专利名称：包括一种阿片样物质镇痛剂和一种nmda拮抗剂的局部给药组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及由单纯一种N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂或与经阿片受体发挥外周镇痛作用的镇痛药组合的局部给药组合物，以及所述局部给药组合物用于治疗疼痛且对镇痛药不产生/或产生最低程度耐受的用途。
背景技术：
吗啡是μ阿片样受体的强激动剂，有重要的中枢作用位点(Reisine和Pasternak,1996)。外周机制也已见报道，其重要性也逐渐被人们所理解(Stein等，1995；Barber和Gottschlich,1992；Joris等，1987；Junien和Wettstein,1992)。在临床治疗疼痛中，外周镇痛药有很多潜在的优点，尤其是控制如便秘和镇静等全身用药时出现的典型的副作用。在尾巴局部给药时，吗啡和其它的阿片样物质是有效的镇痛药，既有单独的外周作用又有中枢部位的协同作用(Kolesnikov等，1996)。在许多方面，这些研究与临床观察相似(Stein,1993；Dahl等，1990；Dalsgaard等，1994；Heard等，1992；Joris等，1987；Khoury等，1992；Mays等，1987；Raja等，1992)。系统性吗啡耐受也涉及外周机制(Kolesnikov等，1996)。早期的研究报道系统性吗啡耐受不改变对吗啡脊柱或棘上给药的敏感性(Roerig等，1984)。虽然我们也发现，在吗啡长期给药后，脊柱或棘上给药其效力仍未改变，但是可见到外周效力显著降低(Kolesnikov等，1996)。
发明概述本发明涉及用于提供局部给药的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂来获得比利用一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药更有效的外周镇痛效果以及用于抑制对镇痛药耐受和/或逆转耐受的方法和组合物。
本发明提供了一种局部给药组合物，其包括单独或与至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药联合应用的N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂以及可药用的局部赋形剂。
本发明还涉及向一种哺乳动物提供镇痛作用的方法，其包括全身或局部施与通过阿片受体发挥作用的镇痛药，而且其中在局部向哺乳动物应用减少耐受或抑制耐受的剂量的至少一种N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂之前、同时或之后施与镇痛药。
本发明还涉及在用通过阿片受体发挥作用的镇痛药治疗的哺乳动物中逆转耐受的方法，其包括局部应用可有效逆转耐受之剂量的至少一种NMDA受体拮抗剂。
本发明还提供了一种减少耐受或抑制耐受的药用镇痛药药剂盒，其包括(A)一种局部或全身给药的药物组合物，其包括至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药；(B)一种局部给药的药物组合物，其包括至少一种减少耐受或抑制耐受的N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂。
附图简述
图1a和1b小鼠局部应用阿片样物质痛觉缺失1a)各组小鼠分别用吗啡(15mM；n=20)、DAMGO(2mM；n=10)或M6G(20mM；n=10)局部暴露2分钟后，用甩尾法检测痛觉。
