抗血管生成蛋白及其应用的制作方法

专利名称：抗血管生成蛋白及其应用的制作方法
涉及的申请本申请要求美国临时申请60/089,689,(1998年6月17日)，及美国临时申请60/126,175(1999年3月25日)的所有权利，它们全部的技术内容通过在此处引述而合并于本文。
背景技术：
血管基底膜由胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、纤连蛋白和触觉蛋白等大分子物质组成(Timpl,R.,1996，现代细胞生物学观点8:618-24)。功能上胶原蛋白可以促进细胞粘连、转移、异化、生长(Paulsson,M.,1992,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.27:93-127)，并且通过这些功能在血管生成过程中的内皮细胞繁殖和行为发面起重要作用，血管生成作用是指新血管组织在原有血管组织上形成的过程(Madri,J.A.et al.,1986,J.Histochem.Cytochem.34:85-91；Folkman.J.,1972,Ann.Surg.175:409-16)。血管生成作用是一个复杂的过程,它指内皮细胞的生长、转移、繁殖，及生长的内皮细胞异化成为管状结构，并且在正在生长的血管组织周围形成膜状基体的过程。此外血管生成作用还可在一些正常生理现象，如损伤修复、子宫内膜重建过程重要作用(Folkman,J.et al.,1995,J.Biol.Chem.267:10931-34)。现在已明确证明血管生成在大于几个立方毫米的固体肿瘤的生长和转移的过程中起作用(Folkman,J.,1972,Ann.Surg.175:409-16；Folkman,J.,1995,Nat.Med.1:27-31)。一些研究显示，胶原蛋白代谢的抑制剂有抗血管生成的特性，证实了膜的胶原蛋白合成、及沉积对血管组织的生成和生长是很关键的理论(Maragoudakis,M.E.et al.,1994,Kidney Int 43:147-50；Haralabopoulos,G.C.et al.,1994,Lab.Invest.71:575-82)。但是胶原蛋白在基质膜的组成和血管形成中的准确地位仍不清楚。
本发明概述本发明涉及有抗血管生成功能的Ⅳ型胶原蛋白α链的NCⅠ区的蛋白。本发明尤其涉及Arresten,Canstatin,Tumstatin等新发现的蛋白，及它们的有生物活性(如抗血管生成作用)的片段、突变体、类似物、同系物及它们的衍生物、多聚体(如二聚体)和融合蛋白。这些蛋白都包含了Ⅳ型胶原蛋白NC1区的C末端片段。更确切的说，Arrestem,Canstatin和Tumstatin分别是Ⅳ型胶原蛋白的α1、α2、α3链各自的NC1区的C末端片段。这三种蛋白都是单体蛋白，它们在体内实验中抑制肿瘤生长，在体外包括内皮管状生长实验在内的几种实验中也抑制毛细血管的增生。
本发明包括了经分离和重组生成的Arresten(一般也称为Arrestin)。Arresten包含Ⅳ胶原蛋白的α1链的NC1区，有抗血管生成(增生)的活性，还包括分离Arresten中得到的有抗血管生成功能的它的片段，片段多聚体，及编码抗血管生成蛋白的多聚核苷酸(核酸)。此外本发明也包括含有以分离的Arresten，其抗血管生成的片段，或二者同时作为生物活性成分的组合物。从另一方面讲，本发明提供了一治疗哺乳动物中繁殖型病如癌症的方法，而癌症的特点之一是血管生成活性，该方法包括向哺乳动物给予包含抗血管生成性的Arresten或其片段。抗血管生成性的Arresten及其片段也可以用于防止细胞扩散(转移)或内皮细胞的繁殖。本发明也包括了分离的抗血管生成活性的Arresten及其片段的抗体。
本发明包括了经分离和重组生成的Canstatin。Canstatin包含Ⅳ胶原蛋白的α2链的NC1区，有抗血管生成(增生)的活性，还包括分离的Canstatin的有抗血管生成功能的片段，分离的Canstatin和抗血管生成的片段的多聚体，及编码抗血管生成蛋白的多聚核苷酸。此外本发明也包括含有分离的Canstatin，其抗血管生成的片段，或二者同时作为生物活性成分的组合物。从另一方面讲，本发明提供了一治疗哺乳动物中繁殖型病如癌症的方法，而癌症的特点之一是血管生成活性，该方法包括向哺乳动物给予包含抗血管生成的Canstatin或其片段的组合物。抗血管生成的Canstatin及其片段也可以用于防止细胞扩散(转移)或内皮细胞的繁殖。本发明也包括了分离的抗血管生成的Canstatin及其片段的抗体。
本发明还包括了经分离和重组生成的Tumstatin。Tumstatin包含Ⅳ胶原蛋白的α3链的NC1区，有抗血管生成(增生)的活性，还包括分离Tumstatin的有抗血管生成功能的片段，分离Tumstatin和抗血管生成片段的多聚体，及编码抗血管生成蛋白的多聚核苷酸。此外本发明也包括含有以Tumstatin，其抗血管生成的片段，或二者同时作为生物活性成分的组合物。从另一方面讲，本发明提供了一治疗哺乳动物中繁殖型病如癌症的方法，而癌症的特点之一血管生成活性，该方法包括向哺乳动物给予含有抗血管生成的Tumstatin或其片段的组合物。抗血管生成的Tumstatin及其片段也可以用于防止细胞扩散(转移)或内皮细胞的繁殖。本发明也包括分离的抗血管生成的Tumstatin及其片段的抗体。
附图的简要说明

图1A,1B分别是人的Ⅳ型胶原蛋白α1链核苷酸序列图(图1A,SEQ ID NO:1)及氨基酸(图1B,SEQ ID NO:2)。图中标出了正向和反向引物的位置(SEQ ID NO:3),(SEQ ID NO:4)。
图2是Arresten克隆载体pET22b(+)结构图示。正向引物(SEQID NO:3)，反向引物(SEQ ID NO:4)和Arresten基因的插入位点也标出。
图3A,3B分别是Arresten和Endostatin在含有用3H标记的胸腺嘧啶的内皮细胞繁殖的曲线图。横坐标分别是Arresten(0～10微克/毫升),Endostatin(0～10微克/毫升)；纵坐标为内皮细胞(CPAE)的数量。
图4A,4B,4C,4D是Arresten和Endostatin对含用3H标记胸腺嘧啶的内皮细胞繁殖的影响的柱状图。图4A,4B,4C分别是Arresten为0～50微克/毫升(4A,4B),0～10微克/毫升(4C)对786-0,PC-3,HPEC三种细胞的作用图。图4D为0.1～10微克/毫升的Endostatin对A-498细胞的作用图。
图5A,5B,5C是一套显微照相图。显示了Arresten(2微克/毫升，5B),Endostatin(20微克/毫升，5C)对经过FBS诱导趋化的内皮细胞在人的脐部内皮细胞间转移影响的作用图。5A是没处理的对照图。
图6是图5结果的柱状图。图6分别显示Arresten(2微克/毫升，20微克/毫升)和Endostatin(2.5微克/毫升，20微克/毫升)对ECV-304内皮细胞转移的作用。
图7是Arresten对内皮管状物形成影响的作用。管状组织形成的百分比如y轴所示，抑制物的浓度如x轴显示。几组实验分别为什么也不加(对照◆)，加BSA(对照△)，加7S区(对照X)，Arresten(■)。
图8A,8B分别显示Arresten对内皮管状物形成的作用。8B中Arresten的浓度为0.8微克/毫升；8A为对照。
图9A,9B,9C,9D是Arresten和Endostatin对体内肿瘤生长的影响的曲线图。9A所示为分别用Arresten(10毫克/千克，□)和BSA(+)处理及对照(●)的小鼠体内肿瘤从700立方毫米生长的情况；9B所示为分别用10毫克/千克Arresten(□),BSA(+)处理后的肿瘤从100立方毫米增长情况；9C所示是使用10毫克/千克Arresten(□),Endostatin(▲)处理和对照(●)中肿瘤从100立方毫米增长的情况；9D所示为用Arresten(□)处理后肿瘤从200立方毫米增长的情况，(●)为对照。
图10A,10B分别是人的Ⅳ型胶原蛋白α2链核苷酸(Fig.10A,SEQ ID NO:5)与氨基酸的序列图(Fig.10B,SEQ ID NO:6)。其中正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:8)的位置也已注明。
图11所示为Canstatin的克隆载体pET22b(+)的图谱，其中正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:8)及Canstatin基因的插入位点也已注明。
图12A,12B,12C,12D分别为不同浓度的Canstatin(x轴)对内皮细胞(C-PAE)(图12A，图12C)和非内皮细胞(786-0,PC-3,HEK293)(图12B,12D)繁殖的影响图。细胞繁殖的探测用胸腺嘧啶(H3)作为标记(图12A,12C)和亚甲蓝染色(12B,12D)进行观察。
图13为柱状图，表示为每单位面积(y轴)中分别用不加VEGF(没有VEGF或血清)，加VEGF(1％FCS+10纳克/毫升)处理的细胞，用0.01 Canstatin(1％FCS+10纳克/毫升VEGF,0.01微克/毫升Canstatin)，及用1.0微克/毫升Canstatin(1％FCS+10纳克/毫升VEGF和1微克/毫升Canstatin)处理过的转移的内皮细胞的数量。
图14为分别用BSA(□),Canstatin(■)和α5NC1(○)处理的内皮管组织形成数量与对照(y轴)形成的百分比。纵轴表示平均值的均方差。
图15A,15B,15C,15D分别为Canstatin(■),Endostatin(○)和对照(□)对PC-3细胞(图15A,15B)和786-0细胞(图15C,15D)的肿瘤体积分数(y轴，15A,15B)和肿瘤体积(立方毫米，y轴，15C,15D)的影响的线状图，X轴所示为处理后的天数。
图16A,16B分别为人的Ⅳ型胶原蛋白α3链核苷酸(图16A,SEQ ID NO:9)与氨基酸(图16B,SEQ ID NO:10)的序列图。图中还注明了正向引物(SEQ ID NO:11)和反向引物(SEQ ID NO:12)的位置及Tumstatin333,Tumstatin334基因片段的起始点和终止点。
图17为Tumstatin的克隆载体pET22b(+)图谱。途中正向引物(SEQ ID NO:11)和反向引物(SEQ ID NO:12)位置及Tumstatin的基因插入位点也已注明。
图18所示为Tumstatin的突变体Tumstatin N-53中α3(Ⅳ)NC1单体的钝端氨基酸位置。实心环是产生该突变体时从Tumstatin上的N端切下的53个氨基酸残基。用短线代表的二硫健是按照其在α1(Ⅳ)NC1和α2(Ⅳ)NC1中存在的情况表示的。
图19A,19B,19C分别为用不同浓度Tumstatin处理的含H3标记胸腺嘧啶的C-PAE细胞(图19A),PC-3细胞(图19B),786-0细胞(图19C)的情况。每组值均含三个重复。
图20为不同浓度的(x轴)Tumstatin(●),BSA(对照□)，7S区(对照○)对内皮管状物形成的影响。
图21A,21B为用Tumstatin(●),Endostatin(○)处理相对于对照在处理不同天(x轴)后对肿瘤体积的影响(y轴，立方毫米)的线状图。用星号标记的数据点具有显著性，其P＜0.05。
图22为对照小鼠(□)和用Tumstatin突变体(●)处理后肿瘤的增长情况(y轴)，x轴为处理后的天数。用星号标记的数据具有显著性，其P＜0.05。
图23分别为不同浓度的Arresten(●),Canstatin(○),12 kDaArresten片段(■),8 kDa Arresten片段(□),10 kDa Canstatin片段(▲)对内皮管状物形成的抑制作用。
图24分别为不同浓度的Tumstatin333(●),Tumstatin 334(○)，BSA(■对照)，α6(□对照)，Tumstatin(▲)(x轴)对内皮管状物形成的抑制作用(y轴)。
本发明的详述不需要的血管生成往往导致许多疾病，换句话说，如果有可能在特定的条件、特定的时间、或组织制止毛细血管的生长或膨胀，许多疾病或不良状况可以被预防或减轻。基质膜的组织依赖于Ⅳ型胶原蛋白网的形成，而这种胶原蛋白网状结构可能通过Ⅳ胶原蛋白碳端(NC1区)的非胶原小球体形成(Timpl.R.,1996,Curr Opin CellBiol 8:618-24；Timpl.R.et al.,1981,Eur.J.Biochem.120:203-211)。Ⅳ型胶原蛋白由六个不同的基因产物组成，命名为α1,α2,α3,α4,α5,α6(Prockop,D.J.et al.,1995,Annu.Rev.Biochem.64:403-34)。α1,α2的同功体普便存在于人的基质膜中，而其它四种表现为有限制的分布(Kalluri,R.et al.,1997,J.Clin.Invest.99:2470-8)。
由已存在组织上形成的新的毛细血管即生血管作用，对肿瘤的生长与转移是必要的(Folkman,R.,et al.,1992,J.Biol.Chem.267:10931-4；Folkman,J.1995,Nat.Med.1:27-31；Hanahan,D.et al.,1996,Cell 86:353-64)。人和动物的肿瘤开始时是不发生血管化作用的，然而当肿瘤的体积大于几个立方毫米时，便发生血管化作用(Folkman,J.1995.Nat.Med.1:27-31；Hanahan,D.et al.,1996,Cell86:353-64)。转变为血管生成表型需要对血管发生激活子的上调节与血管生成作用抑制子的下调节(Folkman,J.1995,Nat.Med.1:27-31)。管状内皮生长因子(VEGF)和基本纤维生长因子(bFGF)是肿瘤中最普遍表达的血管发生因子。血管生成的肿瘤可能过量表达一种或几种血管发生因子，这样可协同促进肿瘤的生长。用受体拮抗物来抑制一种血管发生因子(如VEGF)是不足以阻止肿瘤的生长的。最近，一些血管生成抑制子被发现，且一些如IFN-a，血小板因子-4(Maione,T.E.et al.,1990,Science 247:77-9)，和PEX(Brooks,P.C.et al.,1998,Cell 92:391-400)与肿瘤细胞并无内源性的联系，Angiostatin(O’Reilly,M.S.et al.,1994,Cell 19:315-28)和endostatin(O’Reilly,M.S.et al.,1997,Cell 88:277-85)确是由肿瘤组织本身产生的与肿瘤相关的血管生成的抑制子。尽管用这些内源的血管生成抑制子治疗肿瘤的生长与转移是相当有效的，并且是吸引人的，但一些与抗血管生成作用疗法相关的潜在问题必须考虑到。尤其必须慎重考虑的是慢性的血管生成治疗引起的滞后毒性和在治疗过程中引起的不正常损伤修复和血管再增生。
本发明描述了具有抗血管生成作用特性的蛋白、片段、类似物、衍生物、同系物、和突变体，也描述了用这些蛋白、片段、类似物、衍生物、同系物、和突变体抑制血管生成引起的增生性疾病的治疗方法。这些蛋白包括有Ⅳ型胶原蛋白的α链的NC1区或其一部分，更具体地，包括有Ⅳ型胶原蛋白的α1,α2,α3链的NC1区的单体。这些蛋白，尤其是单体状态，在体内可阻止肿瘤的生长，在体外一些模型的实验中也组织毛细血管的形成，这些实验包括了皮下管状物生成实验。
这些蛋白也可能还包括NC1区的连接部分。α1,α2,α3链是优选的，正如实验表明，α4,α5,α6链没有或只有很低的抗血管生成作用的活性。一般而言，优选单体形式存在的蛋白，正如有证据表明，六聚体形式的蛋白几乎没有活性或者是活性很低。
更具体地讲，本发明描述了一命名为Arresten的蛋白，它是约230个氨基酸的蛋白，与人类Ⅳ型胶原蛋白NC1区α1链的氮端氨基酸是相同的(Hostikka,S.L.et al.,1998,J.Biol.Chem 263:19488-93)。
本文还描述了的是，人的Arresten能通过如pET22b这样的细菌表达质粒在E.coli中表达，这些表达质粒可穿过周质形成可溶解的蛋白。该蛋白表达后为碳端有6个组氨酸的29 kDa的融合蛋白。超过26 kDa以外的3 kDa产生于多接头和组氨酸标记。当用真核载体pcDNA3.1时，Arresten表达为在293肾细胞中的分泌蛋白，用293肾细胞产生的蛋白目前还没有纯化也没有观测标记。
E.coli产生的Arresren可以剂量依赖型方式抑制bFGF刺激的内皮细胞的繁殖，其ED50为0.25微克/毫升，而对于肾癌细胞(786-0)，前列腺癌细胞(PC-3)，人前列腺内皮细胞(HPEC)的繁殖没有明显的作用。Endostatin抑制C-PAE细胞繁殖，其ED50为0.75微克/毫升，是Arresten的3倍，对A-498癌细胞没有抑制作用。
如前面描述的那样，Arresten对内皮细胞繁殖和转移的特异性抑制表明，Arresten可能是通过细胞表面的蛋白或受体来发挥其功能的。对基质金属蛋白酶(MMP)的抑制说明Arresten在抑制肿瘤生长、转移过程中有直接作用，类似于batimastat(BB-94)和marimastat(BB-2516)。
在本发明中，Canstatin是Ⅳ型胶原蛋白α2链的NC1区，被用来抑制血管生成作用，在试验中可抑制内皮细胞的繁殖与转移，及内皮管状物的生成。对内皮细胞繁殖与转移的特异性抑制证明Canstatin有抗血管生成的功能，它可能通过细胞表面的受体或蛋白起作用。整合蛋白因它们在细胞外基质的结合能力，及有调节细胞繁殖和转移的能力而被认为可能是细胞表面Canstatin的受体。尤其，avb3整合蛋白很可能就是Canstatin受体，因为它在血管生成过程中受诱导，并且有多种结合的能力。
在本发明中，Tumstatin，即Ⅳ型胶原蛋白α3链的NC1区(Timpl,R.et al.,1981,Eur.J.Biochem.120:203-11；Turner,N.et al.,1992,J.Clin.Invest 89:592-601)，被用于在体内和体外的血管生成和肿瘤生长的模型中调节血管内皮细胞繁殖和血管组织的形成。α3(Ⅳ)链的分布仅限于一些特定基质膜中，象GBM，耳窝的基质膜，眼基质膜如前晶状体膜，Descemet膜，卵巢和睾丸基质膜(Frojdman,K.et al.,1998,Differentiation 83:125-30)，肺泡毛细血管基质膜(Kashtan,C.E.,1998,J.Am.Soc.Nephrol.9:1736-50)。然而，在肾血管系统中，维管基质膜和皮下组织基质膜，肝的维管基质膜中却没有该α3链的分布(Kashtan,C.E.,1998,J.Am.Soc.Nephrol.9:1736-50)。在愈伤过程中，是Ⅳ型胶原蛋白的α链(不包括α3,α4链)会集结形成新的毛细血管，因为α3,α4链不是原有基质膜即预先存在的血管系统的成分。因为α3(Ⅳ)链不是正常人的皮肤的原有组成部分，所以用Tumstatin处理后，愈伤组织修复过程中胶原蛋白的凝集和血管生成不会发生变化。
