，猪会迅速恢复普通猪的肥瘦布局。因此预期的瘦肉增加和脂肪减少的变化可能存在于10周后。或者也可能pST的表达并没有消失，而是这个阶段的猪对裸DNA产生的低量pST停止应答(一种在其他物种接近生长末期时看到的现象)。因此，裸DNA为前10周产生了足够的pST从而使体重比对照增加了将近2-5％。其优势在于猪能比预期早5-7天上市，导致人力物力的节约。很显然可以不同于前面说明书和实施例中的具体描述来实施本发明。在以上教导的提示下可以对本发明作出各种改变和变化，因此在本发明的范围内。文中引用的全部出版物此处全文引作参考文献。表1体重增加<tablesid="table1"num="001"><table>天对照1对照stdevs60μg/kgr-pstr-pststdevs1mgpstDNA1mgstdevs100μgpstDNA0.1mgstdevs033.12.7833.982.8633.943.4234.323.06739.23.1240.783.2640.452.7640.002.591445.53.3047.843.1146.603.1646.682.742151.03.6154.292.1852.313.1052.522.892857.53.9262.052.1859.493.2959.523.363563.94.0969.702.0165.853.5065.83.064270.63.4477.962.8672.943.9773.03.04976.63.7880.623.0378.814.3378.933.015681.53.7885.593.3084.894.4685.112.856388.74.0791.62.8491.314.3192.603.217095.44.8599.223.7598.774.6899.293.2277101.24.43104.763.66104.564.50105.422.5784108.84.70112.193.54111.344.30112.253.4591115.63.33118.153.93117.935.63118.183.73</table></tables>权利要求1．一种向非人脊椎动物递送所需的生理活性蛋白质、多肽或肽生长激素或者细胞因子的方法，包括将与启动子可操纵地连接在一起的非感染性、非免疫原性、非整合性DNA序列注射到所述脊椎动物肌肉内，其中所述DNA序列编码生长激素或细胞因子，其中所述DNA序列不与协助转染的蛋白质、病毒颗粒、脂质体制剂、带电荷脂类和磷酸钙沉淀剂结合，籍此使所述DNA序列表达。2．权利要求1的方法，其中所述脊椎动物是哺乳动物。3．权利要求1的方法，其中所述生长激素或细胞因子选自猪生长激素、牛生长激素、犬生长激素、牛IGF-1、猪IGF-1、犬IGF-1、牛生长激素释放因子、猪生长激素释放因子以及犬生长激素释放因子。4．权利要求3的方法，其中所述生长激素或细胞因子具有与所述脊椎动物天然生长激素或细胞因子相同的氨基酸序列。5．权利要求4的方法，其中所述生长激素或细胞因子是猪生长激素，所述脊椎动物是猪。6．权利要求4的方法，其中所述生长激素或细胞因子是牛生长激素，所述脊椎动物是牛。7．权利要求4的方法，其中所述生长激素或细胞因子是犬生长激素，所述脊椎动物是犬。8．权利要求4的方法，其中所述生长激素或细胞因子是牛IGF-1，所述脊椎动物是牛。9．权利要求4的方法，其中所述生长激素或细胞因子是猪IGF-1，所述脊椎动物是猪。10．权利要求4的方法，其中所述生长激素或细胞因子是犬IGF-1，所述脊椎动物是犬。11．权利要求4的方法，其中所述生长激素或细胞因子是牛生长激素释放因子，所述脊椎动物是牛。12．权利要求4的方法，其中所述生长激素或细胞因子是猪生长激素释放因子，所述脊椎动物是猪。13．权利要求4的方法，其中所述生长激素或细胞因子是犬生长激素释放因子，所述脊椎动物是犬。14．权利要求1的方法，其中所述DNA不需递送载体来协助该DNA进入细胞。15．权利要求1的方法，其中所述DNA包含一个质粒。16．权利要求1的方法，其中所述启动子是细胞特异性或组织特异性启动子。17．权利要求1的方法，其中所述肌肉是骨骼肌。18．权利要求1的方法，其中所述注射包括经皮将所述DNA压入。19．权利要求1的方法，其中所述注射包括通过针来注射DNA。20．权利要求1的方法，其中所述注射包括将该DNA注射到所述肌肉的间质区，导致所述DNA转染入脊椎动物的肌肉细胞。21．权利要求1的方法，其中所述DNA可操纵地连接一个编码信号肽的DNA序列，其中该信号肽引导生长激素或细胞因子的分泌。22．权利要求1的方法，其中所述生长激素或细胞因子的表达是瞬时的。23．权利要求1的方法，其中所述生长激素或细胞因子产生至少一个月。全文摘要本发明涉及编码非人脊椎动物肽激素或细胞因子的裸DNA或RNA分子向非人脊椎动物导入,以实现非人脊椎动物肽激素或细胞因子的递送的方法。本发明由此提供了另一种直接施用目的多肽的方法。文档编号A61K48/00GK1297481SQ99805215公开日2001年5月30日申请日期1999年4月15日优先权日1998年5月6日发明者S·马丁,P·F·罗素申请人:法玛西雅厄普约翰美国公司