1b)如在方法部分所述，对局部用药1分钟的各种指定化合物绘制剂量效应曲线。药物的每个剂量组至少有10只小鼠。
图2a和2b阿片样物质拮抗剂对局部μ痛觉缺失的作用2a)各组小鼠(n≥10)接受吗啡(15mM)、DAMGO(2mM)或M6G(20mM)单纯局部给药1分钟，或在镇痛激动剂应用前20分钟，在小鼠背部皮下注射纳洛酮(1mg/kg，皮下注射)。纳洛酮，一种μ受体拮抗剂，可以显著降低小鼠对所有激动剂的反应。
2b)各组小鼠(n≥10)只接受吗啡(15mM)或DAMGO(2mM)或M6G(20mM)局部给药1分钟，或在镇痛激动剂应用前20分钟，在小鼠背部皮下注射3-甲氧纳曲酮(3-MeONtx；0.25mg/kg，皮下注射)。3-MeONtx仅显著降低小鼠对M6G的反应。
图3a和3b吗啡的局部用药与全身或脊柱用药的相互作用3a)各组小鼠(n≥10)只接受吗啡局部给药(15mM；2分钟)，或者联合脊柱(100ng，鞘内注射)或全身给药(1mg/kg，皮下注射)。单纯吗啡脊柱用药未产生可观察到的效果，全身用药只有10％产生反应。在30分钟时，吗啡单纯局部用药的效应消失，而联合用药的效应则显著增加。
3b)左图各组小鼠(n≥10)分别用吗啡单纯局部给药(15mM；2分钟)、单纯脊柱给药(100ng，鞘内注射)或两种途径联合给药。在给药l0分钟后进行检测。在该时间点，单纯局部给药有30％产生效应。联合给药组的效应显著高于两个途径单独给药产生的效应的总和。右图各组小鼠(n≥10)分别用吗啡单纯局部给药(15mM)、单纯全身给药(1mg/kg，皮下注射)或两种途径联合给药。在给药30分钟后进行检测。在该时间点，单纯局部给药无可观察的效应。联合给药组的效应显著高于两个途径单独给药产生的效应的总和。
图4吗啡全身和局部用药的耐受性各组小鼠(n≥10)分别接受吗啡全身给药(5mg/kg，皮下注射)或局部给药(15mM；1分钟)。在第1、2及3天，单纯DMSO给药没有可观察到的反应。在第3夭，全身用药组的反应显著高于局部用药组。
图5吗啡与DAMGO和M6G间的交叉耐受各组小鼠(n≥10)每天接受吗啡(5mg/kg，皮下注射)或生理盐水，共5天。在第6天，对小鼠在局部暴露于吗啡(15mM)、M6G(20mM)或DAMGO(2mM)1分钟后进行测试。在长期吗啡治疗后，对吗啡和DAMGO的反应显著下降(p＜0.01)。对M6G的反应没有变化。
图6a,6b和6cMK801对吗啡局部给药耐受性的影响6a)各组小鼠(n≥10)接受吗啡单纯局部给药(15mM；1分钟)或联合MK801的局部给药(3mM)、全身给药(0.1mg/kg，皮下注射)或鞘内给药(1μg，鞘内注射)。在三天后，对单纯吗啡的反应消失(p＜0.01)。对联合MK801鞘内给药的吗啡的反应也消失(p＜0.01)。吗啡联合MK801全身或局部给药在5天内基本没有变化。
6b)各组小鼠(n≥10)接受吗啡单纯局部给药(15mM；1分钟)、单纯MK801(3mM)局部给药，或吗啡(15mM)局部给药与指定浓度(0.15,0.3或3mM)的MK801局部给药联合应用。三天后，对单纯吗啡的反应消失(p＜0.01)。两个较高的MK801剂量阻止反应性的消失(p＜0.01)，而最低剂量的MK801产生中等程度的反应。
6c)各组小鼠(n≥10)接受单纯吗啡局部给药(15mM；1分钟)3天。第4天起，它们接受吗啡和0.3或3.0mM浓度的MK801联合局部给药。吗啡和MK801联合局部给药逆转已产生的耐受(p＜0.01)。