α3(Ⅳ)链既可在人的肾血管基质膜中表达也可以在GBM中表达(Kalluri,R.et al.,1997,J.Clin.Invest.99:2470-8)。这些原有血管系统可能参与了前期肾肿瘤的形成如肾细胞癌。Tumstatin通过α3链与其它α链的结合以干扰新的血管形成的方式，有效治疗原发肾肿瘤。1996年在美国大约有3万人被诊断为肾细胞癌(Mulders,P.et al.,1997,Cancer Res.57:5189-95)，并且对该病扩散的预测情况很不乐观。尽管放射性疗法和化疗有了进步，但病人在接受治疗后并没有明显增长寿命(Mulders,P.et al.,1997,Cancer Res.57:5189-95)。缺少治疗肾细胞癌的有效方法突出体现了发展新的治疗方法的重要性。考虑到这个现实，最近在几个动物模型实验上将控制新的血管化作用作为目标取得了较为理想的效果(Baillie,C.T.et al.,1995,Br.J.Cancer 72:257-67；Burrows,F.J.et al.,1994,Pharmacol.Ther.64:1 55-74；Thorpe,P.E.et al.,1995,Breast CancerRes.Treat 36:237-51)。Tumstatin对抑制体内肾细胞癌的生长显示它对这类肿瘤血管生成的治疗(抑制)有很大的潜能。
本发明中，Tumstatin特异性地抑制内皮细胞的繁殖，并且在体外对PC-3,786-0肿瘤细胞的繁殖没有效果。尽管Tumstatin不抑制内皮细胞的转移，它在体外却明显抑制内皮管状物的形成。这些结果表明，tumstatin通过抑制血管生成过程中的不同步骤而抑制了新血管的形成。
在体内研究中，Tumstatin在matrigel试验中抑制血管增长，在小鼠异种移植中抑制PC-3,786-0肿瘤的生长。用Tumstatin抑制肿瘤的生长，是乐观的，特别是考虑到临床治疗肿瘤。
因为Tumstatin有Goodpasture病的病原抗原决定部位，而Goodpasture病是一种表现为肺出血和急性肾小球性肾炎的自主免疫病症(Butkowski,R.J.et al.,1987,J.Biol.Chem.262:7874-77；Saus,J.et al.,1988,J.Biol.Chem.263:13374-80；Kalluri,R.et al.,1991,J.Biol.Chem.266:24018-24)，因此短期或长期用Tumstatin治疗血管生成会诱发这种疾病。几个科研组已经尝试了对Goodpasture病自主抗原决定部位在α3(Ⅳ)NC1区上的位置进行定位，并且报道了氮端部分、中间部分、碳端部分都具有该抗原决定部位(Kalluri,R.et al.,1995,J.Am.Soc.Nephrol.6:1178-85；Kalluri,R.et al.,1996,J.Biol.Chem.271:9062-8；Levy,J.B.et al.,1997,J.Am.Soc.Nephrol.8:1698-1705；Quinones,S.et al.,1992,J.Biol.Chem.267:19780-4；Kefalides,N.A.et al.,1993,Kidney Int.43-94-100；Netzer,K.O.et al.,1999,J.Biol.Chem.274:11267-74)。最近报道了自主抗体仅与α3(Ⅳ)NC1区氮端的反应现象与利用重组嵌和体的肾存活率相关联(Hellmark,T.et al.,1994,Kidney Int,55:936-44)。该病的抗原决定位位于氮端末的40氨基酸处也已得到证实。钝端的Tumstatin已合成，它因切去抗原决定位而缺少了氮端53个氨基酸残基，且该分子对小鼠异种移植中786-0肿瘤的增长有明显的抑制作用。此外，该分子不和从几个Goodpasture病人中提取的抗体相结合。这些结果说明缺少了氮端53个氨基酸的Tumstatin仍含有抗血管生成的片段。
Tumstatin对内皮细胞繁殖的特异性抑制说明它可能通过细胞表面的蛋白或受体起作用。血管生成还依赖于由整合蛋白avb3介导的内皮细胞胶连(Brooks,P.C.et al.,1994,Cell 79:1157-64)。Tumstain可能通过干扰繁衍的内皮细胞与基质成分之间的相互作用而将内皮细胞排挤到细胞程序性死亡的正常代谢中(Re,F.et al.,1994,J.Cell.Biol.127:537-46)。基质金属蛋白酶(MMP’s)已经被认为是作为调节在肿瘤中新血管生成的主要酶(Ray,J.M.et al.,1994,Eur.Respir.J.7:2062-72)。最近证明的是，MMP-2(PEX)的抑制子可以通过抑制血管生成来阻碍肿瘤的生长(Brooks,P.C.et al.,Cell 92:391-400)。Tumstatin可能通过抑制MMP的活性起作用。
不论在体内或在体外，Tumstatin抑制血管生成的结果是阻止肿瘤的生长。为将Tumstatin引入临床医疗，必须考虑到它在系统治疗中的毒性和副作用。而Tumstatin的分布是有局限的，尤其在皮下基质膜中一般不含Tumstatin的事实表明，用Tumstatin治疗血管生成副作用很小。此外，在特定器官(如肾)中的血管基质膜中存在Tumstatin说明用它来有效治疗少数器官中的肿瘤是有相当潜能的。当然，最终理想的是利用基因转移手段实现tuimstatin基因在肿瘤血管组织中体内表达(Kashihara,N.et al.,1997,Exp.Nephrol.5:126-31；Maeshima,Y.et al.,1996,J.Am.Soc.Nephrol.7:2219-29；Maeshima,T.et al.,1998,J.Clin.Invest.101:2589-97)。
α3(Ⅳ)链的分布限定于特定器官的基质膜，考虑到它可能抑制α链的凝集，Tumstatin的可能毒性很小。此外α3(Ⅳ)链在肾的血管基质膜中也观察到(Kalluri,R.et al.,1997,J.Clin.Invest.99:2470-8)，并且这些血管可能参与原发肾瘤(如肾细胞癌)的生成。因此Tumstatin可能通过扰乱α3(Ⅳ)链和其它α链间的结合来有效抑制这类肿瘤。
在本文中，术语“血管发生作用”(血管生成)指在组织和器官中形成新的血管，并且涉及内皮细胞的繁殖。在正常生理条件下，人或动物只有在很特定的时期才有血管生成。例如在损伤修复、胚胎发育、原体luteum、子宫内膜和胎盘中均可观察到有血管生成现象。术语“内皮”是指排列组成血清腔、淋巴管、血管的一层扁平内皮细胞。因此，“抗血管生成活性”是指一物质所具有的抑制血管生长的能力。血管的生长是一个复杂的过程，包括位于内皮细胞下的基质膜定位裂解，相对应表皮细胞的繁殖，并且转移至将形成血管的部位，把这些细胞组成新血管膜，内皮细胞繁殖的终止，和外膜细胞及其它支持新生血管壁的细胞的插入。“抗血管生成活性”在本文中指干扰其中的一步、几步或全部步骤，最终使新血管形成被抑制。
抗血管生成活性还可能包括内皮抑制活性，皮下抑制活性通常指一物质具有抑制血管生成的能力，如在培养基中存在成纤维细胞因子、血管发生因子、或其它生长因子时抑制牛的毛细血管内皮细胞的生长或转移。“生长因子”是一类促进细胞生长、繁殖或合成能力的物质。“血管生成相关因子”指或是抑制或是促进血管生成的因子。血管发生相关因子的一例就是血管发生生长因子，象基本的成纤维细胞生长因子一样，它是血管生成的促使因子。血管发生相关因子的另一例子是血管生成作用抑制子，例如:制管张素(参见U.S.Pat.No.5,801,012；U.S.Pat.No.5,837,682；U.S.Pat.No.5,733,876；U.S.Pat.No.5,776,704；U.S.Pat.No.5,639,725；U.S.Pat.No.5,792,845；WO 96/35774；WO 95/29242；WO 97/23500)或endostatin(WO 97/15666)。
“大体相同的生物活性”是指一物质在抗血管生成方面，在标准实验中与Arresten、Canstatin、Tumstatin有相似的生物活性。“标准实验”包括但不限于，在分子生物学中用于检测测算抗血管生成活性，细胞循环停滞，和细胞程序性死亡的方法。这些实验包括但不限于内皮细胞繁殖，内皮细胞转移，细胞循环分析，内皮管状物形成，细胞程序性死亡的检测，也就是程序性细胞检测或AnnexinV-FITC实验，尿囊绒膜(CAM)实验，及小鼠内肾癌肿瘤生长的抑制实验。这些方法详见下面的举例。
在本文中，Arresten在也写作Arrestin，包括Arresten的片段、突变体、同系物、类似物、氨基酸序列的等位变种，还有从其它动物来的Arresten，及其片段、突变体、同系物、类似物、氨基酸序列的等位变种。
在本文中，Canstatin包括Canstatin的片段、突变体、同系物、类似物、氨基酸序列的等位变种，还有从其它动物来的Canstatin，及其片段、突变体、同系物、类似物、氨基酸序列的等位变种。
在本文中，Tumstatin包括Tumstatin的片段、突变体、同系物、类似物、氨基酸序列的等位变种，还有从其它动物来的Tumstatin，及其片段、突变体、同系物、类似物、氨基酸序列的等位变种。
应该理解的是，本发明的意图是要包括内皮组织抑制活性的的Arresten、Canstatin、Tumstatin一切衍生物。也就是说通常有抑制血管生成活性的任意物质，例如在培养基中有成纤维细胞生长因子、血管生长相关因子、或其它已知生长因子存在条件下抑制牛的毛细血管生长或转移。本发明包括完整的Arresten、Canstatin或Tumstatin蛋白，及这些蛋白的衍生物和有生物活性的蛋白片段。这些具有Arresten、Canstatin、Tumstatin活性的蛋白有的有氨基酸替代，有的是糖基或其它分子附加连接在氨基酸集团上。
本发明也描述了Arresten、Canstatin、Tumstatin的片段、突变体、同系物、类似物。Arresten、Canstatin、Tumstatin的片段是指组成上小于完整的Arresten、Canstatin、、Tumstatin而又包括至少25个连续Arresten、Canstatin、Tumstatin氨基酸的多肽。这些分子可能也包括或不包括克隆过程中附加的氨基酸序列，例如，氨基酸残基的序列与完整或部分的克隆连接物序列一致。本发明包括的突变体，无论有或没有附加的氨基酸残基，必须与天然的或原先的多肽等长的蛋白有相同的生物学活性。
其中一片段，命名为Tumstatin N-53，在标准实验中被发现与完整的Tumstatin有相同的抗血管生成活性。Tumstatin N-53包括了原有完整的Tumstatin蛋白去掉氮端53个氨基酸残基的部分。本发明中记载的其它突变体在此处记录的实验中也有很高水平的抗血管生成活性。这些片段如Tumstatin 333,Tumstatin 334,12 kDaArresten片段、8 kDa Arresten片段、10 kDa Canstatin片段，它们的ED50值分别为75、20、50、50、80纳克/毫升。而完整的Arresten、Canstatin、Tumstatin分别为400、400、550纳克/毫升。Tumstatin333包括SEQ ID NO:10的第2到125个氨基酸，Tumstatin 334包括SEQ ID NO:10的第126到245个氨基酸。
Arresten、Canstatin、Tumstatin的突变体是指在原有氨基酸酸序列上有任何变化的多肽。这些改变可能在自然条件下形成，也可能由人工得到，如化学能量(X射线)或其它形式的化学突变、遗传工程、杂交或其它形式遗传物质交换而来。这些突变体包括碱基的改变、缺失、插入、倒位、移位、复制等。Arresten、Canstatin、Tumstatin的突变体形式与原来的Arresten、Canstatin、Tumstatin多肽相比，其抗血管生成活性可表现为增加或降低，这些突变体也可能包括或不包括在克隆过程中附加的氨基酸残基，例如，与连接物序列的部分或全部相同的氨基酸残基或序列。
本发明中抗血管生成蛋白的突变体/片段可以通过PCR克隆产生。命名为Tumstatin 333和Tumstatin 334的片段就是用该方法生成的，并且其抗血管生成的活性比原全长Tumstatin蛋白还要高，如下边的例18，图23、24所示。为得到这种片段，PCR引物必须从已知序列上设计以便每对引物都可从整个蛋白基因上扩下已知片段。扩增后的片段进一步克隆在合适的表达载体上，如载体pET22b，所表达的蛋白的抗血管生成的活性以如后面实验所述进行检测。
本发明中抗血管生成蛋白的突变体(片段)还可以通过假单胞菌(Pseudomonas)的弹性蛋白酶消化得到，象Mariyama,M.et al.(1992,J.Biol.Chem.267:1253-8)和后面的例24所讲的那样。用这种方法得到了12 kDa,8 kDa和10 kDa的Canstatin突变体，所有这三种突变体在抗血管生成活性上比原先完整的蛋白还要高。
Arresten、Canstatin或Tumstatin的类似物是指与完整的分子或其片段，等位变种结构上相当类似的非自然分子，并且与原Arresten,Canstatin,Tumstatin有相同或更高的生物活性。这些类似物包括有生物活性的Arresten、Canstatin、Tumstatin的衍生物(例如上面定义的化学衍生物)及它们的片段、突变体、同系物、等位变种的衍生物，这些衍生物是与没经过修饰的Arresten、Canstatin、Tumstatin多肽、片段、突变体、同系物、等位变种有相同激活或拮抗的效果。
Arresten、Canstatin或Tumstatin的等位变种是指相对于Arresten、Canstatin或Tumstatin标准多肽氨基酸序列自发产生了变异的多肽。编码Arresten、Canstatin或Tumstatin等多肽的多聚核苷酸的等位变种是指含有与编码相应的Arresten、Canstatin或Tumstatin的多肽的多聚核苷酸而言发生了序列变化的多聚核苷酸，因此，编码Arresten、Canstatin或Tumstatin多肽的多聚核苷酸的等位突变也编码Arresten、Canstatin或Tumstatin多肽的等位突变蛋白。
还可能的是，某一给定多肽可能是单一的Arresten、Canstatin、Tumstatin片段、突变体、类似物、等位变种，也可能是它们中的两个或多个，例如，某一多肽可能既有Arresten、Canstatin、Tumstatin的类似物又有其突变体。如一比原先短的Arresten、Canstatin、Tumstatin分子完全可在实验室中合成。若该片段在经过已知的方法发生突变，那该分子既是的Arresten、Canstatin、Tumstatin片段又是它的突变体。又如产生一突变体后，后又证明它是某些哺乳动物中Arresten、Canstatin、Tumstatin的等位形式，那这种突变体同时也是等位变种。本发明中也将包括这些片段、突变体、等位变种、类似物的组合。
试举一例，例18中提到的用大肠杆菌克隆表达产生的Tumstatin是一单体。它还是一融合蛋白或嵌合蛋白，因为用大肠杆菌克隆表达的过程中，可在表达的蛋白上加入外源多连接头序列及组氨酸标记。同样在例18中描述的Tumstatin片段Tumstatin N-53是完整蛋白Tumstatin的缺失突变体，用大肠杆菌克隆表达的过程中也会加上一附加序列，因此它也是完整Tumstatin的融合或嵌合蛋白。把Tumstatin N-53的亚单体连接(即二聚体、三聚体)将产生一Tumstatin蛋白的多聚融合或嵌和突变体片段。
本发明中包括了和Arresten、Canstatin、Tumstatin有相似氨基酸序列的蛋白，或和编码Arresten、Canstatin、Tumstatin的核酸有相似序列的多聚核苷酸。“几乎一样的序列”指核酸或多肽与标准序列相比致少有70％的相同；“特别相似”至少为80％相同；“更为相似”为90％；“极为相似”为95％，“最为相似”至少为97％。比较序列的长度一般最短为75核苷酸或25个氨基酸；较理想的至少为150个核苷酸，50个氨基酸；最理想的为243-264个核苷酸，81-88个氨基酸。此处多肽是指氨基酸的分子链，并非专指产物的具体长度。因此，肽、寡肽、蛋白均包括在多肽范围内。多肽还包括经表达后修饰的多肽，例如糖基化、乙酰基化、磷酸化等等。
“序列相同”在此处指2个多聚体分子间亚单位序列的相似性比较，如2条核酸或2个多肽。当分子中某一亚基位置上为相同单体亚基时(如2条多肽链某一位置均为丝氨酸)，那么它们在该位置上就相同。两序列的相似性是相配对或相同位置的数量的直接体现，若2肽链或化合物序列有一半是相同的，那么两序列就有50％的相似性；若90％的位置上都相同则有90％的序列相似性。例如，序列R2R5R7R10R6R3和R9R8R1R10R6R3,6个位置中3个相同，因此二者之间相似性为50％；而R2R5R7R10R6R3和R8R1R10R6R3,5个位置中3个相同，二者之间的相似性为60％。而序列之间的相似性是位置上相同或匹配的一种直接体现。因此，如果相关序列某一位置或部分在某一特定氨基酸缺失，那缺失的部分就不计入序列相似性中。如R2R5R7R10R6R3和R2R5R7R10R3,6个位置中5个相同，二者相似性为83.3％。
相似性经常用序列分析软件来测量，如BLASTN或BLASTP(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。用BLASTN对核苷酸分析时(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html)二序列间匹配参数如下匹配为1，不匹配为-2，有开口5，有大的裂口2。用BLASTP对蛋白序列分析时，匹配为0，不匹配为0，有开口为11，有大的两序列的“序列同源性”是指二者之间仅发生了保守替代，其它均相同。对多肽序列来说，保守替代包括一特定位置上的氨基酸被同类其它氨基酸取代(例如氨基酸之间有共同的一些特性疏水性、电荷、其它构象或化学特性，如缬氨酸取代亮安酸，天门冬酰氨取代赖氨酸)；或在不改变影响多肽生物活性的构象或折叠的位置上发生一个或多个非保守氨基酸取代、缺失或插入。“保守性取代”的例子包括一非极性残基(疏水性)如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸间相互取代；极性残(亲水性)基间相互取代亮氨酸和赖氨酸间、谷氨酰氨和天门冬酰氨之间、苏氨酸和丝氨酸之间；一碱性残基如赖氨酸、精氨酸、组氨酸间相互替代；酸性残基如天门冬氨酸和谷氨酸间相互替代；或是化学作用修饰后的氨基酸替代原来氨基酸；前提是多肽必须有强的生物学活性。两有同源性的序列叫作“序列同系物”。
对多肽来说，同源性用序列分析软件(如美国威斯康星大学生物工程中心遗传电脑组的序列分析软件包，大学路1710号，Madison,WI 53705)来测量。蛋白分析软件分析相似性序列是通过给替代、缺失或其它修饰指定其程度并比较相似的序列来完成的。保守性替代一般指以下各组的替代甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰氨、谷氨酰氨；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
本发明中也包括了Arresten、Canstatin、Tumstatin的化学衍生物。“化学衍生物”指一多肽，其有一个或多个残基与功能侧基反应后生成的化学修饰残基衍生物。这些衍生物残基包括，其自由氨基经过衍生而形成胺的分子盐酸基、对甲苯磺酰基、苄氧羧基、丁氧羧基、氯乙酰基、甲酰基等。自由羧基经衍生后生成盐，甲基或乙基酯或其它形式的酯或肼类。自由羟基可形成O-酰或O-烷基衍生物。组氨酸的氮咪唑基可生成N-对苯甲基组氨酸。化学衍生物也包括含有一个或多个20个常规氨基酸的自然衍生物的肽，如4-羟基脯氨酸替代脯氨酸；5-羟基赖氨酸替代赖氨酸；3-甲基组氨酸取代组氨酸；高丝氨酸代丝氨酸；鸟氨酸代替赖氨酸。
本发明也包括含有抗血管生成蛋白、它们的片段、突变体、同系物、类似物、等位变种的融合蛋白和嵌合蛋白。融合蛋白或嵌合蛋白可在重组表达和克隆过程中产生，该蛋白可能含有附加氨基酸或与连接物部分或全部相同的氨基酸序列。例如本发明中的Arresten，在大肠杆菌中表达时(见例2)，含有加在该蛋白上的载体序列，其中包括组氨酸标记。在本文中，术语“融合蛋白或嵌和蛋白”包括在原有氨基酸序列基础上的这种改变。Canstatin和Tumstatin中也有这种改变(分别见例11和18)。某一融合蛋白或嵌和蛋白可以是一单一蛋白的多聚体，例如抗血管生成蛋白的重复；融合蛋白或嵌和蛋白也可由几种蛋白组成(例如，几种抗血管生成蛋白)。融合或嵌和蛋白可以由2个或多个已知的抗血管生成蛋白的连接体组成(如制管张素和endostatin，或有生物活性的制管张素和endostatin)；它也可以是抗血管生成蛋白和靶因子组成的结合体(endostatin和表皮生长因子EGF或RGD肽链组成的结合体)；或抗血管生成蛋白与免疫球蛋白组成的结合体(如endostatin和IgG特别是去掉Fc部分后的IgG组成的结合体)。融合蛋白和嵌和蛋白还可包括抗血管生成蛋白、它们的片段、突变体、同系物、类似物、等位变种和其它抗血管生成蛋白组成的结合体，如endostatin或制管张素。其它抗血管生成蛋白可能还包括restin和apomigren；(PCT/US98/26058，其教导通过在此引述而合并于本文)和endostatin的片段(PCT/US98/26057，其教导通过在此引述而合并于本文)。此处，术语“融合蛋白”和“嵌和蛋白”也包括附加成分，如用于递送化疗剂的附加成分，也就是编码化疗剂的核酸与编码抗血管生成蛋白的基因相连。融合蛋白或嵌和蛋白也包括一种抗血管生成蛋白的多聚体，例如二聚体或三聚体。这些融合蛋白或嵌和蛋白可以通过翻译后的修饰连在一起，也可是完全由重组产生。
本发明还包括含有Arresten、Canstatin、Tumstatin、它们的片段、突变体、同系物、类似物、等位变种的多聚体蛋白。“多聚体”指包含了一个蛋白亚基的2个或多个复制体。蛋白的亚基可以是本发明中的蛋白(如Arresten二聚或多聚体)，或一个片段、突变体、同系物、类似物、等位变种(例如Tumstatin突变体或片段，如Tumstatin 333)重复2次或更多次。一个多聚体也可以是一融合蛋白或嵌和蛋白(如一重复的Tumstatin突变体可能和多连接序列相结合)和/或一条或多条抗血管生成蛋白的肽链，该肽链以单体形式存在或以重复的形式存在(如一蛋白可由2或多个多聚体组成)。
本发明还包括了含有分离的一条或多条编码Arresten、Canstatin、Tumstatin的多聚核苷酸的组合物，及载体和含该多聚核苷酸的宿主细胞，以及产生Arresten、Canstatin、Tumstatin，它们的片段、突变体、同系物、类似物、等位变种的方法。在本文中，术语“载体”指的是能在其中插入或克隆一些核酸的物质，其功能是将插入的这段核酸转移至宿主细胞中。这样的还可以带来被转移的核酸的复制和/或表达。一些这样的载体包括有从质粒、噬菌体、动植物来源或插入的病毒的核酸；有的载体为非病毒性的载体，如配体-核酸结合物，脂质体，或脂-核酸复合体。可能为理想的是，将转移的核酸分子可工作地连接到一表达控制序列上，生成一种能够表达该外源核酸的表达载体。核酸的这种转移方式称为“转化”，指的是以外源核酸序列插入到一宿主细胞中，而不论插入方式。例如直接吸收、转导或杂交等。外源核酸能以不整合的形式存在，如一个质粒或其它形式；也可以整合到宿主基因组中。“可工作地连接”指给定组分间按能行使其预定功能的方式连接。例如将一控制序列“可工作地连接”到一编码序列上，指的是它们的连接方式能够在与控制序列相容的条件下获得编码序列的表达。“编码序列”指一段核酸序列能在合适调控序列调控下先转录成mRNA，之后翻译成多肽。编码序列的范围由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子决定。这种序列长度可以是自然的，也可以用已知方式导入或加上核酸片段。一编码序列可能包括但不限定于mRNA、cDNA、重组的核酸序列。
对其中克隆有核酸的载体可以进行挑选，即根据其在真核或原核生物中表达来挑选。有两个可对arresten、canstatin、tumstatin基因进行克隆并表达的载体，他们是pET22b和pET28(a)载体(来自于美国威斯康星州麦迪逊市的Novagen公司)；和一修饰后的pPICZαA载体(来自于美国加利弗尼亚州圣地亚哥市的InVitrogen公司)。这两种载体分别可使蛋白在细菌和酵母中表达(参见PCT/US98/25892，其教导通过在此引述而全部合并于本文)。
当一核酸片段被克隆到一合适载体上之后，就可以转化进一合适的宿主细胞。术语“宿主细胞”指可以接受由载体携带的含有外源核酸片段的受体细胞。宿主细胞可是原核细胞也可是真核细胞，如哺乳动物、植物或昆虫；它可以是单细胞，也可以是多细胞的结合体(如在培养基、或组织培养基、或一组织、器官)。宿主细胞可由正常的多细胞器官提取，也可有多细胞器官的病理组织中提取(如哺乳动物)。在本文中，宿主细胞不仅指转化了外源核酸的原始细胞，也指该细胞的含有外源核酸的后代细胞。
在一实施方案中，分离到的编码抗血管生成蛋白的基因上附带连接一编码肽链的核酸连接子。这样的连接子都是本领域熟知的，例如，连接子包括至少一个编码至少一个附加氨基酸的密码子。一般连接子的长度为1到20或30个氨基酸。核酸的连接子也与编码抗血管生成蛋白的基因一起翻译，结果产生一在氨基或羧基末端至少附带一个氨基酸残基的抗血管生成蛋白。重要的一点是附加的氨基酸没有抗血管生成的活性。
将目的核酸插入到载体中后，将载体转化到合适的原核菌株中，并在适合有抗血管增生生物活性的蛋白表达的合适条件下，产生有生物活性的抗血管生成蛋白、突变体、衍生物、片段或融合蛋白。在一实施方案中，本发明包括将编码抗血管生成蛋白的多聚核苷酸克隆进载体pET22b、pET17b或pET28a，然后转化入细菌中。然后细菌宿主菌株产生抗血管生成蛋白。一般每升培养液中抗血管生成蛋白产生的量是10～20mg或更多。
本发明中的另一实施方案中，真核载体包括一修饰后的酵母载体。一种方法中用到的pPICZα质粒中含一多克隆位点。多克隆位点中插入一组氨酸标记片段。此外，载体也能插入一NdeⅠ位点或其它适合的酶切位点。这些位点是本领域中所熟知的。这个实施方案中产生的含有组氨酸标记的抗血管生成蛋白含1个或更多，典型的是5-20个组氨酸。标记必须不影响蛋白的抗血管生成活性。
产生Arresten,Canstatin或Tumstatin的一种方法是分别对SEQID NO:1,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的多聚核苷酸进行扩增，分别克隆进表达载体，如pET22b、pET 28(a)、pPICZαA或其它的表达载体，然后将含有的外源多聚核苷酸的载体转化进能使编码多肽的基因表达的宿主细胞中去，在适合蛋白表达的适条件下培养宿主细胞，然后从培养物中提取和纯化。产生抗血管生成蛋白的一般方法，特别是产生Arresten、Canstatin、Tumstatin的方法在后面的例子中给予介绍。Arresten、Canstatin、Tumstatin也可在转基因动物中产生表达产物，例如，作为转基因奶牛，羊或猪的奶水的一个组分)，或在转基因植物中表达产物，例如在玉米中与淀粉分子相结合。
Arresten、Canstatin、Tumstatin也可能由传统如化学合成的方法产生。用于构建本发明的蛋白的合成方法是本领域技术人员熟知的。合成的Arresten、Canstatin、Tumstatin蛋白序列如果与重组产生的Arresten、Canstatin、Tumstatin有同样的一、二、三级结构和/或构象的话，则它们可以具有同样的生物活性，包括抗血管生成的生物活性。因此，合成的Arresten、Canstatin或Tumstatin蛋白序列可作为重组产生的经分离的Arresten、Canstatin或Tumstatin蛋白的替代品，用于对治疗化合物的筛选，以及用于发展抗体的免疫学方法中。
Arresten、Canstatin和Tumstatin蛋白在阻抑血管生成方面是有效的，这一点在标准实验中已确证，并在下面的例子中给出。Arresten、Canstatin、Tumstatin不抑制其它类型细胞的生长，如非内皮细胞。
编码Arresten、Canstatin或Tumstatin的核酸可由分离的DNA或cDNA文库中克隆出。在本文中，核酸和多肽如果被称为“分离的”，则指核酸或多肽相对于从它们的生物来源上自由分离出来(生物来源指核酸混合物或在细胞中)，它们可以经过进一步的加工。“分离”的核酸或多肽包括用此处描述的方法、相似方法或其它适用方法得到的多肽或核酸，也包括充分纯化后的核酸或多肽，用化学合成的核酸或多肽，结合化学和生物方法产生的核酸和多肽，及分离到的重组产生的核酸和多肽。因此，“分离”的多肽指不与其它蛋白，糖基、脂或细胞结合物相结合的蛋白。“分离的核酸”指不会立即与其来源生物基因组共价结合的核酸，而在自然状态下，它们会立即共价结合。因此，分离的核酸指一般与结合到载体内的核酸(自主复制的病毒或质粒)，或一独立于其它核酸的核酸，例如，以传统化学方法或限制酶切后产生的独立于其它核酸的核酸片段。
本发明中的多聚核苷酸和蛋白可用于设计分离其它抗血管生成蛋白的探针。美国专利第5,837,490号(授权给Jacobs等人)中提供了一些好的方法，该文献的所有教导都通过在此引述而合并于本文。寡核苷酸探针的设计应遵循以下参数(a)要包括未知基数量(N)尽量少；(b)其Tm值在80℃左右(假设对每个A或T为2℃，对每个G或C为4℃)。
寡核苷酸最好用g-32p-ATP(特异活性为6000 Ci/mmol)和T4多聚核苷酸激酶，并采用通常用于标记寡核苷酸的技术来标记。也可以使用其它标记方法。对未结合的探针最好用凝胶过滤层析或其它已经建立的方法除去。放射性物质插入到探针中的数量用闪烁计数器计算。标记后的探针活性最好为4×106dpm/pmol。含有全长克隆群体的细菌培养物，优选在融化后，以100μl接种到无菌的含25ml加100mg/ml LB(肉汤)培养液的摇瓶中。培养物最好在37℃培养至饱和，之后在无菌的LB培养液中稀释。稀释液的等分实验最好在平板上确定其稀释度和数量，使其最终37℃过夜培养后，在含氨苄青霉素100微克/毫升、琼脂1.5％、LB固体的150毫米petri平板上生成5000个单菌落。也可以采用其它已知的产生单菌落的方法。
然后用标准的菌落杂交用将菌落转移到硝酸纤维素膜上，裂解，变性，烘干。高度严谨条件为至少1×SSC在65℃，或1×SSC和50％甲酰胺在42℃，中度严谨条件应至少为4×SSC在65℃，或4×SSC和50％甲酰胺在42℃，低度严谨条件应至少为4×SSC在50℃，或6×SSC和50％甲酰胺在40℃。
然后，膜在含6×SSC,(20×的贮存液为175.3gNaCl/L,88.5g柠檬酸三钠用NaOH调pH为7),0.5％SDS,100微克/毫升酵母DNA,10mM EDTA(大约10ml/150mm滤膜)的缓冲液中，65℃，轻微振荡，杂交1小时。最好随后以浓度大于或等于1×106dpm/ml将探针加入杂交体系中，然后杂交膜在65℃，轻微振荡下杂交过夜。然后用500ml 2×SSC+0.5％SDS的缓冲液在室温下洗涤膜，不摇动，最好随后用500ml 2×SSC+0.5％SDS的缓冲液在室温下轻摇15分钟。可以采用或不采用0.1×SSC+0.5％SDS缓冲液65℃洗30分钟到1小时的第三次洗涤。然后优选将膜干燥，在X射线下自由显色足够时间以便观测其阳性结果。也可以用其它已知的杂交方法。然后将阳性菌落挑出，培养，用常规方法提质粒DNA。然后，克隆可再用限制性酶切，杂交或DNA测序来确定。
本发明包括了在哺乳动物组织中用Arresten、Canstatin和Tumstatin或它们的有生物学活性的片段、类似物、同系物、衍生物或突变体抑制血管生成的方法。具体而言，本发明包括用有效剂量的1种或多种抗一血管生成蛋白或其生物活性的片段、生物活性的片段结合体、激活剂、拮抗体来治疗血管生成介导的病症。有效剂量的抗血管生成蛋白是指足以抑制导致疾病的血管生成，并从而疾病全部或部分减除的剂量。对血管生成介导的病症的减除可通过观察症状减弱来确定，如肿瘤体积上的减少或抑制用肿瘤的生长。在本文中，术语“有效剂量”还指组合物中每一种有生物活性组分的总量，该量足可以显示对病人有利的效果，即治疗、治愈、防止或相关医疗条件减缓、增加治疗效率、治愈、对疾病的防治或减轻，以及产生上述效果的方法剂量。当结合使用时，该术语指的是产生疗效的各活性成分量的总和，而不论是结合给药、依次给药或同时给药。血管生成介导的病包括(但不限定于)癌，固体瘤，血生肿癌瘤(白血病)，肿瘤扩散(转移)，良性肿瘤(如血管瘤，声觉神经瘤、神经纤维瘤，沙眼、化脓的肉牙瘤)，类风湿关节炎、牛皮癣，视觉血管生成病(如糖尿病的视力减退，视网膜病，早熟视网膜病，斑点降解，角膜移植排斥，新血管青光眼，retrolental fibroplasia豆状纤维组织，rubeosis),Oslerwebber综合症，心肌梗塞(血管生成)，斑点新血管化(血管生成)，毛细血量扩张(hemophiltac joints)。血发病、血管纤维瘤，创伤肉芽。抗血管生成蛋白对治疗内皮细胞过多或非正常刺激的疾病是有用的。这些病包括(但不限于)肠的粘连，Crohn’s病，动脉粥样硬化，硬皮病，肥大瘢(如病瘢痕疙瘩)。抗血管生成蛋白在胚胎移植时可以用作防止血管化的出生控制剂。抗血管生成蛋白对治疗将血管生成作为生理结果的病如猫划痕病(Rochele ininalin quintosa)和溃疡(Heliobacter pylori)有作用。抗血管生成蛋白也可用于防止透析移植血管狭窄和过胖(如阻止肥胖组织中毛细血管形成来防止它扩张)。抗血管生成蛋白也可用于治疗组织性(即非转移的)疾病。“癌”指瘤的生长，畸形生长或增生生长或细胞发育不正常的状态，也包括固体瘤，非固体瘤，不正常的细胞繁殖，就象白血病那样。在本文中，“癌”也指依赖于血管生成的瘤和肿瘤，即肿瘤因其生长(体积和/或质量增生)需要增加血管的数量和密度来供血。“消退”指用本领域熟知的方法方法测量出肿瘤体积和质量的减少。
然而，有的时候血管生成的增加是需要的，如伤口愈合，或在心脏梗塞后组织中，抗血管生成蛋白的抗体或抗血清能用于阻止固定的，原有抗血管蛋白及其过程，因此增加新血管组织的生成并抑制组织萎缩。
抗血管生成蛋白可以和其它物质、方法结合起来治疗疾病。例如，肿瘤可以用传统的外科手术、射线、化疗免疫法并结合抗血管生成蛋白来治疗，然后，继续将抗血管生成蛋白给药于病人，来延长微转移的休眠期和稳定，抑制残存原发肿瘤的生长。抗血管生成蛋白或其片段、抗血清、受体激动剂，受体拮抗剂，或它们的结合物，也可与其它抗血管生成化合物、抗血管生成蛋白(如制管张束，endostatin)、片段、抗血清、受体激动剂，受体抗生物结合。此外，抗血管生成蛋白或它们的片段，抗血清、受体激动剂、受体拮抗剂、或它们的结合物，可与药剂上可接受的赋形剂结合，还可选择性地结合维持释放基质(如生物降解性的聚合物)，从而形成药用组合物。本发明的组合物还可以包含其它抗血管生成蛋白或化合物，如endostatin或制管张素，它们的突变体、片段和类似物。这些组合物还可以进一步包含其它的试剂，这些其它的试剂可能增进蛋白活性或辅助其治疗活性，或用于治疗目的，例如化疗或放射性试剂。这些附加因子和/或试剂可以包括在组合物中，与本发明的蛋白质产生抑制哺乳动物组织中血管生成的综合效应，或使副作用降到最低。此外，其中用含有本发明中蛋白的组合物的给药方式可以是与其它的治疗法一同采用，例如，与化疗或放疗一同采用。
本发明包括用含有本发明的蛋白的组合物接触组织而抑制哺乳动物中的血管生成。“接触”不仅指体表应用，也指将组合物引入组织或组织中的细胞中去的送达方式。
本发明还包括使用定时释放或维持释放传递系统。这些系统在手术不可能或很困难时是很理想的，例如病人因年龄大或病期长而身体虚弱，或在利弊分析表明需要对治疗进行控制时。
在本文中，维持释放基体指由某种材料组成的基质，一般是多聚体，它可以被酶降解，或被酸、碱水解或被溶解。当基质体插入到体内时，它和酶及体液发生作用。维持型释放基体最好选自生物相容性物质，如脂质体，多聚乳酸盐，多聚glycolide(glycolic acid的聚合物)，聚乳酸共glycolide(乳酸和glycolic acid的共聚体)，多聚酐，多聚酯(邻)，多聚蛋白，透明质酶，胶原蛋白，硫酸软骨素，羧酸、脂肪酸、磷脂、多聚糖、核酸、多聚氨基酸、氨基酸，如丙苯氨酸，酪氨酸、异亮氨酸、多聚核苷、多聚乙烯丙烯、聚乙烯吡呤烷酮和硅土。较好的生物可降解基质是聚乳酸，多聚glyco1ide或多聚乳酸共-glycolide。
本发明中的血管生成调节组合物可以是固体，液体或气溶胶，也可用已知的任意途径给药。固体组合物的例子有药丸，霜剂，和可植入的药剂单位。药丸可口服，霜剂可以在体表局部给药。可植入的药剂单位可以在病灶给药(例如在肿瘤的位置)，或可以对血管生成调节物进行系统释放，如皮下植入。液态组合物的例子包括适于皮下注射的配方，静脉注射的配方，动脉注射的配方，及体表和眼内治疗的配方。气溶胶的例子有对肺给药的吸入配方。
以上描述的有抗血管生成活性的蛋白和蛋白片段，可以用本领域熟知的配制方法制出，将分离的或基本纯净的蛋白或蛋白片段在药理学上可接受配方中给药。这些配方可以用常规途径给药。一般来说，结合物可通过体表，脑经皮，皮下、腹腔、颅内的(头盖内的)、脑内室、脑内、阴道内、子宫内，口腔、直肠或肠胃外的途径(如静脉内的、背柱的、皮下或肌肉)给药。此外，抗血管生成蛋白可与生物可降解多聚体结合，使化合物维持释放，多聚体移可以植入在需要释放药的位置附近，例如，在肿瘤位点，或在可以实现缓慢系统释放的位点植入。微型渗透泵也可用来控制通过小管输送至目标地的高浓度抗血管生成蛋白的运送，目的地指转移生长的肿瘤或其它支持血管。生物可降解多聚体和它们的应用也有描述，如在Brem et al(1991年)的文章中有详述(J.Neurosurg.74:441-446)，该文献通过在此引述而合并于本文。