图7a和b氯胺酮对吗啡局部耐受性的效应7a各组小鼠(n=20)每天用单纯吗啡(实心圆)局部给药或与3.6mM(三角形)及36mM(空心圆)氯胺酮联合给药治疗1次，连续3天。在这个模型中单纯氯胺酮(36mM)给药不产生明显的镇痛作用。三天后，对单纯吗啡的反应消失(p＜0.001)。低剂量氯胺酮(3.6mM)显著减缓3天后吗啡镇痛效应的消失(p＜0.05)。高剂量氯胺酮(36mM)阻止耐受的产生高达6天(p＜0.0001)。
7b．各组小鼠(n=20)接受单纯吗啡(15mM)(实心圆)局部给药2天。第3天起，两组小鼠每天接受联合3.6mM(三角形)或36mM(正方形)浓度的氧胺酮的吗啡给药，直至第6天。高浓度的氯胺酮(36mM)可以完全恢复吗啡的镇痛作用(p＜0.0001)。
发明详述本发明提供了一种局部应用的药物组合物，其仅包括至少一种N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂或还联合了至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药，以及可药用的局部赋形剂。
在本发明中应用的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂包括，但不限于，吗啡喃，例如右美沙酚((+)-3-羟基-N-甲基吗啡喃)和右啡烷(+)-3-羟基-N-甲基吗啡喃)、MK801((5R,10S)-(+)-5-甲基-10,11-二氢-5H-二苯并[a,d]环庚烯-5,10-亚胺氢化马来酸)、氯胺酮(2-(2-氯苯基)-2-(甲氨基)-环己酮)，吡咯并喹啉醌和顺-4-(膦酰甲基)-2-哌啶-羧酸、美金刚(3,5-二甲基-9-盐酸金刚烷胺)，它们的混合物及其可药用的盐类等。除了右啡烷，许多现有NMDA受体拮抗剂由于极强的致神经错乱副作用，在临床上不适合于全身用药。然而，在本发明中这些NMDA受体拮抗剂可以用于局部制剂。局部应用这些NMDA受体拮抗剂可以干扰并减轻对镇痛药产生耐受性，而不产生副作用。可用于局部制剂的NMDA受体拮抗剂包括，但不限于，MK801、吗啡喃、氯胺酮、美金刚、右啡烷、它们的混合物及其可药用的盐类、吡咯并喹啉醌、顺-4-(膦酰甲基)-2-哌啶-羧酸、其混合物及其可药用的盐类等。
在本发明中可以应用的镇痛药是那些通过至少一种阿片受体的激活而提供镇痛作用的镇痛药。可以被本发明的镇痛组分激活的阿片受体包括，但不限于，δ阿片受体、χ阿片受体和μ阿片受体之任一或组合。镇痛药包括，但不限于，阿片、阿片衍生物及合成的阿片类物质、内源性或合成的阿片肽，如脑啡肽、内啡肽及其可药用的盐类。具体的实例包括乙基吗啡、氢吗啡酮、吗啡、可待因、二氢羟吗啡酮、[D-Ala2,MePhe4,Glycol)5]内啡肽(DAMGO)、丙氧酚、叔丁啡、羟考酮、氢吗啡酮、氢吗啡、芬太尼、舒芬太尼、戊唑辛、纳布啡、纳洛酚、海洛因、左啡诺、左洛啡烷、美沙酮、哌替啶、可卡因、二氢可待因、氢可酮、纳美酚、纳洛酮、纳曲酮、布托啡诺及可药用的盐等。
本发明的局部药物组合物进一步还可选择包括一种局部麻醉药，其包括，但不限于，利多卡因、丁哌卡因、甲哌卡因、罗哌卡因、丁卡因、苯唑卡因等。
如本文中所用的，可以从本发明的治疗方法获益的哺乳动物是任何需要治疗疼痛的温血动物。哺乳动物包括，但不限于，人、灵长类动物、狗、猫、啮齿类动物、马、牛、羊等。将镇痛药提供给需要缓解疼痛的哺乳动物。疼痛可以是急性疼痛也可以是慢性疼痛。需要止痛治疗的疾病和状况包括，但不限于，创伤、截肢、神经病、纤维肌瘤、烧伤、擦伤、感染、划伤、割裂伤等。
本发明提供用于减轻或预防与施与麻醉镇痛药相关的耐受性产生的方法。相应地，可以以有效减轻或预防耐受性产生的剂量施与NMDA受体拮抗剂。如本文中所用的，术语预防耐受、抑制耐受或逆转耐受的剂量是有效维持和/或恢复，或至少部分恢复麻醉镇痛药镇痛效果的NMDA受体拮抗剂的量。