含有本发明的多肽的组合物可以静脉给药，如可按单位剂量注射。在本文中，术语“单位剂量”在指本发明的治疗组合物时，指适宜于对象的物理形态离散的单位剂量，每单位含有与稀释剂如载体结合后产生所需治疗效果的活性物质的预定量。
本发明的组合物的给药包括静脉注射，肌肉内，腹腔内、胸腔内，皮下和关节注射和输入。用于肠胃外的注射的组合物包括药理学上可接受的无菌水溶液或非水溶液，分散体，悬浮液，和乳剂，以及加入无菌的注射液或分散物中的无菌粉剂。适合的水或非水载体，稀释剂、溶剂，或载体包括水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)，羧甲基纤维素，以及它们相应的混合物，植物油(如橄榄油)和注射性的有机酯如乙基油酸等。应该保持适合的流体性，例如，用卵磷酯等进行包被，用表面活性物质在分散剂中保持所需的颗粒大小。这些植物中还可以包括佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和扩散剂。为防止微生物的作用，可以在组合物中包含多种抗细菌或真菌的药剂，如对羧基苯甲酸酯，氨化醇，酚山梨酸等。在需要时，也可加入一些等渗物质，如糖、NaCl等。为使注射的药剂长期吸收，可加入单硬酯酸的铝盐和明胶，从而可以延缓吸收。可注射的贮存形式是用多聚乳酸共-glycolide，多聚邻酯和多聚酸酐等生物降解性多聚体将药制成微胶囊基粒。通过控制药物和多聚体的比率和所用多聚体的类型可以控制药物释放。贮存的注射物也可用脂质体或微乳胶将药物包裹，而脂质体与微乳胶可与人体组织相容。注射的药方(剂)可以灭菌，如用细菌过滤膜过滤，或用无菌的固体组合物混合，这些固体组合物在使用前能溶解或分散于其它无菌的注射介质中。
本发明中的治疗组合物可以包括药理学上可接受的盐，例如有机或无机酸盐。此处“药理学上可接受的盐”，指在医学标准范围内的，用于人或动物组织中无毒性，无过敏，无变态反应并且有一合理的危害比率的盐类。药理学上可按受的盐是本领域所熟知的，如S.M.Berge et al.在J.Pharmaceutrcal Sciences(药物科学杂志)(1977)661 et seq中详尽描述了的药理学上可接受的盐类，该文献的内容通过在此引述而合并于本文。药理学上可接受的盐类包括酸的加成盐(以多肽的自由氨基形成)，即与无机酸形成的盐，例如，如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等。与自由羧基形成的盐也可以由无机碱生成，例如，钠、钾、氨、钙、铁的氢氧化物，或有机碱如异丙氨，2-乙醇氨、组氨酸、普鲁卡因等。盐也可能在本发明的化合物的最后分离与纯化时产生，或另外以自由碱与合适有机酸反应生成。代表性的酸加成盐包括(但不限于)乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，柠檬酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑胺酸盐、二葡糖酸盐，甘油磷酸盐、半硫酸盐，庚糖酸盐，己糖酸盐，延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐，α-羟基甲硫酸盐(isethionate)，乳酸盐、马来酸盐、甲硫酸盐、烟酸盐，2-萘硫酸盐、草酸盐，pamoate，果胶酸盐，pesulfate,3-苯丙酮酸盐，苦味酸盐，pivalate，丙酮酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐，对甲苯硫酸盐和十一烷酸盐。含碱性氮的基团可与一些基团形成四级物，这些基因有低级烷卤化物如甲基、乙基、丙基、丁基的氯化盐、溴化盐、碘化盐；二烷基硫酸盐如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物如癸基、月桂基、豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物、碘化物；芳烷基囱化物如苯甲基、苯乙基。从而可以获得水溶液或酯溶液或悬浮液。能形成药理学可接受的酸加成盐类的无机酸的例子有氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸；有机酸有草酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸。
在本文中，术语“药理学上可接受的”、“生理上可耐受的”的和其它不同的术语在用于组合物、载体、稀释剂和赋形剂等时，是可以互相替换使用的，其指的是这样的物质，即这些物质在对哺乳动物给药时出现最轻微的负生理反应，如恶心、眩晕、翻胃等。制备含有溶解和分散的活性成分的药用组合物是本领域内熟知的，并且不限制于配方。一般而言，这样的组合物被制备成可注射的剂型，如溶液或悬液，然而，也可以制备成在使用前溶于液体而形成溶液或悬浮液的固体。制剂也可被乳化。
活性成分可混于赋形剂，赋形剂必须是药理上可接受的并且与活性成分相容，其使用量要适合于本文所描述的各种治疗方法。适宜的赋形剂包括水、盐水、右旋葡萄糖，甘油、乙醇或它们的混合物。此外，如果需要，组合物中可含少量辅助成分(佐剂)如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂等，以提高活性成分的效果。
本发明中的抗血管生成蛋白也可以与药物前体一起含在组合物之中。在本文中，术语“前体药物”指在体内能迅速转化生成亲代化和物的物质，比如，在血液中通过酶的水解作用而生成。T.Higuchi和V.Stella在“以前体药物作为新的传递系统”(Prodrugs as NovelDelivery Systems,Vol 14 of the ACS Symposium Series)和Edward B.Roche ed.,在“药物设计中的生物可逆性载体”(Bioreversible Cariersin Drug Design，美国药物协会和Permeagon出版社，1987)两文中有详细描述和介绍，这两篇文献的教导都通过在此引述而合并于本文。在本文中，术语“药理学上接受的前体药物”指的是，(1)本发明的化合物的前体药物，它们在正常医学判断标准范围之内，适于用于人或动物组织而又无毒性，过敏、应激性等反应，有一合适的利益危险性比率并且能起到预定效果；(2)亲代化合物的兼性离子形式，如果可能的话。
本发明的抗血管生成蛋白的剂量依病的状态或治疗条件、或临床的其它因素如人或动物的体重和条件及给药途径等而定。对于治疗人或功物而言，蛋白剂量一般为10到20 mg/kg体重。在复合治疗中，如用本发明中的蛋白与放射疗法、化疗或免疫疗法联合使用时，可以适当减少剂量，例如，0.1～0.2 mg/kg体重。依据抗血管生成蛋白在受治动物或人体内的半衰期，抗血管生成蛋白可在一定时间内每天几次至每周一次给药之间变化。有一点必须清楚，本发明中的蛋白对于人和兽医同样适用。本发明中的方法包括一次给药和多次给药，包括同时和在一定时间内给药。此外，抗血管生成蛋白可与其它形式的治疗结合使用，如化疗，放射疗法，免疫疗法。
抗血管生成蛋白的药物包括适于口服，直肠，眼睛(包括玻璃体内)，鼻内，体表(包括舌下)，子宫内，阴道，或肠胃外的(包括皮下，腹膜内，肌内，静脉，皮内，颅内、气管内，硬膜)给药。抗血管生成蛋白的药剂可方便以单位剂量形式也可用传统药物学方法配制。这些方法包括将活性成分和药物载体或赋形剂配合在一起的步骤。一般来说，药剂的制备包括均匀地和紧密地将活性成分与液体载体或细的固体载体或它们两者结合起来，然后，如果需要，使产品塑形。
适于肠胃外给药的药剂包括水性的或非水性的无菌注射溶液，它们可以包含抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂，与目标受体血液达到等渗的溶解质，以及包含悬浮剂和加厚剂的水性或非水性的无菌悬浮液。药剂可以装入单位剂量的或多剂量的容器内，例如，封密的安瓿或小管，可以贮存于冻干条件下，在使用前，仅需加入无菌液态载体，如加入水来用于注射。临时注射溶液和悬浮物可用前面所描述的无菌的药粉，颗粒和药片来制成。
当有效量的本发明的蛋白采用口服时，本发明的抗血管生成蛋白应为药片、胶囊、药粉、溶液或药丸形式。用药片时，药用组合物中可以另外含有固体载体，如明胶或佐剂。药片，胶囊和药粉含有本发明蛋白的量为5～95％，最好含25～90％。当以液体形式给药时，可以加入液相载体，如水、凡士林、动物油或植物油(如花生油、无机油、大豆油或芝麻油)或合成油。液体形式的药用组合物可以进一步含有生理盐水溶液，葡萄糖或其它糖类溶液，或醇(如乙二醇、丙二醇，或聚乙二醇)。当用液剂给药时，药用组合物含有月0.5～90％重量的本发明的蛋白，最好含1～50％本发明的蛋白。
当有效量的本发明的蛋白用于静脉、皮肤或皮下注射时，本发明的蛋白应为非致热原、肠胃外可吸收的液体形式。具有合适的pH、等渗、稳定性等的肠胃外可接受的蛋白溶液的制备，是本领域所熟知的。优选的适于静脉、皮肤或皮下注射的药用组合物应该在本发明的蛋白之外，还包含等渗载体如氯化钠注射物，Ringer注射物，Dextrose注射剂，Dextrose和NaCl注射剂，乳酸Ringer注射剂，或其它本领域所熟知的载体。本发明中的药用组合物还可含有本领域内熟知的稳定剂，防腐剂，缓冲液，抗氧化剂或其它添加剂。
在本发明的药用组合物中，本发明的蛋白的含量将依所需治疗的疾病的程度和性质、及病人曾经接受过的治疗的性质等而定。最终由医生来决定每位病人的蛋白用量。初用时，医生应用少剂量的本发明蛋白治疗病人，并观察其反应。然后可适量加大药量，直到当该药物在病人身上达到最好的疗效时，用药量不再增加。
根据疾病的程度和性质以及病人的特异反应的不同，本发明的药用组合物的静脉注射治疗时间将不同。本发明的每种蛋白每次连续静脉给药的持续时间应在12-24小时范围内。最终由医生来判定所用本发明的药用组合物的合适持续静脉注射时间。
优选的单位剂量的药剂是每日剂量或单位剂量，每日亚剂量，或治疗剂量的一部分。应该理解的是，除以上提到的成分外，本发明的药剂也可包含该具体药剂的常用的其它的成份。另外，还可以将细胞毒素物质加入到抗血管生成蛋白或其生物活性片段中，或以其它的方式与它们结合使用，从而可对病人起到双层疗效。
本发明的药物配方也适用于兽医领域。特别是家养动物和纯种的马，是除人之外的本发明中蛋白治疗的理想对象。
细胞毒素剂如蓖麻蛋白可连到抗血管生成蛋白或其片段上，可作为对抗血管生成蛋白发生连接的细胞的摧毁工具。这些细胞可在很多部位发现，包括但不限于微转移酶和原发肿瘤。连到细胞毒素上的蛋白以一种更高效的方式被运输至目的部位。例如，蓖麻蛋白连到一高亲合的片段上能通过小管转运到支持目标位点的组织中或直接运至目的位点。这些物质通过渗透泵以能控制的方式通过输入小管。抗血管生成蛋白与拮抗物结合后可以协同作为抗血管生成作用的激活子增加组织与血管生成。这种治疗方式提供了一种破坏转移性癌症的有效途径。
其它治疗方法包括将抗血管生成蛋白、片段、类似物、抗血清、或它们的受体激活物、受体拮抗物连到细胞毒素蛋白上。应该理解的是，抗血管生成蛋白可来源于人也可来源于动物。抗血管生成蛋白可由化学反应合成或用重组技术和表达系统生成。抗血管生成蛋白也可用酶切Ⅳ型胶原蛋白产生有抗血管生成活性的蛋白质。它也可由类似细胞内切酶活性的化合物切Ⅳ型胶原蛋白而成。抗血管生成蛋白的产生还可以通过影响切割酶活性的化合物来修饰。
本发明也包括基因疗法，即将编码抗血管生成蛋白、片段、突变体，或它们的融合蛋白的基因导入病人体内，并进行调节。将DNA转入细胞中并进行基因产物蛋白的表达的众多方法，也称为基因治疗的方法，在“动物体细胞内基因的转入”[Gene Transfes intoMammalian Somatic Cells in vivo,N.Yang(1992),Crit.Rev.Biotechn.12(4):335-336]中有详细描述，该文献的内容通过在此引述而合并于本文。基因疗法包括将DNA序列导入体细胞或胚系细胞中来进行体内或者体外的治疗方法。基因疗法通过替换基因调节正常或者不正常的基因的功能，从而抵抗感染性病毒或者其他病原。
用基因疗法治疗这些疾病的策略包括治疗性策略包括如确定有缺陷的基因，然后插入一个具有功能的基因，或者取代有缺陷的基因的功能，或者增强基因的功能；也包括预防性策略，如增加一个基因，其表达的蛋白质对这种疾病具有疗效，或者它能使得组织或器官对一种疗法更加敏感。作为预防性策略的一个实施例，将一种编码一个或者多个抗血管生成蛋白的基因置于患者体内，就可以防止血管生成的发生；或者将一种能使肿瘤细胞对辐射更加敏感的基因置于体内，使得针对肿瘤的辐射可以杀死更多的肿瘤细胞。
本发明考虑了许多转移DNA或者抗血管生成蛋白的调控序列的方案。转染启动子序列，或者一种与抗血管生成蛋白特异地相关的基因，或者那些可以增加抗血管生成蛋白的表达量的序列也作为基因治疗的方法予以考虑。这种技术的实施例在马萨诸塞州剑桥的转染色质疗法公司(Transkaryotic Therapies,Inc.,Cambridge，Mass)实施过，他们使用同源重组技术插入一个基因开关，可以在细胞里开启促红细胞生成素基因的表达。参见1994年4月15日的“遗传工程新闻”(Genetic Engineering News)。在那些抗血管生成蛋白(或者它们的受体)没有正常表达的细胞中，这种基因开关可以用来激活它们的表达。
基因治疗的基因转移方法可以归为三大类物理学方法(如电穿孔法，直接基因转入法和颗粒轰击法)；化学方法(如脂质载体法，或者其它非病毒载体法)；和生物学方法(如病毒衍生载体和受体吸收法)。例如，可以使用非病毒载体，其中的DNA用脂质体包裹。这种脂质体/DNA复合体可以通过静脉注射法直接注射到病人体内。据信这种脂质体/DNA复合体会在肝脏聚集，在那里DNA被转移到巨噬细胞和Kupffer细胞中。这些细胞是长寿的，因此可以使被转移的基因得到长期的表达。另外，载体或裸DNA可以直接注射到需要的器官，组织或肿瘤中，使治疗性的DNA被送到靶标处。
基因治疗方法也可按基因送达的部位来分类。送达基因的基本方法包括离体(ex vivo)基因转移法，体内(in vivo)基因转移法和体外(in vitro)基因转移法。离体基因转移法是从病人身上提取出细胞，进行细胞培养。然后将DNA转染到细胞中，在扩大被转染细胞的数目，重新将细胞移植回体内。体外基因转移法是，被转染的细胞是细胞培养基中培养，譬如组织培养细胞，它不是取自特异的病人身上的特异的细胞。这些“实验室细胞”被转染后，经过筛选，扩大培养，作为给病人移植用或其它用途。
体内基因转移法需要将DNA导入到病人体内的细胞中。这样的方法包括用病毒介导的基因转移，利用非感染性的病毒载体将基因转移到病人体内，或者直接将裸DNA注射到病人体内的某一部位，这些DNA被一定数量的细胞吸收，并在其中使基因产物蛋白质得到表达。另外，这里描述的其他方法，如基因枪法，也可以用来在体内插入DNA或者调节性序列，以控制抗血管生成蛋白的表达。
基因治疗的化学方法需要以脂质类物质，不一定是脂质体，来帮助DNA通过细胞膜。以脂质为基础的带正离子的Lipofectin或cytofectin可以与带负电荷的DNA结合，形成一种复合物，可以通过细胞膜，使DNA得以进入细胞内。另外一种化学方法是利用基于受体的胞吞作用，这需要特异地结合到能与细胞表面受体结合的配体上，将其包裹起来，转运通过细胞膜。配体与DNA结合，整个复合物被转移到细胞里面。配体/基因复合物被注射到血流中，然后具有这种受体的细胞会特异性的结合配体，并将配体/DNA复合物转移到细胞里。
许多基因疗法利用病毒载体将基因导入到细胞里。例如，经改造的逆转录病毒载体已经在离体方法中得到利用，将基因导入到外周淋巴细胞和肿瘤渗透淋巴细胞，肝脏细胞，上皮细胞，肌细胞，或其他体细胞中，然后，将这些被改造的细胞输回病人体内，提供被插入基因的表达产物。
在体内基因转移方案中，也已经利用病毒载体来实现将基因转移到细胞里。为实现外源基因的组织特异性表达，可以利用具有组织特异性的顺式调控元件或启动子。另外，也可利用原位DNA转移或者具有组织特异性的病毒载体来实现这一目标。例如，为了将基因转移到活体血管细胞里，可以将体外转化的内皮细胞植入动脉血管壁上挑选的位置。病毒也感染了周围细胞，而且这些细胞也表达出了基因产物。使用导管可以将病毒载体直接导入到活体的某一部位，这样使得病毒只能感染特定的范围，达到长期的、位点特异性的基因表达。在体内基因转移中，在哺乳动物组织和肝脏组织上，也有利用逆转录病毒载体通过将改造过的病毒注射进血管内，从而将基因导入到器官的。
用作基因治疗的病毒载体包括但不限于，逆转录病毒，其它RNA病毒如脊髓灰质炎病毒(poliovirus)，或新比斯(Sindbis)病毒，腺病毒，腺伴随病毒(adeno-associated virus)，疱疹病毒，SV40病毒，牛痘，以及其它DNA病毒。复制缺陷型的鼠逆转录病毒是最为常用的基因转移载体。鼠白血病逆转录病毒的组成包括单链RNA组成，复合有核心蛋白以及聚合酶，外有一种gag蛋白包装，外被糖蛋白env包裹，它决定宿主范围。逆转录病毒的基因组包括gag,pol,env基因以及5’和3’的长末端重复序列LTR。逆转录病毒系统是以如下事实为基础如果有辅助的包装细胞系提供病毒结构蛋白，那么仅含有5’和3’LTR序列和包装信号的最小病毒足以实现病毒的包装、感染及整合到目标细胞中的过程。逆转录病毒作为基因转移载体的基本的优点是，在大部分类型的细胞中都能有效地感染，基因可以得到有效地表达，仅有一个拷贝的基因被整合到目的细胞染色质DNA上，而且对逆转录基因组的操作比较容易进行。
腺病毒包括一线性双链DNA，核心蛋白，外被外壳蛋白包裹。分子病毒学的进步使得可以利用这些微生物来发展载体，以便在体内将新的遗传序列转移到目的细胞中。以腺病毒为基础的载体可以使基因得到高水平的表达。腺病毒载体具有很高的感染性，即便用滴度很低的病毒也如此。而且，作为无细胞病毒颗粒，腺病毒是具有完全感染性的，因此没有必要注射生产细胞系。另一个有力的优点是腺病毒载体能够使外源基因在体内得到长期的表达。
基因转移的机械方法包括融合脂质囊泡如脂质体或其它用于膜融合的囊泡，含有带正电脂质的DNA的脂质颗粒如lipofectin，多聚赖氨酸介导的(polylysine-mediated)的DNA转移，DNA的直接注射，如通过显微注射将DNA注入精子或体细胞中，由气动作用转移包裹的DNA颗粒，如基因枪法中使用的金颗粒，无机化合物法如磷酸钙转染法。颗粒介导的基因转移最先在植物组织转化中被使用。采用颗粒轰击装置，或基因枪法，产生一个动力将密度很大的DNA颗粒(如金颗粒或钨颗粒)加速到很大的速度，使其能穿透器官，组织或细胞。颗粒轰击法可以在体外系统中使用，也可在离体或体内技术中使用，将DNA导入细胞、组织或器官。另一种方法是配体介导的基因治疗，它需要将DNA与特定的配体相连，形成配体-DNA复合物，从而通过配体将DNA导入到特定的细胞或组织中。
已经发现，将质粒DNA注射到肌肉细胞中，会有很高百分比的肌肉细胞被转化，并且维持标记基因的表达。质粒DNA也许会，也许不会整合到细胞的染色体基因组上去。非整合型的DNA转化使得可以在最终分化的、非增殖性的组织中保持较长时间的表达，而不必担心会导致在细胞或线粒体基因组中产生插入、删除或变异突变。长期的，但不一定是永久的，治疗基因的转移至特异细胞中，可以对某些遗传疾病有疗效或预防作用。DNA可以反复地定期注射，以维持基因表达产物具有一定的水平，但又不会在受体细胞的基因组中产生突变。不将外源基因整合到细胞基因组中，可以允许同时有几个不同的外源DNA存在，同时表达几种不同的基因产物。
电穿孔基因转移法使用一个电流使得组织或细胞对电穿孔介导的基因转移敏感。一个给定强度的短电脉冲可以增加细胞膜的通透性，以至于DNA分子可以穿透并进入细胞。这种技术可以在体外系统中使用，或用离体或体内技术将DNA导入到细胞、组织或器官中。
载体介导的体内基因转移可以用来将外源DNA转入到细胞中。载体-DNA复合体可以很方便的被导入到体液或血流，然后组织特异性的进入目标器官或组织。脂质体和多聚阳离子，如多聚赖氨酸、脂质转化体(lipofectin)或细胞转化体(cytofectin)，都可以使用。脂质体可以作成对细胞或组织具有特异性的，这样脂质体携带的外源DNA就可以直接被靶细胞吸收。注射对某些细胞表面特定的受体有特异性的免疫脂质体是一种将外源DNA插入到含有这种受体的靶细胞的捷径。另外一种已经使用的载体系统是5脱唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)/多聚赖氨酸偶联系统，它应用于体内基因转移中，将DNA导入到肝脏细胞。
被转化的DNA也可以与其它类型的载体相连，以便将它们导入到受体细胞中，并使其能驻留在细胞质或细胞核质中。DNA可以与载体核蛋白相连，这种核蛋白是特殊的工程颗粒复合体，直接将DNA导入至细胞核里。
抗血管生成蛋白的基因调控可以通过增加能与编码抗血管生成蛋白的基因结合的化合物，或者控制与基因相关的区域，或控制其相应的RNA转录产物以调节转录或转译的速度来实现。而且被编码抗血管生成蛋白的DNA转化的细胞可以输回患者体内，以提供这种蛋白的体内来源。例如，用携带有抗血管生成基因的载体转化细胞，被转化的细胞可以是来自患者身上的正常组织的细胞，患者的病变区细胞，也可以是非患者本人的细胞。
例如，来自患者身上的肿瘤细胞可以用能够表达本发明蛋白的载体转染，然后重新输回患者体内。被转染的肿瘤细胞在患者体内产生一定水平的蛋白表达，可以抑制肿瘤的生长。患者可以是人，也可以是动物。细胞也可以被非载体转染，或用本领域所熟知的物理、化学的方法如电穿孔法、离子孔道法，或基因枪法。而且，DNA可以不必通过载体的辅助，而直接注射到患者体内。特别是注射到皮下，肌肉或血液中。
通过转染抗血管生成蛋白基因至患者体内的基因治疗方案可以是通过整合将抗血管生成蛋白基因整合到患者的细胞基因组或线粒体基因组中，也可以让其以独立的可复制或不可复制的DNA结构形式存在于细胞质或细胞核质里。对抗血管生成蛋白的表达可以维持一个很长的时间，也可以通过不断的反复注射基因，使蛋白质在细胞、组织、器官或血液中的水平被维持在所需要的水平。
另外，本发明还涉及抗体及抗血清，它们可以用于检测新的抗血管生成蛋白，也可用于以相关的抗血管生成活性的出现或相应的活性缺乏为特征的疾病的诊断、预测及治疗。这样的抗体和抗血清也可在需要的时候被用于上调需要调节的血管生成，例如在心肌梗塞后的心肌组织中，本发明蛋白的抗体或抗血清可以用来阻断局部的、天然的抗血管生成蛋白和生成过程，增加新的血管的形成，抑制心肌组织萎缩。
这些抗体和抗血清可以与药理学上可接受的组合物和载体结合起来，形成诊断、预测或治疗用药物。这里的“抗体”和“抗体分子”是指一群免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白的具有免疫活性的部分，也就是含有抗体结合位点或抗原互补位的分子。
使用能够特异性地结合抗血管生成蛋白的抗体进行的消极的抗体疗法可以调节依赖于血管生成的生理过程，如生殖、发育、伤口愈合、组织修复。而且，加入能与抗血管生成蛋白的抗体Fab区结合的抗血清还可以阻断内源性的针对该蛋白的抗血清与该蛋白的结合。
本发明的抗血管生成蛋白还可以用于制备对这些抑制因子和受体具有特异性的抗体。抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。这些特异地与抗血管生成蛋白结合的抗体或者它们的受体可以被用于诊断和试剂盒，它们都是本领域的技术人员所熟知的用于检测或定量体液或组织中抗血管生成蛋白或其受体的技术。这些检测的结果可以用来诊断或预测肿瘤和其它血管生成介导的疾病的发生或复发。
本发明也包括抗血管生成蛋白、其抗体以及由这些蛋白和/或它们的抗体组成的组合物在以血管生成为特征的疾病的诊断或预诊断中的使用。在本文中，术语“预诊断方法”一词是指能够对人或动物的一种疾病的发展作出预测的方法，这种疾病尤其是依赖于血管生成的。术语“诊断方法”一词是指能够明确确定人或动物的依赖于血管生成类疾病的存在或其种类的方法。
抗血管生成蛋白可以用于检测和定量能结合改蛋白抗体的诊断方法与试剂盒。这些试剂盒可以检测血液循环中抗血管生成蛋白的抗体，这些蛋白存在表明由原位肿瘤分泌的抗血管生成蛋白存在下的扩散。这种学血液中有抗血管生成蛋白的患者更有可能发展成多肿瘤或癌症，在治疗或短期的恢复后也更有可能发生复发。这些抗蛋白的抗体的Fab片断可以作为抗原用于制备抗-蛋白Fab片断抗血清，它们可以用来中和抗血管生成蛋白的抗体。这种方法可以减少由抗-蛋白抗体引起的对循环的蛋白的清除。从而有效地提高血液循环中抗血管生成蛋白的水平。
本发明亦包括对抗血管生成蛋白特异的受体的分离提取。对组织具有高的结合亲和性的蛋白片断可以用亲和柱来分离提取抗血管生成蛋白的受体。分离纯化这些受体是朝向阐明抗血管生成蛋白作用机理的基本步骤。分离受体与鉴定其激动剂和拮抗剂将有助于发展调节这些受体活性－生物活性的最后的途径－的药物。分离这些受体使能够设计核酸探针，用原位杂交或溶液杂交技术来确定受体的位置和合成情况。进一步地，可以分离受体的基因，将其插入到一个表达载体，转化细胞，譬如病人的肿瘤细胞，以增强细胞、组织或肿瘤结合抗血管生成蛋白与抑制局部血管生成的能力。
抗血管生成蛋白用于发展亲和柱，以分离肿瘤细胞培养物中的抗血管生成蛋白的受体。分离纯化得到的受体进行氨基酸序列分析。利用序列信息，可以鉴定、分离得到编码受体的基因。然后，将克隆的基因插入到表达载体中。这些技术都是本领域中非常熟知的技术。将编码受体的核算序列转化到肿瘤细胞中，通过转化的肿瘤细胞表达出受体，可以提高这些细胞对于内源性的或外源性的抗血管生成蛋白的反应能力，从而减少转移瘤的生长速度。
本发明的血管生成抑制蛋白可以用标准的微量化学设备合成，其纯度用FPLC和质谱法检验。蛋白质合成、FPLC和质谱的方法都是本领域中很普通熟知的技术。抗血管生成蛋白和它们的受体蛋白在重组大肠杆菌或酵母表达系统中表达，用柱层析方法纯化。
可以合成抗血管生成蛋白的不同片断，用于各种用途，例如(但不限于)用于制备特异性抗血清的抗原，用作抗血管生成蛋白结合部位的激活剂或抑制剂，或结合细胞毒素剂，用于杀死结合了抗血管生成蛋白的细胞。
合成的抗血管生成蛋白片断可以用于各种用途。用放射性标记对抗血管生成蛋白受体具有高亲和性的蛋白片断，用于放射性自显影和膜结合技术的显示与定量分析。这一应用为诊断与研究提供了一个重要的工具。关于受体结合特性的知识有助于探究受体的信号传导机理。
可以使用标准方法将抗血管生成蛋白及由它们衍生的蛋白与其它分子偶联起来。抗血管生成蛋白的氨基端和羧基端都含有酪氨酸与赖氨酸残基，用放射性或非放射性技术标记。譬如用传统技术进行放射性标记(酪氨酸-氯胺T，放射性碘iodogen，乳过氧化物酶；赖氨酸残基-Bolton-Hunter试剂)。这些偶联技术在本领域中都是很熟知的常规技术。或者，将酪氨酸或赖氨酸加入到没有这种残基的蛋白质中，以帮助在这些蛋白的氨基端和羧基端进行放射性标记。偶联技术是基于一些氨基酸残基上的可利用的功能基团如(但不限于)氨基、巯基、羧基、苯基、咪唑基。各种影响这些偶联反应的试剂包括戊二醛，重氮对二氨基联苯(diazotized benzidine)，碳二亚胺(carbodiimide)和邻苯醌(p-benzoquinone)。
在各种应用中，用化学法将抗血管生成蛋白与同位素、酶、载体蛋白、细胞毒素试剂、荧光分子、化学发光试剂、生物发光试剂和各种其他化合物相偶联。对于特定的反应，偶联反应的效率用各种不同技术来确定。譬如本发明的蛋白的放射性标记使用具有高特异性的氯胺T(Chloramine T)和NaI125，反应用偏亚硫酸氢钠(Sodium metabisulfite)终止，反应混合物用一次性柱子脱盐。被标记的蛋白被洗脱出来，收集组分。从组分中移出等份试样，用伽马计数器测定放射性强度。用这种方法，没有反应的NaI125被从蛋白中分离出来。具有最高特异性放射性的蛋白组分储存备用，如用于分析抗血管生成蛋白结合抗血清的能力。
另外，用半衰期短的同位素标记抗血管生成蛋白，使用X射线断层摄影技术或其它现代的放射性成像技术观察在体内受体的结合部位，以此确定肿瘤的位置。
在这些合成的蛋白质内进行系统的氨基酸取代，得到对抗血管生成蛋白受体具有高亲和性的蛋白激动剂或抑制剂，它们可以提高或减少对受体的结合。这些激动剂用来抑制微小转移瘤的生长，从而限制癌症的扩散。抗血管生成蛋白的抑制剂在血管生成不足的情况下使用，以阻断抗血管生成蛋白的抑制作用，提高血管生成。例如，该疗法对糖尿病患者提高伤口愈合有疗效。
本发明进一步用以下实施例予以阐明，但这些实施例并不意味着会限制本发明的范围。相反，还应该清楚地理解的是，为还可以有各种其它实施方案，或修正方案和任何等同的其它实施方案，只要这些方案在本领域技术人员阅读了本文所述的内容后变为了然，且并不背离本发明的实质和/或附录的权利要求的范围。实施例实施例1天然Arresten的分离从人胎盘和羊膜组织可以得到毫克级的Arresten。分离Arresten或其它类似的蛋白的方法已经有报道(如，Langeveld,J.P.等，1988,J.Biol.Chem.263:10481-10488；Saus,J.等,1988,J.Biol.Chem.263:13374-13380；Gungwar S.等，1990,J.Biol.Chem.265:5466-5469；Gungwar S.等，1991,J.Biol.Chem.266:15318-15324；Kahsai,T.Z.等,1997,J.Biol.Chem.272:17023-17032)。Neilson等对重组Arresten的生产也有报道(1993,J.Biol.Chem.268:8402-8406)。该蛋白也可以在293肾脏细胞中表达(譬如，用Hohenester E.等描述的方法，1998,EMBO J.17:1656-1664)。Arresten也可以按Pihlajaniemi T.等的方法分离得到(1985,J.Biol.Chem 260:7681-7687)。
图1显示了Ⅳ型胶原蛋白NC1结构域α链的核酸序列(SEQ IDNO:1)和氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。上面标记了Arresten蛋白的大概起始与结束位置。Arresten基本上包括了Ⅳ型胶原蛋白α链的NC1结构域，可能还有连接区，它刚好是NC1结构域前的12氨基酸序列。
用细菌胶原蛋白酶从人胎盘分离天然Arresten，使用阴离子交换层析，凝胶过虑层析，HPLC和亲和层析法进行分离纯化(GunwarS.等，1991,J.Biol.Chem.266:15318-24；weber S.等，1984,Eur.J.Biochem.139:401-410)。来自人胎盘的Ⅳ型胶原蛋白是HPLC纯化的，用C-18疏水柱(Pharmacia，美国新泽西州Piscataway)。蛋白用乙晴梯度(32％-39％)洗脱。有一个主峰，一个小的双峰。SDS-PAGE分析发现第一个峰有两条带，第二个峰没有蛋白条带。免疫印迹也发现在第二个峰没有检测到蛋白，第一个峰证明是Arresten。
实施例2用大肠杆菌生产重组的Arresten从α1 NC1(Ⅳ)pDS载体上用PCR扩增Arresten基因(NeilsonE.G.等，1993,J.Biol.Chem.268:8402-8405)，使用正向引物5’CGG GAT CCT TCT GTT GAT CAC GGC TTC-3’(SEQ ID NO:3)和反向引物5’-CCC AAG CTT TGT TCT TCT CAT ACA GAC-3’(SEQ ID NO:4)。得到的cDNA片断用BamHⅠ和HindⅢ酶切，连接到已酶预切好的pET22b(+)载体上(Novagen公司，美国威斯康星Madison)。图2表示质粒的构建过程。Arresten处于pelB前导序列的下游，且与其处于同一阅读框内，这样可以使表达的Arresten分泌到周质腔中，以可溶性蛋白形式表达。蛋白另外加上一段载体序列，编码一段氨基酸MDIGINSD(SEQ ID NO:13)。序列3’端与多聚组氨酸标签(His Tag)相连。在cDNA的3’与His-Tag之间的额外载体序列编码氨基酸序列KLAAALE(SEQ ID NO:14)。对这两条链的阳性克隆进行序列测定加以鉴定。
将含有编码Arresten基因的质粒首先转化E.Coli.HMS174(Novagen公司，美国威斯康星州Madison)，然后转化BL21细胞(Novagen公司，美国威斯康星州Madison)进行表达。用过夜培养的细菌培养液接种到500 ml LB培养基中。继续培养约4小时，使培养液OD600达到0.6。然后加入IPTG(终浓度为1-2mM)，诱导蛋白表达。诱导两个小时后，5000g离心收集细胞，用6M胍，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液悬浮细胞，裂解。悬浮的细胞用超声波破碎，12,000g离心30分钟。上清过一5ml的Ni-NTA琼脂糖柱子(Qiagen公司，德国Hilden)4-6次，流速为2ml/min。非特异性结合的蛋白用含有10mM和25mM咪唑的8M尿素，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液洗脱除去。然后用增加咪唑浓度(50mM,125mM,250mM)的8M尿素，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液洗脱Arresten蛋白。洗脱得到的蛋白于4℃对PBS透析两次，有少部分蛋白在透析过程中会沉淀下来。收集透析过的蛋白，以约3500g离心，分离沉淀与上清部分。每一组分的蛋白浓度用BCA分析法(PierceChenical有限公司，美国，伊利诺斯州Rockford)和定量SDS-PAGE分析法确定。沉淀部分蛋白约占22％,78％在溶液中回收。所得总蛋白产量约为10mg/l。
大肠杆菌表达的蛋白主要以溶解性蛋白的形式分离，SDS-PAGE电泳表明在29 kDa处有一单体条带。额外的3 kDa来自多聚连接子和组氨酸标签(His-Tag)序列，用Arresten与6His-Tag抗体进行免疫检测。
实施例3在293胚胎肾脏细胞表达Arresten用含有α1(Ⅳ)NC1基因的pDS质粒为模板扩增Arresten,并在同一阅读框架中将信号肽序列加到真核表达载体pcDNA3.1上(Invitrogen公司，美国加州San Diego)。将α1(Ⅳ)链5’端的信号肽克隆到NCⅠ域的5’端是为了可以让蛋白分泌到培养基中。含有Arresten基因的重组质粒用侧翼引物测序。没有错误的cDNA进一步纯化，用于体外翻译研究以确认蛋白表达。以CaCl法，用含有Arresten的质粒和对照质粒转化293细胞，用遗传霉素(geneticin)筛选被转化的阳性克隆(Life Technologies/Gibco BRL,美国马里兰州Gaithersburg)。在抗生素存在下，将细胞经过3周的处理，直至没有明显的细胞死亡为止。然后将克隆铺展到T225培养瓶中培养。收集上清，用Amicon浓缩仪进行浓缩(Amicon)处理。浓缩过的上清用SDS-PAGE电泳，免疫印迹及ELISA分析Arresten的表达。用ELISA检测到上清中有很强的结合。SDS-PAGE分析表明主要条带是30 kDa处的一条单一的条带。含有Arresten的上清用对Arresten特异的抗体亲和层析柱分离纯化(Gunwar等，1991,J.Biol.Chem.266:15318-24)。得到一个主峰，含有分子量约为30 kDa的单体，对Arresten抗体具有免疫反应性。每升培养液约可得到蛋白1-2mg重组Arresten蛋白。
实施例4Arresten抑制内皮细胞的增殖C-PAE细胞在含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中培养至细胞汇合，保持接触抑制48小时。对照细胞是786-0(肾癌)细胞，PC-3细胞，HPEC细胞和A-498(肾癌)细胞。细胞用胰蛋白酶在37℃保温5分钟消化，收集(Life Technologies/Gibco BRL,美国马里兰州Gaithersburg)。将含有12500个细胞的、1％FCS的DMEM的细胞悬浮液加到用10μg/ml的纤连蛋白包裹过的24孔的板上。在含5％CO2，湿度95％的条件下37℃保温24小时。去培养基，代之以含0.5％FCS和3ng/ml的bFGF(R&D系统公司，美国明尼苏达州Minnesota)的DMEM。没有刺激的对照细胞不加bFGF。细胞用各种浓度(0.01μg/ml至50μg/ml)的Arresten或endostatin处理。所有的孔都在处理的时候加入1微居里的3H-胸腺嘧啶。24小时候后，去培养基，小孔用PBS洗。用1N NaOH将细胞洗下来，加到一个有4ml的Scinti Verse溶液(Fisher Scientific公司，美国宾夕法尼亚州Pittsburgh)的闪烁小管里。吸收的胸腺嘧啶用闪烁计数器测定。结果如图3A与3B所示，它们表示用不同浓度的Arresten或endostatin处理的C-PAE细胞吸收3H-胸腺嘧啶的情况。图4A,4B,4C和4D表示用Arresten或endostatin处理的对照组细胞情况，Arrestaten对786-0细胞(图4A),PC-3细胞(图4B),或HPEC细胞(图4C)具有的效应较小。Endotstin对A-498细胞的效应(图4D)较小。图3与图4的所有组都代表三个样本的数据。