在对哺乳动物提供外周镇痛作用的方法中，在局部施与至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药之前、同时或之后，局部施与减轻或预防耐受剂量的至少一种NMDA受体拮抗剂。
在为哺乳动物提供镇痛作用的方法的一个实施方案中，在阿片镇痛药吗啡局部用药之前、同时或之后，局部应用减轻或抑制耐受的剂量的NMDA受体拮抗剂氯胺酮。
在另一个为哺乳动物提供镇痛作用的方法的实施方案中，在阿片镇痛药吗啡局部用药之前、同时或之后，局部应用抑制或逆转耐受的剂量的NMDA受体拮抗剂右美沙芬。
本发明的局部药物组合物是以单个剂量单位的方式应用的，其包括NMDA受体拮抗剂的单独使用，或与有效剂量的镇痛药的局部制剂联合使用。
在药物组合物中局部NMDA受体拮抗剂的含量在混合物中占重量的大约0.1％至大约5％，但根据所用的特殊拮抗剂和待施与哺乳动物的特殊镇痛药不同，其数量可以变化。局部NMDA受体拮抗剂的含量使提供有效的镇痛作用所需的镇痛药的浓度降低。例如，当与局部NMDA受体拮抗剂联合应用时，对于镇痛药的局部施药，镇痛药的含量可以占重量的大约1％到大约10％；对于镇痛药的全身用药，其量可以在大约0.1到大约0.2mg/kg体重的范围内；对于镇痛药的鞘内给药，其量可以在大约1-5mg的范围内。
局部组合物的具体剂量可以为，例如每天2-3次，或者任何时间段，只要在接受通过一种阿片受体发挥作用的镇痛药的哺乳动物中足以预防、抑制或逆转耐受性。
局部药物组合物可以与可药用的赋形剂，如芦荟油、丙二醇、DMSO、卵磷脂碱等配制成水溶液、洗剂、凝胶、乳膏、粘性膜等。如在本发明中所用的DMSO不会引起治疗剂的全身吸收。凝胶赋形剂可以包括一种或多种如下的物质凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释液如水和乙醇、乳化剂和稳定剂。
悬液可含有与如悬浮剂，分散剂或润湿剂等可药用赋形剂相混合的组合物，其中悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂例如卵磷脂、或者烯化氧与脂肪酸的缩合产物例如聚氧化乙烯硬脂酸酯，或者氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物例如十七乙烯氧基鲸蜡醇，或者氧化乙烯与由脂肪酸和己糖醇衍生的偏脂的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或者氧化乙烯与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏脂的缩合物例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。此类悬液还可以含有一种或多种防腐剂，如乙基或n-丙基-p-羟基安息香酸。
加水后适合于配制成悬液的可分散粉末和颗粒与分散剂或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合制成组合物。适宜的分散剂或润湿剂、悬浮剂已经由上述的那些举例说明。
本发明中的组合物或其主要活性成分可以被制成本领域熟知的控释剂型。
本发明的局部制剂可作用于外周的阿片受体而起到治疗作用，并且不需要将局部制剂中的活性成分传递至中枢(脑和脊髓)的阿片受体。在治疗的哺乳动物中，本发明的局部制剂只在局部释放活性成分，并不需要制剂中的活性成分进入全身。
药物组合物的局部用药可以通过利用溶液、凝胶、洗剂、油膏、乳液或其他用来在局部位点传递治疗剂的载体来完成。一种应用方式是将组合物喷洒在需要治疗的区域。在另一个实施方案中，持续释放局部制剂的贴剂也可以用来施与局部治疗剂。贴剂可以是在本领域中熟知的贮器及有孔膜或固体基质。活性因子可以在分布于整个可渗透的粘附层的大量微囊中。
在另一个对已存在镇痛药耐受性的哺乳动物提供镇痛作用的方法的实施方案中，在局部或全身应用了至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药的同时或之后，局部施与逆转耐受的剂量的至少一种NMDA受体拮抗剂。
用于局部施药的NMDA受体拮抗剂的药物组合物还可以与至少一种局部或全身应用的包括通过阿片受体发挥作用的镇痛药的药物组合物一起以药剂盒的形式提供。
本发明还包括一种给哺乳动物止痛的方法，其包括在全身或鞘内给药至少一种镇痛药之前、同时或之后局部施与至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药。局部用药与全身或鞘内用药的组合，在局部给予低剂量镇痛药和全身或鞘内给予低剂量的镇痛药时就可以起到有效的治疗性镇痛作用，同时降低镇痛药的有害副作用。在联合治疗中所用剂量低于单独使用其中任何一种镇痛药达到治疗水平的镇痛作用所需的剂量。用于联合止痛治疗的药物组合物中，局部镇痛药的含量占重量的大约1％至大约10％。用于联合止痛治疗的药物组合物中，全身镇痛药的给药量在大约0.1至大约0.2mg/kg体重的范围内。局部镇痛药与鞘内给药联合应用时，鞘内镇痛药的药量是大约1到大约5毫克。该疗法可通过施与减轻耐受或预防耐受的剂量的至少一种局部NMDA受体拮抗剂进行补充。局部NMDA受体拮抗剂的含量可以占制剂重量的大约0.1％至大约5％。
在一个对哺乳动物进行镇痛的方法的实施方案中，在全身或鞘内施与吗啡之前、同时或之后局部施与吗啡。
前面对具体实施方案的描述，充分揭示了本发明的一般本质，以至于通过应用现有知识，其他人为了各种应用可以很容易地调整和/或修改这些具体的实施方案而不违背一般概念，因此这样的修改和调整也应包括在所公开实施方案的等价含义和范围内。
所有在此提及的参考文献和专利都合并在参考文献中。
实施例1材料和方法将雄性Crl:CD-l(ICR)BR小鼠(25-30g；Charles River BreedingLaboratories,Bloomington,MA)饲养于12小时明/暗交替及自由摄食和饮水的环境中。将小鼠分成每组5只分别饲养直至测试。[125I]NaI(1680Ci/mmol)购自New England Nuclear(Boston,MA)。吗啡、吗啡-6β-葡糖苷酸(M6G)和[D-Ala2,MePhe4,Gly(ol)5]内啡肽(DAMGO)由国家药物滥用研究所研究技术部(Research Technologies Branch of National Institute on DrugAbuse)(Rockville,MD)惠赠。MK801购自Research Biochemicals,Inc.(Natick,MA)。
全身用药在背部肩胛中部皮下(s.c.)注射给药。如先前所报道的(Kolesnikov等，1996)，脑室内给药(i.c.v.)和鞘内给药分别于检测前30和15分钟在轻度氟烷麻醉下进行。在前囱点尾部2毫米和侧部2毫米处i.c.v.注射，注射深度为3毫米，而鞘内注射通过腰椎穿刺进行。将小鼠尾浸润在含有指定药物的二甲基亚砜(DMSO)溶液中对尾巴局部给药。将尾的远端部分(3cm)浸没在DMSO溶液中1分钟。然后除非有其他说明，在药物浸没的尾巴区域确定甩尾的反应时间。为了确保局部效应，在未暴露于药物溶液的尾巴近侧区域也进行测试。