实施例5Arresten抑制内皮细胞迁移Arresten和endostatin对FBS诱导的化学趋向性的抑制效应是以人脐带内皮细胞(ECV-304细胞，ATCC1998-CRL,ATCC(American Type Culture Collection，美国VA州Manassas市大学街10801号，20110-2209)使用Boyden分析法(美国马里兰州Jhon Cabin的Neuro-Probe有限公司)测定的。ECV304细胞在含有10％的FBS和5 ng/ml DilC18(3)活体荧光染色剂(美国俄勒冈州EugeneMolecular Probes有限公司)的M199培养基中生长过夜。胰蛋白酶消化后，用含有0.5％FBS的M199培养基洗，稀释细胞，将60000个细胞接种到每个孔的上层室中，同时加入(或不加)Arresten或endostatin(2-40μg/ml)。下层室加入含有2％的FBS的M199作为化学趋向剂，含有细胞的室与化学趋向剂之间用孔径为8μm多聚碳酸酯滤膜(Poretics公司，美国加州Livermore)隔开。37℃在5％CO2，湿度95％的条件下保温4.5小时。去掉没有迁移的细胞，用PBS缓冲液洗上层小室，过滤膜用塑料刀片刮，浸泡于含4％福尔马林的PBS中，置于玻璃幻灯片上。用一强功率的荧光源，使用数字式的SenSysTM相机，利用PMIS软件处理(RoperScientific/Photometerics，美国亚利桑那州Tue\cson)可以记录到多张独立相似的图片。图5A,5B,5C显示2μg/ml的Arresten与20μg/ml一样的有效。细胞计数用软件OPTIMAS 6.0(MediaCybemetics公司，纽约Rochester)进行，结果如图6所示，显示用图解的形式表示在显微照片中所看到的结果。
实施例6Arresten抑制内皮血管的形成为了测试对内皮血管形成的抑制，在24孔板的每孔中加入320μl matrigel(Collaborative Biomedical Products公司，美国马萨诸塞州Bedford)，让其聚合(Grant,D.S.等，1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63)。将约25,000个小鼠大动脉内皮细胞用EGM-2培养基(Clonetics Corporation，美国加州San Diego)悬浮，不加抗生素，加到每个孔中。细胞用逐渐增加浓度的Arresten或者BSA，无菌PBS或7S结构域处理。所有分析都做三个平行。细胞在37℃保温24-48小时，用CK2奥林巴斯显微镜(CK2 Olympus microscope)(目镜3.3倍，物镜10倍)观察。然后用400DK涂覆的TMAX胶卷(Kodak)拍照。将细胞用定影液染色(Sigma Chemical Company，美国密苏里州圣路易斯)，拍照。拍十次，计数所有的血管数，计算平均值。结果如图7所示，结果表明，与对照比较起来，Arresten抑制了血管形成。由图8A可见具有代表性的血管生成较好者。图8B表示用0.8μg/ml的Arresten处理，MAE细胞很少或没有血管生成者(100X显示)。
也用C57/BL6小鼠进行体内的Matrigel分析。Matrigel在4℃解冻过夜。然后将其与20 U/ml的肝素(Pierce Chemical公司，美国伊利诺斯州Rockford),150 ng/ml的bFGF(R&D System公司，美国明尼苏达州州Minneapolis)，和1μg/ml的Arresten或10μg/ml的endostatin混合。将混合物用21g的针皮下注射。对照组为同样的混合物，只是不加血管生成抑制剂。14天后，杀死小鼠，取出matrigel塞子，matrigel塞子用多聚福尔马林PBS室温固定4个小时，然后转到PBS中放置24小时。Matrigel塞子用石蜡包埋，切片，用H&E染色。切片用光学显微镜检查，计数形成的血管数，计算平均值。
当Matrigel在有bFGF存在下，有或没有增加浓度的Arresten时，在1μg/ml Arresten和10μg/ml endostatin下观察到血管数减少了50％。这些结果表明，Arresten通过抑制血管形成过程的不同步骤而影响新的血管形成。结果也表明在1μg/ml浓度下Arresten与10μg/ml的endostatin在抑制体内新血管形成作用上的效果是一样的。
实施例7:Arresten抑制体内肿瘤转移对C57/BL6小鼠静脉注射1,000,000个MC38/MUC1细胞(GongJ.等，1997,Nat.Med.3:558-61)。26天内，每隔一天，对五只对照小鼠注射无菌10 mM的PBS，对六只实验小鼠注射4mg/ml的Arresten。26天后，计数每只小鼠的肺癌结个数，对每组取平均值。每组观察到有两只死亡。发现Arresten明显的减少了原发肿瘤结的形成，从对照组的300个减少到200个。
实施例8Arresten抑制体内肿瘤的生长将2,000,000个786-0细胞通过皮下注射到7至9周龄的雄性无胸腺裸鼠体内。第一组六只小鼠，让肿瘤长至700mm3大小。第二组小鼠六只，肿瘤让其长至100mm3大小。每天注射无菌的ArrestenPBS溶液，连续注射十天，700mm3的小鼠注射剂量为20mg/kg。100 mm3的小鼠注射剂量为10 mg/kg。对照小鼠注射BSA或者PBS溶液。结果如图9A,9B所示。图9A的曲线表示处理后肿瘤体积的从700mm3的增加，10mg/kg Arresten处理(□)，BSA处理(+)，对照(●)。用Arresten处理的肿瘤大小从700mm3缩小到500mm3，BSA处理的肿瘤大小及对照组的10天内增大至12000mm3。图9B表示肿瘤最初大小为100mm3小鼠，用Arresten处理(□)的结果也是导致肿瘤缩小至80mm3，而BSA处理(+)的10天内肿瘤大小增长至500mm3。
收集大约5,000,000个PC-3(前列腺腺癌细胞)，静脉注射到7至9周龄的雄性无胸腺裸鼠体内。让肿瘤生长10天。然后用Vernier测径器测量肿瘤大小，用标准公式(宽2X长×0.52)计算肿瘤体积大小(O’Reilly M.S.等，1997,Cell,88:277-85；O’Reilly M.S.等，1994,Cell 79:315-28)。动物按每组5-6只分组。实验鼠每天注射Arresten(10mg/kg/day)或endostatin(10m/kg/day)。对照鼠每天注射PBS溶液。结果如图9C所示。表明Arresten(□)对肿瘤生长抑制效应与endostatin(▲)一样好甚至稍微更好。重复实验，不过Arresen剂量只用4mg/kg/day。结果如图9D所示。8天后停止处理(箭头)，但是不另外施加Arresten时，12天内仍然有明显的抑制效应。12天后，Arresten的抑制效应开始消失。
实施例9循环系统中Arresten的半衰期从人胎盘提取天然的Arresten蛋白，通过静脉注射到体重200g的大鼠中，每只大鼠的剂量为5mg。直接通过ELISA法用抗Arresten抗体分析不同时间血清中Arresten的存在。作为对照，亦分析每个时间点的血清蛋白，须确保使用相同量的血清。发现血清中循环的Arresten半衰期大约为36小时。
另一组通过和/或皮下注射方式注射人Arresten I.P.,观察肺，肾，肝，胰脏，脾脏，脑，睾丸，卵巢等器官的病理标志。进行ELISA分析，在这些大鼠血清中检测到Arresten抗体存在，在肾小球基底膜上发现有内源性的IgG沉积物存在，这在以前也曾观察到(Kalluri,R.等，1994,PNAS USA 91:6201-5)。肾中的抗体沉积物并没有伴随着任何发炎迹象或肾脏功能损坏。这暗示Arresten是没有病原性的。
实施例10Arresten对酶MMP-2的结合及抑制MMP-2,MMP-9及这些酶的抗体从Oncogene公司购买得到。如前人所述(Kalluri R.等，1994,PNAS USA,91:6201-5)用直接从人胎盘分离得到的天然Arresten做ELISA分析，MMP-2和MMP-9都对Arresten有特异性结合。它们不结合7S结构域。这种结合不依赖于TIMP-2和TIMP-1的结合。
为了评估Arresten对降解基底膜的作用，将Matrigel与MMP-2和MMP-9一起37℃保温6小时，同时轻微震荡。用SDS-PAGE电泳分析上清，用Ⅳ型胶原蛋白α2链的抗体作免疫印迹实验。在降解分实验的开始，逐渐增加浓度加入Arresten，观察到MMP2活性被抑制。SDS-PAGE胶中的NC1结构域以单体、二聚体形式存在，可以用Ⅳ型胶原蛋白的抗体作western印记实验观察到。逐渐增加浓度的Arresten抑制MMP-2对基底膜的降解作用。表明Arresten可以结合MMP-2，阻止其对基底膜胶原蛋白降解作用。对于MMP-9也得到了类似的结果。
实施例11在大肠杆菌中生产重组Canstatin图10表示Ⅳ型胶原蛋白NC1结构域α2链的核酸序列(SEQ IDNO:5)和氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。编码Canstatin的序列用PCR扩增，以α2 NC1(Ⅳ)/pDS载体为模板(Neilson E.G.等，1993,J.Biol.Chem.268:8402-5)，正向引物为5’-CGG GAT CCT GTC AGC ATCGGC TAC CTC-3’(SEQ ID NO:7)，反向引物为5’CCC AAG CTTCAG GTT CTT CAT GCA CAC-3’(SEQ ID NO:8)。得到的cDNA片断用BamhⅠ和HindⅢ酶切，连接到预切好的pET22b(+)载体上(Novagen公司，美国威斯康星州Madison)。质粒构建过程如图11所示。这样将Canstatin基因插入pelB前导肽的下游且与其为同一读码框，这样可以使蛋白以可溶性蛋白的形式表达分泌到周质腔中。另有一段额外的载体序列MDIGINSD(SEQ ID NO:13)加到蛋白上。序列3’端与一段多聚His-Tag序列相连。在cDNA与His-Tag序列之间有一段载体序列编码氨基酸KLAAALE(SEQ ID NO:14)。阳性克隆经双链测序确认。
带有Canstatin的质粒首先转化大肠杆菌细胞HMS174(Novagen公司，美国威斯康星州Madison)。然后转化到BL21细胞中进行表达(Novagen公司，美国威斯康星州Madison)。将过夜培养的菌液接种到500ml LB培养基中。然后培养约4小时，时OD600达到0.6。加入终浓度5mM的IPTG诱导蛋白表达。诱导两个小时后，5000g离心收集细胞，用含6 M胍，0.1M NaH2PO4,0.01MTris.HCl,pH 8.0的缓冲液悬浮细胞。悬浮的细胞用超声波破碎，12,000g离心30分钟，上清过一5ml的Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen,德国Hilden)4-6次，流速2ml/min。非特异性结合的蛋白分别用15ml的含10mM,25mM,50mM咪唑的8M尿素，0.1MNaH2PO4,0.01MTris-HCl,pH 8.0的缓冲液洗去。Canstatin蛋白用分别用含125mM和250mM)咪唑的8M尿素，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl,pH 8.0缓冲液洗脱。洗脱的蛋白对PBS在4℃透析两次。透析时其中一部分蛋白会沉淀，收集透析过蛋白，3,500g离心，将沉淀与上清分离。每一部分的蛋白量用BCA分析(PierceChemical公司，美国伊利诺斯州Rockford)确定，用SDS-PAGE电泳分析定量。SDS-PAGE分析表明在29 kDa处有一单体条带，额外的3 kDa是来自多聚Linker和His-Tag序列。收集含有Canstatin蛋白的洗脱组分，对PBS透析，以备下面的分析用。SDS-PAGE和wester印迹分析过的Canstatin用抗-His-Tag抗体进行检测。用Ⅳ胶原蛋白NC1抗体也检测到细菌表达的重组Canstatin蛋白。
大肠杆菌表达的蛋白主要以可溶性蛋白的形式分离。总蛋白中沉淀部分约占40％，其余的溶液部分占60％。蛋白质的总产量大约为15m/l。
实施例12Canstatin在胚肾细胞293中的表达。
含有α2(Ⅳ)NC1的pDS质粒(Neilson,E.G.等，1993,J.Biol.Chem.268:8402-5)被用于PCR扩增Canstatin，在此过程中，一段信号肽序列可以按设计插入真核表达载体pcDNA3.1上(InⅣitrogen公司，San Diego,California,USA)。将全长α2(Ⅳ)链的5’端的前导肽序列克隆导NC1区域的5’端以使蛋白质分泌到培养基中。使用侧边引物对含有Canstatin的重组载体进行测序。进一步纯化无错的cDNA克隆，并用于体外翻译研究以验证蛋白质的表达。用氯化钙法用含有Canstatin的质粒和对照质粒转化293细胞(Kingstaon.R.E.,1996，“磷酸钙转染”pp.9.1.4-9.1.7,见“最新分子生物学方法”，Ausubel,F.M.,等编，wiley和Sons公司，纽约市，NY,USA)。转化的克隆用庆大霉素(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)抗生素筛选。在抗生素存在的情况下培养细胞三周，直至没有细胞死亡。细胞群落在T-225摇瓶中扩大培养生长直至汇合。然后收集上清并用amicon离心机(Amicon公司)离心浓缩。浓缩的上清用SDS-PAGE，免疫杂交和ELISA方法分析Canstatin的表达。通过ELISA方法可以探测到上清的强烈结合。含有Canstatin的上清用Canstatin专一性的抗体进行亲和层析(Gunwar,S.等，1991,J.Biol.Chem.266:15318-24)。分离到一个主要的峰含有大约24 kDa的纯化的单体，该单体具有对于Canstatin抗体的免疫活性(抗-α2 NC1抗体，1∶200稀释)。
实施例13Canstatin抑制内皮细胞的增殖。
在含有10％的胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中培养小牛大动脉内皮(CAPE)细胞并保持接触抑制48小时。在37℃用胰蛋白酶(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)消化5分钟来收集细胞。将悬浮在含有0.5％的胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中的12,500个细胞加到用10ug/mlfibronectin包被的24孔板的每一个孔中。在37℃,5％CO2和95％的湿度下培养细胞24小时。移去培养基并用含有0.5％的FCS(未激活的)或者10％的FCS(激活并处理过的细胞)的DMEM培养基更换。780-0,PC-3和HEK 293细胞作为对照并生长至汇合，胰蛋白酶消化并用同样的方法铺在平板上。细胞用三倍体积0.025到40mg/ml浓度的Canstatin或者endostatin处理。在胸腺嘧啶结合试验中，所有孔在处理时都加入1毫居的3H-胸腺嘧啶。24小时后，移去培养基并用PBS洗孔三次。用1N的NaOH抽提细胞并加入到含有4ml ScintiVerse Ⅱ溶液(Fisher Scientific公司，Pittsburgh,Pennsylvania,USA)闪烁小瓶中。用闪烁计数器测量胸腺嘧啶的结合。
结果显示如图12A和12B。图12A是一个柱状图，显示了不同量的Canstatin对于CAPE细胞增殖的影响。每分钟胸腺嘧啶结合的计数显示在y-轴上。在x-轴上0.5％是0.5％的FCS(未激活的)对照，10％是10％的FCS(激活)对照。用增加量的Canstatin浓度处理可以稳定地减少胸腺嘧啶地结合。图12A是一个柱状图，显示了在非内皮细胞786-0,PC-3和HEK 293细胞中增加量的Canstatin对于胸腺嘧啶结合地影响。每分钟胸腺嘧啶结合的计数显示在y-轴上，x-轴显示的是用增加量的Canstatin浓度处理的三个细胞系，0.5％的FCS(未激活的)和10％的FCS(激活)对照。各组代表三次的样，柱代表每分钟的平均数加上平均标准方差。
还进行了溴酚兰染色试验。3,100个细胞加到每个孔中并处理如上，然后使用Oliver等的方法(Oliver等，1989,J.Cell.Science92:513-80)对细胞进行计数。各孔用100ml的1×PBS清洗一次，然后各孔加入在中性缓冲溶液中的10％甲醛(Sigma化学试剂公司，St.Louis,Missouri,USA)室温固定30分钟。除去甲醛，细胞用在0.01M硼酸盐缓冲液(pH 8.5)中的1％溴酚兰(Sigma化学试剂公司，St.Louis,Missouri,USA)室温染色30分钟。用100ml的0.1N的HCl/乙醇(1∶1混合物)室温抽提溴酚兰一小时。溴酚兰染色的量在小平板读数计(BioRad公司,Hercules,Califomia,USA)上用655nm波长的光吸收进行测量。
结果显示如图12C.和12D。图12C是一个柱状图，显示了不同量的Canstatin对于CAPE细胞染色剂吸收的影响。OD655吸收值显示在v-轴上。“0.1％”代表的是0.1％的FCS处理的对照(未激活的)，“10％”是10％FCS处理的对照(激活)。小条表示的是用增加量浓度的Canstatin处理。在CAPE细胞中，可以在用大约0.625-1.25μg/ml水平的Canstatin处理的未激活的细胞中看到染料吸收减少。图12D是一个柱状图，显示了不同浓度的Canstatin对于非内皮细胞HEK 293(白色柱)和PC-3(斜线柱)的作用结果。OD655吸收值显示在y-轴上。“0.1％”代表的是0.1％的FCS处理的对照(未激活的)，“10％”是10％FCS处理的对照(激活)。柱代表655nm相对吸收单位平均值加上每一处理浓度下8个孔的平均标准方差。
检测到Canstatin对于10％血清激活的内皮细胞剂量依赖型抑制的ED50值为大约0.5μg/ml(如图12A和12C)。在Canstatin剂量上升到0.5mg/ml时，没有观察到对于肾肿瘤细胞(786-0)，前列腺肿瘤细胞(PC-3)，或者人胚胎肾细胞(HEK293)有明显的作用效果(如图12B和12D)。这些内皮细胞特异性显示了Canstatin可能是一种非常有效的抗血管生成试剂。
实施例14Canstatin抑制内皮细胞迁移。
在血管生成过程中，内皮细胞不仅增殖而且迁移。因此，可以估计Canstatin会作用于内皮细胞的迁移。使用Boyden小室试验(Nero-Pro公司，Cabin John,Maryland,USA)检测到了Canstatin和endostatin对于人脐带内皮细胞(HUVECs)的FBS诱导的趋化性有抑制作用。HUVECs细胞生长在含有10％PBS和5ng/mlDiIC18(3)(Molecular Probes公司，Eugene,Oregon,USA)的M199培养基(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)中进行活性荧光染色过夜。胰蛋白酶消化后，用含有0.5％PBS的M199培养基清洗和稀释细胞，将60,000个细胞加入到上层小室的孔中同时加入或者不加入Canstatin(0.01或者1.0mg/ml)。含有2％PBS的M199培养基放入下层作为趋化剂。含有细胞的小室和趋化剂用8μm孔径的聚碳酸酯膜(Poretics公司，Livermore,California,USA)分开。小室在37℃,5％CO2和95％的湿度下温育4.5小时。弃去未迁移细胞，用清洗上层细胞，用塑料铲刮下滤膜，用含4％甲醛的PBS溶液固定并放在玻璃片上。使用高荧光视野用SenSysTM数码相机记录下一些独立的同源图像，运用PMIS(RoperScientific/Photometrics公司，Tucson,Arizona,USA)图像处理软件进行操作。使用OPTIMIZE6.0软件程序(Media Cybernetics,Rochester,NY)对于细胞进行计数(Klemke,R.L.等，1994,J.Cell.Biol.127:859-66)。
结果显示如图13，该柱状图显示了每个视野中的迁移的内皮细胞的数目(y-轴)，这些细胞分别未用VEGF(没有VEGF或没有血清)，使用处理VEGF(含1％FCS和10ng/ml VEGF)，以及使用0.01μg/ml的Canstatin(含1％FCS和10ng/ml VEGF和0.01μg/ml的Canstatin)和1μg/ml的Canstatin(含1％FCS和10ng/mlVEGF和1μg/ml的Canstatin)的进行处理过。
观察到在10ng/ml时Canstatin对于HUVECs细胞的增殖具有明显的抑制作用。Canstatin抑制内皮细胞增殖和迁移的能力暗示它在血管生成的不仅一个步骤中起作用。可选地，Canstatin可能作为受激地内皮细胞地细胞凋亡的信号从而能够同时作用于细胞地增殖和迁移。据报道凋亡可以被agiostatin，另外一种抗血管生成的分子诱导(O’Reilly,M.S.等，1994,Cell 79:315-28；Lucas,R.等，1998,Blood 92:4730-41)。
实施例15Canstatin抑制内皮管的生成作为第一个Canstatin抑制血管生成能力的试验，推断出他可以阻止内皮细胞在基质胶，即一种鼠基质膜的固体胶中形成管。当鼠大动脉内皮细胞培养在基质胶中时，它们很快排列并形成空的管状结构。
将基质胶(C ollaborative Biomedical Products公司，Bedford,Massachusetts,USA)(320ml)加到24孔板的每个孔中并使之聚合(Grant,D.S.等，1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63)。将在不含抗生素的EGM-2(Clonetics公司，San Diego,California,USA)培养基中的25,000个鼠大动脉内皮细胞(MAE)悬浮物加到铺有基质胶的每个孔中。这些细胞用Canstatin,BSA，无菌PBS或者α5-NC1区以增加的浓度进行处理。所有的试验都做三次。细胞在37℃温育24-28小时并用CK2 Olympus显微镜观察(3.3×目镜，10×物镜)。使用400涂有DK的TMAX胶卷照相(Kodak公司)。然后细胞用diff-quik固定剂(Sigma化学试剂公司，St.Louis,Missouri,USA)约4周后，将这些鼠分成4鼠一组。对于试验组(4只鼠)每天皮内注射总体积为0.2ml的3mg/kg剂量的Canstatin。对照组(4只鼠)每天给予相同体积的PBS。使用Vernier卡尺测量肿瘤的长和宽，并用标准的公式长度×宽度2×0.52来计算肿瘤的体积。肿瘤的体积从26mm3到73mm3，在给定日期计算的肿瘤体积除以处理的笫一天的体积以此获得微分肿瘤体积(V/V)，如上所述。每一组中包括5只小鼠。结果显示在图15B中，该图显示的是微分的肿瘤体积(y轴)±标准方差，对处理的天数(x轴)作图。相对于对照(□)来说，Canstatin(■)处理的肿瘤体积只有微小的增加，这一结果与以endostatin(○)处理获得的结果有明显的差别。
对于肾脏细胞瘤来说，将在2百万个786-0细胞皮下注射到7到9周大的无胸腺裸鼠体内。使肿瘤生长到大约100mm3到大约700mm3。每一组中有6只鼠。每天皮内注射10mg/kg剂量的Canstatin,注射10天。对照组每天给予相同体积的PBS。结果显示在图15C(100mm3的肿瘤)和31D(700mm3的肿瘤)中。在两个组中，处理的肿瘤(■)相比较对照(□)有明显的萎缩。
大肠杆菌中产生的Canstatin抑制小的(100mm3的肿瘤，图15C)和大的(700mm3的肿瘤，图15D)肾脏细胞瘤的生长。对于严重综合性免疫缺陷小鼠(SCID)中的人前列腺肿瘤(PC-3)来说，10mg/kg剂量的Canstatin使得肿瘤的相对体积为只注射载体的小鼠的55％。在无胸腺裸鼠中，使用了相对低剂量的Canstatin和endostatin,3mg/kg剂量的Canstatin具有与8mg/kg剂量的endostatin一样的效果。在所有的体内研究中，小鼠表现为健康，没有出现衰老的迹象，试验中没有老鼠死亡。
实施例17Canstatin处理小鼠的CD31免疫组织化学体内试验中肿瘤体积的减少显示了对这些肿瘤中血管形成的抑制作用。为检测肿瘤管，进行了石蜡包埋肿瘤切片的CD31抗体碱性磷酸酶免疫组织化学。切下的肿瘤组织用剃刀切成几块大约3-4mm厚的小块然后用4％的甲醛固定24小时。在脱水和石蜡包埋前组织转入PBS中。在石蜡包埋后，将组织切成3mm厚的切片并固定起来。对切片脱腊，重新水化，并用300mg/ml的蛋白酶ⅩⅩⅣ(Sigma化学试剂公司，St.Louis,Missouri,USA)在37℃预处理5分钟。用100％的乙醇终止反应。切片风干，在水化并用10％的兔血清封闭。然后玻片用1∶50稀释的鼠抗鼠CD31单克隆抗体(PharMingen公司，San Diego,California,USA)在4℃温育过夜，然后在37℃，30分钟温育两次，分别用1∶50稀释的兔抗鼠免疫球蛋白(DAKO)和鼠APAAP(DAKO)。用新品红进行颜色反应。切片用苏木精复染。
可以观察到Canstatin处理的肿瘤比对照肿瘤的血管的数目减少。实施例18在大肠杆菌中Tumstatin和Tumstatin突变体的重组生产Ⅳ型胶原的α3链的NC1区的核苷酸序列(SEQ ID N0:9)和氨基酸序列(SEQ ID NO:10)的显示于图16。Tumstatin编码序列是从α3 NC1(Ⅳ)/pDS载体(Neilson,E,G.等，1993,J.Boil.Chem.268:8402-5)经过PCR扩增而来的，使用的前端引物为5’-CGG GATCCG GGT TTG AAA GGA AAA CGT-3’(SEQ ID NO:11)，后端引物为5’-CCC AAG CTT TCA GTG TCT TTT CTT CAT-3’(SEQ IDNO:12)。获得的片段用BamHⅠ和HindⅢ酶消化，连接到预消化的pET22b(+)(Novagen公司，Madison,Wisconsin,USA)上。构建如图17所示。Tumstatin连接并融合到pelB前导肽的下游，从而使得它可以定位到周质空间和表达可溶性蛋白质。添加到蛋白质上的附加的序列编码氨基酸序列MDIGINSD(SEQ ID NO:13)。序列的3’末端连接着多组氨酸结合序列。在cDNA的3’末端和组氨酸结合序列之间的添加的载体序列编码氨基酸序列KLAAALE(SEQ IDNO:12)。阳性克隆在两条链上测序。编码Tumstatin的质粒结构先是转化到大肠杆菌HMS174(Novagen公司，Madison,Wisconsin,USA)中，然后转化到BL21(Novagen公司，Madison,Wisconsin,USA)中进行表达。在500ml LB培养基(Fisher Scientific公司，Pittsburgh,Pennsylvania,USA)中过夜培养细菌培养物。培养物生长4小时直到达到OD600值为0.6然后加入IPTG至终浓度为1mM以诱导蛋白质的表达。在诱导2小时后，用5,000×g离心收集菌体并用6M胍，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl,pH 8.0重悬菌体。重悬的菌体用超声波破碎，用12,000×g离心30分钟。上清部分以每分钟2ml的速度通过5ml的Ni-HTA琼脂糖柱(Qiagen公司，Hilden,Germany)4-6次。用含10mM和25mM的咪唑，8M尿素，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl,pH 8.0的溶液清洗柱子除去非特异性结合的蛋白质。在8M尿素，0.1M NaH2PO4,0.01MTris-HCl,pH 8.0的缓冲液中增加咪唑的浓度(50mM,125mM,和250mM)来将蛋白质从柱子上清洗下来。洗脱的蛋白质在4℃对PBS透析两次。在透析过程中总蛋白中的一部分沉淀下来。收集透析的蛋白质，在大约3,500×g离心将其分为不溶的部分(沉淀)和可溶的部分(上清)。
大肠杆菌表达的Tumstatin主要以可溶的蛋白质来分离，SDS-PAGE分析显示为一条31 kDa的条带。增加的3 kDa来自接头和组氨酸结合序列。含有这条大的部分被用于下一步的试验。通过BCA试验(Pierce化学公司，Rockforrd,Illinois,USA)检测每一部分中蛋白质的浓度，使用扫描浓度测量仪进行定量SDS-PAGE分析。在非还原条件下可以看到有一条代表Tumstatin二聚体的60 kDa的带，在还原条件下这条带被还原为31 kDa的单体。蛋白质的总的收获量为每升5mg。
重组的被删节的Tumstatin(Tumstatin-N53)缺少53个N端的氨基酸，在大肠杆菌中表达和纯化如另外一种突变体(Kalluri,R.等，1996,J.Biol.Chem.271:9062-8)。该突变体如图18所示，该组成图显示了在α3(Ⅳ)NC1单体中被删节的氨基酸的位置。实心圆表示了从Tumstatin删去N-端的53个氨基酸残基以产生“Tumstatin-N53”(Kalluri,R.等，1996,J.Biol.Chem.271:9062-8)。二硫键用短线标示，他们的存在位置在α1(Ⅳ)NC1和α2(Ⅳ)NC1中是不同的(Siebold，等1988,J.Biochem.176:617-24)。为清楚起见，图中只了标示两个可能存在的二硫键结构。
抗人α3(Ⅳ)NC1的兔抗体的制备方法如前所述(Kalluri,R.等，1997,J.Clin.Invest.99:2470-8)。单克隆鼠抗鼠CD31单克隆抗体购自PharMingen公司(PharMingen公司，San Diego,California,USA)。FITC结合的羊抗鼠IgG抗体，FITC结合的羊抗兔IgG抗体，以及结合辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG抗体购自Sigma化学试剂公司(Sigma化学试剂公司，St.Louis,Missouri,USA)。
用SDS-PAGE和免疫杂交分析获得的浓缩的上清中Tumstatin的表达，方法如前所述(Kalluri,R.等，1996,J.Biol. Chem.271:9062-8)。在12％的分离胶的不连续缓冲系统中进行一向SDS-PAGE。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用2％的BSA室温封闭30分钟。在封闭了残余的结合位点后，用清洗缓冲液清洗膜，在含有1％BSA,1∶1000稀释的一抗的PBS中温育。室温在摇床上温育过夜。然后用清洗缓冲液清洗膜，用结合辣根过氧化物酶的二抗室温摇床温育3小时。然后再次清洗杂交膜，加入底物(在0.05M的磷酸盐缓冲液中含有0.01％的氯化钴和镍铵，和对二氨基连苯)并在室温温育10分钟。然后倒出底物溶液，加入含有过氧化氢的底物缓冲液。当显示出带之后，用蒸馏水终止反应并干燥膜。可以看到一条31 kDa的条带。
实施例19Tumstatin在293胚胎肾细胞中的表达使用真核载体pcDNA3.1，人Tumstatin可以作为一种分泌的可溶性蛋白质在293胚胎肾细胞中表达。这种重组蛋白质(不含任何的纯化和检测位点)可以用亲和层析进行纯化，并用SDS-PAGE和免疫杂交分析从主峰中检测到一种纯的单体形式。
含有α3(Ⅳ)NC1(Neilson,E.G.等，1993,J.Biol.Chem.268:8402-5)的pDS质粒被用于PCR扩增Tumstatin，在此过程中可以加入一段前导肽序列同读码框融合到真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen公司，San Diego,California,USA)上。全长α3(Ⅳ)链的5’端的前导肽被克隆到NC1区的5’端以便使蛋白质能够分泌到培养基中。使用侧边引物对含有Tumstatin的重组载体在两条链上进行测序。进一步纯化无错的cDNA克隆，并用于体外翻译研究以验证蛋白质的表达。通过氯化钙法用含有Tumstatin的质粒和对照质粒转化293细胞(Sambrook,J.等，1989，分子克隆实验指南，冷泉港实验室，Cold Spring Habour,New York,USA,pps.16.32-16.40)。转化的克隆用庆大霉素(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)抗生素筛选。在抗生素存在的情况下培养细胞三周，直至没有细胞死亡。细胞群落在T-225摇瓶中扩大培养生长直至汇合。然后收集上清并用amicon离心机(Amicon公司)离心浓缩。浓缩的上清用SDS-PAGE，免疫杂交和ELISA方法分析Tumstatin的表达。通过ELISA方法可以探测到上清的强烈结合。
含有Tumstatin的上清用Tumstatin专一性的抗体进行亲和层析(Gunwar,S.等，1991,J.Biol.Chem.266:15318-24)。分离到一个主要的峰含有大约31 kDa的纯化的单体，该单体具有对于Tumstatin抗体的免疫活性(抗-α2 NC1抗体，1∶200稀释)。
实施例20Tumstatin抑制内皮细胞增殖使用大肠杆菌产生的蛋白质通过5H-胸腺嘧啶结合试验检测Tumstatin对C-PAE细胞的抗增殖活性。
细胞系和培养物786-0(肾肿瘤细胞系)，PC-3(人前列腺肿瘤细胞系)，C-PAE(牛肺动脉内皮细胞系)，MAE(鼠大动脉内皮细胞系)获自美国标准培养物保藏中心。786-0和C-PAE细胞系保藏在DMEM(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)中，ECV-304细胞系在M199中，MAE细胞系在EGM-2(Clonetics公司，San Diego,California,USA)中，培养基中补充有10％的胎牛血清(FCS),100单位/ml的庆大霉素，和100mg/ml的链霉素。
增殖试验.C-PAE细胞生长在含有10％的胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中并保持接触抑制48小时。C-PAE细胞被用于第二和第四阶段。786-0和PC-3细胞在本实验中被用作非内皮细胞的对照。用胰蛋白酶(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)在37℃消化5分钟来收集细胞。将在含有0.5％的胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中的12,500个细胞加到用10μg/mlfibronectin包被的24孔板的每一个孔中。在37℃,5％CO2和95％的湿度下培养细胞24小时。移去培养基并用含有0.5％的FCS的DMEM培养基更换。未激活的对照细胞用0.5％的FCS培养。细胞用0.01到10mg/ml浓度的Tumstatin处理。所有孔在开始处理12小时后都加入1毫居的3H-胸腺嘧啶。24小时后，移去培养基并用染色并再次照相(Grant,D.S.等，1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63)。观察十个视野，对管进行计数并取平均值。
结果显示如图14，该图显示了在分别用BSA(□)，Canstatin(■)和α5NC1(○)处理的内皮管组织形成数量与对照(PBS处理)形成的百分比(y轴)。纵轴表示平均值的均方差。结果显示相对于对照地Canstatin极大地减少了内皮管形成。
Canstatin剂量依赖型地选择性抑制内皮管地形成，在1mg的Canstatin蛋白质浓度下能够接近完全抑制管的形成(图14)。而对照蛋白质，牛血清白蛋白(BSA)，Ⅳ型胶原的α5链的NC1区都对于内皮管的形成没有影响，显示出在这个试验中，对于的抑制作用是专一性的，而不是加入蛋白质的缘故。这一结果显示出Canstatin是一种抗血管生成试剂。
实施例16Canstatin抑制肿瘤的体内生长。
从培养物中收集人前列腺癌细胞(PC-3细胞)并将在无菌PBS中的2百万个细胞皮下注射到7到9周大的SCID雄性鼠体内。肿瘤生长4周后，将这些鼠分成4鼠一组。对于试验组每天皮内注射总体积为0.1ml的10mg/kg剂量的Canstatin。对照组每天给予相同体积的PBS。在试验开始时(0天)，对照小鼠的肿瘤的体积为88-135mm3，而处理的小鼠为108-149mm3。每一组中包括5只小鼠。在给定日期计算的肿瘤体积除以处理的第一天的体积以此获得微分肿瘤体积(V/V)。结果显示在图15A,该图显示的是微分的肿瘤体积(v轴)±标准方差，对处理的天数(x轴)作图。相对于对照(□)来说，Canstatin(■)处理的肿瘤体积只有微小的增加。
在另外一个PC-3试验中，从培养物中收集PC-3细胞并将在3百万个细胞皮下注射到6到7周大的无胸腺裸鼠体内。肿瘤生长大PBS洗孔三次。用1N的NaOH抽提放细胞并加入到含有4mlScirtiVerse Ⅱ溶液(Fisher Scientific公司，Pittsburgh,Pennsylvania,USA)闪烁小瓶中。用闪烁计数器测量胸腺嘧啶的结合。
结果显示如图19A和19B。图19A是一个柱状图，显示了当用不同量的Tumstatin(x轴)处理时，3H-胸腺嘧啶(y轴)与C-PAE细胞(图19A)，786-0细胞(图19B)，和PC-3细胞(图19C)的结合。各组代表三次的样。Tumstatin对于20％FCS激活的内皮细胞明显具有剂量依赖型抑制，ED50值为大约0.01mg/ml(如图19A.)。甚至当剂量上升到20mg/ml时，没有观察到对于肾肿瘤细胞(786-0)，或者前列腺肿瘤细胞(PC-3)有明显的抗增殖作用(如图19B和19C)。这些内皮细胞特异性显示了Tumstatin可能是一种非常有效的抗血管生成试剂。在Tumstatin(0.1-1.0mg)处理的细胞中和对照细胞中，3H-胸腺嘧啶结合的平均值的差异时明显的(P＜0.5)。当用Tumstatin处理PC-3细胞或者786-0细胞时没有观察到抑制作用(如图19B.和19C)。带有星号标记的数据是显著的，用OneTailed Student’s检测确认其P＜0.05。
实施例21Tumstatin抑制内皮管的生成将基质胶(Collaborative Biomedical Products公司，Bedford,Massachusetts,USA)(320ml)加到24孔板的每个孔中并使之聚合(Grant,D.S.等，1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63)。将在不含抗生素的EGM-2(Clonetics公司，San Diego,California,USA)培养基中的25,000个鼠大动脉内皮细胞(MAE)悬浮物加到铺有基质胶的每个孔中。这些细胞用Tumstatin,BSA或者7S区以增加的浓度进行处理。对照细胞用无菌的PBS处理。所有的试验都做三次。细胞在37℃温育24-28小时并用CK2 Olympus显微镜观察(3.3×目镜，10×物镜)。使用400涂有DK的TMAX胶卷照相(Kodak公司)。然后细胞用diff-quik固定剂(Sigma化学试剂公司，St.Louis,Missouri,USA)染色并再次照相(Grant,D.S.等，1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63)。由两个对于该试验步骤不了解的观察者观察十个视野，对管进行计数并取平均值。
结果显示如图20。当鼠大动脉内皮细胞培养在基质胶，一种鼠基质膜的固体胶中时，它们很快排列并形成空的管状结构(Haralabopoulos,G.C等，1994,Lab.Invest.71:575-82)。由293细胞中产生的Tumstatin，与BSA对照相比，明显地剂量依赖型抑制MAE细胞中内皮管的形成(图20)。在用1mg/ml的蛋白质处理后，内皮管形成的百分率BSA为98.0±4.0,Tumstatin为14.0±4.0。使用大肠杆菌产生的Tumstatin也能获得相同的结果。Ⅳ型胶原的7S区(N-末端非胶原区)对于内皮管的形成没有作用。当浓度为800-1000ng/ml时，Tumstatin能够获得最大的抑制作用。用Tumstatin(●,0.1到10g/ml)处理的和对照[BSA(□)]，7S区(○)的平均百分值的差别是明显的(P＜0.5)。每一点代表平均值±三孔的SE。这个试验重复三次。带有星号标记的小柱是对P＜0.5的结果所做的后续试验。在7S区处理的试验中可以观察到良好形成的管。用0.8mg/ml Tumstatin处理MAE细胞显示出减少的管的形成。
为评价Tumstatin在体内对于新的毛细管形成的作用，进行了基质胶植入试验(Passaniti,A.等，1992，Lab Invest.67:519-29)。自Jackson实验室(Jackson实验室，Bar Harbor,Marine,USA)获得5到6周龄的C57/BL6鼠。将基质胶(Collaborative BiomedicalProducts公司，Bedford,Massachusetts,USA)在4℃浸泡过夜。在给C57/BL6鼠注射之前，与20U/ml肝素(Pierce化学公司，Rockdord,Illinois,USA),150ng/ml的bFGF(R&D System公司，Minneapolis,Minnesota,USA)，和1mg/ml的Tumstatin混合。对照组中没有血管生成抑制剂。用21号的针头皮下注射基质胶混合物。14天后，处死小鼠并取出基质胶植入物。用4％的甲醛(PBS中)室温固定基质胶植入物，然后转入中放置24小时。对植入物进行石蜡包埋，切片和H&E染色。在光学显微镜下检查切片并在10个高倍视野中对血管数进行计数。所有的切片都是由一个不知道该研究过程的病理学家编号和观察的。
当植入的基质胶含有和肝素时，无论使用的是否是大肠杆菌产生的Tumstatin，用1m/ml的Tumstatin处理都能够观察到血管形成的数目减少了70％。在每个高倍视野下的血管数目为，Tumstatin,2.25±1.32,和对照，7.50±2.17。每一个柱子代表了每组5-6个小鼠的平均值±SE。Tumstatin(1mg/ml)与用PBS处理的对照比较明显抑制体内的新血管的形成。Tumstatin处理的动物和对照动物的平均百分值的差别是明显的(P＜0.05)。Tumstatin的处理是明显的，其P＜0.05是由One Tailed Student’s检测所确定的。实施例22Tumstatin和Tumstatin突变体抑制体内的肿瘤生长收集5百万个PC-3细胞并皮下注射到7到9周龄的雄性无胸腺裸鼠的背部。使用Vernier卡尺测量肿瘤的长和宽，并用标准的公式长度×宽度2×0.52来计算肿瘤的体积。使肿瘤生长到100mm3，将这些鼠分成5或6鼠一组。给每一试验组分别用无菌PBS中的Tumstatin或者鼠endostatin每日腹腔注射(20mg/kg)，共注射10天。对照组给予载体注射(BSA或者PBS)。10天后每2或3天计算一次肿瘤的体积。结果显示如图21A，该图显示了肿瘤体积(mm3)(y轴)对于用PBS对照(□)，20mg/kg Tumstatin(●)，和20mg/kg endostatin(○)处理天数(x轴)所作的图。大肠杆菌中产生的Tumstatin能够明显抑制PC-3人前列腺肿瘤细胞的生长(如图21A)。20mg/kg的Tumstatin和20mg/kg的endostatin能够同样抑制肿瘤的生长。在第十天可以明显地观察到对于肿瘤生长的抑制作用(对照202.8±50.0mm3，Tumstatin82.9±25.2mm3,endostatin68.9±16.7mm3)。与对照比较，每日注射Tumstatin或者endostatin能够抑制人前列腺肿瘤细胞(PC-3)的生长。该试验是当肿瘤体积小于100mm3时开始的。
同时在小鼠中研究了Tumstatin对于另外一种原发肿瘤的作用。收集2百万个786-0细胞并皮下注射到7到9周龄的雄性无胸腺裸鼠的背部。使肿瘤生长到大约600mm3到大约700mm3，将这些鼠分成6鼠一组。用在无菌PBS中的Tumstatin每日腹腔注射(6mg/kg)，共注射10天。对照组给予PBS注射。结果显示如图21B，该图显示了肿瘤体积(mm3)(y轴)对于用PBS对照(□)，和6mg/kg Tumstatin(●)处理后的天数(x轴)所作的图。大肠杆菌中产生的Tumstatin在6mg/kg时能够明显抑制PC-3人肾脏肿瘤细胞的生长(如图21B)。在第十天可以明显地观察到对于肿瘤生长的抑制作用(对照1906±179.7mm3,Tumstatin 619±120.7mm3)。与对照比较，每日注射Tumstatin能够抑制人肾脏肿瘤细胞(786-O)的生长。该试验是当肿瘤体积为600-700mm3时开始的。每一点代表各组中5-6小鼠的平均值±SE。带有星号标记的小柱是对P＜0.5的结果所做的后续试验。
Ⅳ型胶原的α3链的NC1区[α3(Ⅳ)NC1]的一部分是Goodpasture综合症的病原的抗原决定簇(Butkowski,R.J.等，1987,J.Biol.Chem.262:7874-7；Saus,J.等1988,J.Biol.Chem.263:13374-80；Kalluri,R.等，1991,J.Biol.Chem.266:2401 8-24)。Goodpasture综合症是一种自身免疫疾病，表现为肺部出和/或血管球性肾炎(Wilson,C.&F.Dixon,1986,The Kidney,W.B.Sanders公司，Philadelphia,Pennsylvania,USA,pps.880-89；Hudson,B.G.等，1993,J.Biol.Chem.268:16033-6)。这些症状是由于抗α3(Ⅳ)NC1的自身抗原的结合致使肾小球和肺泡的基底膜受到干扰(Wilson,1996,supra；Histon 1993,supra)。有几个研究小组试图预测Goodpasture综合症自身抗原在α3(Ⅳ)上的位置[Kalluri.R.等，1995,J.Am.Soc.Nephrol.6:1178-85；Kalluri.R.等，1996,J.Biol.Chem.271:9062-8；Lery,J.B.等，1997,J.Am.Soc.Nephrol.8:1698-1705；Kefalides,N.A.等，1993,Kidney Int.43:94-100；Quingones,S.等，1992,J.Biol.Chem.267:19780-4(勘误在269:17358)；Netzer，K.O等，1999,J.Biol.Chem.274:11267-74]，在N端，C端和中间位置的残基都被报道过是抗原决定簇底位置。最近，更可能的疾病相关的在N端的病原决定簇被鉴定出来(Hellmark,T.等，1999,Kidney Int.55:936-44)，进一步确定是N端的40个氨基酸。设计了一种截短了的缺少N端的53个氨基酸的tumstatin(Tumstatin-N53)，与Goodpasture的自身抗原决定簇的病原发生有关。该突变蛋白用于如下试验。
将2百万个786-0细胞皮下注射到7到9周龄的雄性无胸腺裸鼠的背部。使肿瘤生长到大约大小为100-150mm3，将这些鼠分成5鼠一组。用大肠杆菌中表达的缺少53个N端氨基酸残基的Tumstatin每日腹腔注射(20mg/kg)，共注射10天。对照小鼠给予PBS注射。结果显示如图22，该图显示了肿瘤体积(mm3)的增加(y轴)对于用对照鼠(□)，20mg/kg Tumstatin突变体(●)处理后的天数(x轴)所作的图。大肠杆菌中产生的Tumstatin-53在20mg/kg时能够明显抑制786-0人肾脏肿瘤细胞的生长(如图22)。与对照比较，每日注射Tumstatin能够明显抑制人肾脏肿瘤细胞(786-O)的生长(第十天对照110.0±29.0mm3,Tumstatin345.0±24.0mm3)。该试验是当肿瘤体积为600-700mm3时开始的。每一点代表各组中5-6小鼠的平均值±SE。带有星号标记的数据是显著的，用One Tailed Student’s检测确定其P＜0.05。
实施例23α3(Ⅳ)NC1和CD31的免疫组化染色分析取7-9周龄的雄性C57/BL6小鼠肾脏与皮肤组织，经过处理用于免疫荧光显微镜分析。组织样品用液氮冷冻处理，切成4mm厚的切片备用。组织用如前人所述的间接免疫荧光技术处理(Kalluri,R.等，1996,J.Biol.Chem.271:9062-8)。冷冻的切片用一抗体，即多克隆抗CD31抗体(1∶100稀释)或多克隆抗α3(Ⅳ)NC1抗体(1∶50稀释)染色。然后加二抗，FITC连接的抗大鼠IgG抗体或FITC连接的抗人IgG抗体。用奥林巴斯荧光显微镜(Tokyo，日本)检查免疫荧光。在阴性对照中，用一不相关的前免疫血清代替一抗。
小鼠肾脏中，在GBM和血管基底膜中观察到α3(Ⅳ)NC1的表达。在肾小球内皮细胞和血管内皮细胞中可观察到CD31,PECAM-1的表达。在小鼠皮肤中，在上皮基底膜和血管基底膜中没有α3(Ⅳ)NC1。在皮肤内皮细胞中观察到CD331的表达。在小鼠肾脏肾小球内皮细胞和小血管中观察到CD31的表达。在肾小球基底膜和肾小球外血管基底膜中观察到α3(Ⅳ)NC1的表达。在小鼠皮肤中，内皮小血管中观察到CD31的表达。在上皮基底膜中没有α3(Ⅳ)NC1的表达，上皮小血管基底膜中几乎没有观察到α3(Ⅳ)NC1的表达。这些结果表明canstatin限制分布的实施例。
实施例24抗血管生成蛋白的突变体及片断Arresten和canstatin蛋白的突变体和片断用假单胞菌弹性蛋白酶消化(Mariyama等，1992,J.Biol.Chem.267:1253-8)得到。消化产物用凝胶过滤HPLC处理，所得到的片断用SDS-PAGE电泳分析，用上面描述的内皮血管分析法分析评估。这些片断包括Arresten的12 kDa片断，Arresten的8 kDa的片断，canstatin的一个10 kDa的片断。另外，通过PCR克隆得到两个canstatin的片断(“333”和“334”)。
如图23所示的，如前所述的内皮血管分析，两个Arresten片断[12 kDa(□)和8 kDa(■)]和canstatin的片断[19 kDa(▲)]抑制内皮血管形成，其效果甚至比Arresten(●)或canstatin(○)还强。图24表示canstastin片断333(●)和334(○)的效果一样比作为对照的canstatin(▲)强，以BSA(■)和α6链(□)作为对照。
所有引述的文献，专利，及专利申请都通过在此引述而全部合并于本文。虽然本发明在此用实施方案做了特别的说明和描述，但对本领域的技术人员而言，在没有离开权利要求中的本发明的实质与范围的条件下，还可以有常规技术的各种形式上的及细节的改变。
权利要求
1．一种分离的蛋白质，选自如下之一Ⅳ型胶原的α1链的NC1区，Ⅳ型胶原的α2链的NC1区，或者Ⅳ型胶原的α3链的NC1区，或者它们的片段、类似物、衍生物、或者它们的突变体，其中，蛋白质、片段、类似物、衍生物、或者它们的突变体都具有抗血管生成特性。
2．权利要求1的分离的蛋白质，其中的蛋白质是一种单体。
3．权利要求2的分离的蛋白质，其中的蛋白质是捕获肽(Arresten)。
4．权利要求2的分离的蛋白质，其中的蛋白质是Canstain。
5．权利要求2的分离的蛋白质，其中的蛋白质是Tumstatin。
6．一种权利要求1的蛋白质的多聚体，或者它们的片段、类似物、衍生物、或者它们的突变体，其中的多聚体具有抗血管生成的特性。
7．一种嵌合蛋白质，其包括一种或者多种权利要求1的蛋白质，或者它们的片段、类似物、衍生物、或者它们的突变体，其中的嵌合蛋白质具有抗血管生成的特性。
8．权利要求7的嵌合蛋白质，进一步含有选自至少下列之一的一种蛋白分子endostatin或其片段，angiostatin或其片段，restin或其片段，apomigren或其片段，或者其它的抗血管生成蛋白质或其片段。
9． 一种组合物，作为一种生物活性成分，含有一种或者多种权利要求1的蛋白质。
10．权利要求9的组合物，以及药理学上相容的填料。
11．一种组合物，作为一种生物活性成分，含有一种或者多种权利要求1的蛋白质，还含有选自下列的至少一种蛋白质分子endostatin或其片段，angiostatin或其片段，restin或其片段，apomigren或其片段，或者其它的抗血管生成蛋白质或其片段。
12．一种组合物，作为一种生物活性成分，含有权利要求6的多聚体。
13．一种组合物，作为一种生物活性成分，含有权利要求7的嵌合蛋白质。
14．一种分离的多聚核苷酸，编码权利要求1的蛋白质，或者它们的片段、类似物、衍生物、或者它们的突变体，其中的嵌合蛋白质具有抗血管生成的特性。
15．权利要求14的一种分离的的多聚核苷酸，其中的多聚核苷酸可操作连接到表达控制序列上。
16．用权利要求15的多聚核苷酸转化的宿主细胞。
17．权利要求16的宿主细胞，其中的宿主细胞选自细菌，酵母，哺乳类，昆虫或者植物细胞。
18．一种分离的多聚核苷酸，编码权利要求3的蛋白质。
19．一种分离的多聚核苷酸，编码权利要求4的蛋白质。
20．一种分离的多聚核苷酸，编码权利要求5的蛋白质。
21．一种生产权利要求14的多聚核苷酸编码的蛋白质的方法，该方法包括(a)培养权利要求14的多聚核苷酸转化的宿主细胞，核甘酸的宿主细胞选自细菌，酵母，哺乳类，昆虫或者植物细胞；(b)从培养物中纯化蛋白质；由此生产出权利要求14的多聚核苷酸编码的蛋白质。
22．一种分离的多聚核苷酸，根据如下工艺获得(a)制备一种或者更多的多聚核苷酸探针，该探针在一定条件和适宜的严谨度下可与权利要求14的多聚核苷酸杂交；(b)用该探针与哺乳动物DNA杂交；(c)分离用探针检测到的DNA多聚核苷酸；核甘酸分离的多聚核苷酸的核苷酸序列与权利要求14的多聚核苷酸的核苷酸序列一致。
23．给予哺乳动物抗血管生成蛋白质的方法，该方法包括将哺乳动物细胞导入哺乳动物体内，所述的哺乳动物细胞已在体外处理以插入权利要求14的多聚核苷酸，并在该哺乳动物的体内表达出有效治疗剂量的抗血管生成蛋白质，该剂量足以抑制哺乳动物中的血管生成活性。
24．权利要求23的方法，对抗血管生成蛋白质的表达是瞬时表达。
25．权利要求23的方法，核甘酸的细胞选自血液细胞，TIL细胞，骨髓细胞，血管细胞，肿瘤细胞，肝细胞，肌肉细胞，纤维原细胞。
26．权利要求25的方法，核甘酸的多聚核苷酸通过病毒载体插入细胞中。
27．特异性结合权利要求1的分离的蛋白质、类似物、衍生的同源物、或者它们的突变体的抗体。
28．一种在哺乳动物组织中抑制血管生成活性的方法，该方法包括用一种组合物来处理组织，该组合物含有下列的一种或者几种权利要求1的分离的蛋白质、或者它们的片段、类似物、衍生物、或者它们的突变体，权利要求1的蛋白质的多聚体，权利要求1的片段的多聚体，一种包括一种或者几种权利要求1的蛋白质的嵌合蛋白质，或者一种含有权利要求1的蛋白质片段的嵌合蛋白质。
29．权利要求28的方法，核甘酸的疾病包括血管生成依赖性肿瘤，良性瘤，风湿性关节炎，糖尿病视网膜病，银屑癣，视觉血管生成疾病，Osler-Webber综合症，心肌性血管生成，片状血管生成，毛细血管扩张，血友病生节，血管纤维瘤，伤口肉芽，肠粘连，动脉硬化症，硬皮病，高尿酸血，猫抓热病，幽门螺旋菌溃疡，透析移植所致血管狭窄，避孕和肥胖症。
30．权利要求29的方法，核甘酸的疾病是肿瘤。
31．使用权利要求28的组合物抑制有血管增生活性症状的疾病，该方法包括对于该疾病的病人给药，该组合物结合放射治疗、化学治疗、和免疫治疗。
32．一种多肽，其包含SEQ ID NO:10的第2位到第125位氨基酸，该多肽具有抗血管生成活性。
33．一种编码权利要求32的多肽的多聚核苷酸。
34．一种多肽，其包含SEQ ID NO:10的笫125位到第245位氨基酸，该多肽具有抗血管生成活性。
35．一种编码权利要求34的多肽的多聚核苷酸。
36．一种具有抗血管生成活性的Ⅳ型胶原的α1链的NC1区片段，该片段通过PCR克隆方法而获得。
37．一种具有抗血管生成活性的Ⅳ型胶原的α2链的NC1区片段，该片段通过PCR克隆方法而获得。
38．一种具有抗血管生成活性的Ⅳ型胶原的α3链的NC1区片段，该片段通过PCR克隆方法而获得。
39．一种具有抗血管生成活性的Ⅳ型胶原的α1链的NC1区片段，该片段通过假单胞菌(Pseudomonas)弹性蛋白酶消化方法而获得。
40．权利要求39的抗血管生成片段，该片段的大小为12 KDa。
41．权利要求39的抗血管生成片段，该片段的大小为8 KDa。
42．一种具有抗血管生成活性的Ⅳ型胶原的α2链的NC1区片段，该片段通过假单胞菌(Pseudomonas)弹性蛋白酶消化方法而获得。
43．权利要求42的抗血管生成片段，该片段的大小为10 KDa。
44．一种具有抗血管生成活性的Ⅳ型胶原的α3链的NC1区片段，该片段通过假单胞菌(Pseudomonas)弹性蛋白酶消化方法而获得。
全文摘要
本发明涉及具有抗血管生成特性的蛋白,以及使用这些蛋白来抑制血管生成作用。
文档编号A61K38/00GK1309663SQ99808686
公开日2001年8月22日 申请日期1999年6月17日 优先权日1998年6月17日
发明者拉格赫阿姆·凯卢里 申请人:贝斯以色列护理医疗中心