用先前报道的方法通过甩尾实验评估止痛效应(Kolesnikov等，1996)。将小鼠尾暴露于聚焦的光束，并确定暴露的反应时间。基线反应时间的范围是2.5至3.5秒。采用10秒为最长的截止反应时间以便将止痛小鼠的组织损伤降到最低。在全身用药后30分钟、i.c.v.或i.t.注射后15分钟或尾局部用药停止后立即进行检测。对每个小鼠将镇痛或止痛作用的全或无地定义为甩尾反应时间，其至少是基线反应时间的2倍。用Fisher精确检验进行组间比较。ED50值用先前报道的Bliss程序确定(Pick等，1993)。为了确证局部作用，在所有的研究中，我们均检测了小鼠尾浸没于DMSO的区域以及未暴露于药物溶液的更近侧节段。来自尾巴未暴露部分的甩尾反应时间与基线反应时间相似。在该模型中，DMSO本身没有活性。检测暴露或未暴露于DMSO的尾部区域显示在两个区域中镇痛效应没有显著差异。
利用氯胺T法以克分子数相等的[125I]NaI与吗啡或与DAMGO在室温下合成[125I]吗啡和[125I]DAMGO。1分钟后，用焦亚硫酸钠终止反应，用C18-反相SepPak将放射标记的阿片样物质与未反应的Na125I分离(Chien等，1997)。未从非碘化的前体中将放射性标记的化合物进一步分离。
实施例2局部吗啡和DAMGO止痛作用我们的早期研究证实，在尾部皮下给药时，吗啡有强的局部镇痛活性(Kolesnikov等，1996)。当局部给药时，吗啡也是一种强的镇痛药。对吗啡溶液(7.5mM)的镇痛反应随时间而逐渐增加，从30秒后的仅为25％至1分钟后的50％，以及2分钟后的80％(资料未示)。起效非常迅速。小鼠尾离开阿片样物质溶液后1分钟内即可检测到止痛效应，1分钟为所检测的最短时间(图1a)。然而，吗啡反应的持续时间相对较短，通常持续不到30分钟。固定暴露时间，吗啡有剂量依赖效应(图1b；表1)。在μ阿片肽DAMGO的DMSO溶液中，也可观察到相似的结果，其镇痛效应是吗啡的5倍多(图1b；表1)。
表1局部阿片样物质在CD-1小鼠中的镇痛活性
在甩尾实验中用药物的至少3个剂量组小鼠(n=10-20/剂)确定具有95％可信区间的镇痛药的ED50值。如在“方法”中所述，对所有的药物局部给药1分钟。M6G和DAMGO的比率是以吗啡为对照确定的。
除了较强的效应，DAMGO还有较长的作用时间，几乎持续1小时(图1a)。与吗啡相似，在离开DMSO溶液后可立即观察到DAMGO的峰作用。这些止痛效应容易被全身给药的纳洛酮(1mg/kg s.c.)逆转，证实了阿片样物质的选择性作用(图2a)。此外，在未暴露于阿片样物质溶液的尾巴的近侧部分未观察到这些药物的镇痛效应。
为了进一步证实该方法的选择性，在浸泡于含有[I125]吗啡或[I125]DAMGO的溶液后，我们观察了放射活性的分布(表2)。尾巴暴露于所述溶液的区域有高水平的放射活性。未直接暴露于所述溶液的近侧部分的放射活性水平为直接浸没于所述溶液中的远侧尾端放射活性的不到1％。此外，在血液、脑和脊髓中无可检测到的放射活性。
表2局部给药后[I125]DAMGO的分布
将远侧尾端(4-4.5cm)浸没于[I125]标记的吗啡或DAMGO(100μCi/ml)的DMSO溶液中，并暴露3分钟。对脑、脊髓、血液标本以及来自小鼠尾巴暴露和未暴露部分的片段在暴露后5分钟内取材、称重并直接在Packard5500γ分光计上计数。未暴露区域距暴露区域不到1厘米。放射活性用每克组织的cpm(cpm/g)表示。结果以检测每个放射标记药物的三个动物的均值±s.e.m.表示。
实施例3局部吗啡-6β-葡糖苷酸的镇痛作用通过尾部皮下注射局部施与的吗啡-6β-葡糖苷酸(M6G)是镇痛药，但是在10或30μg的剂量有30％的上限效应(资料未示)。在局部示例中，M6G产生完全的镇痛效应，且在离开药物溶液后立即产生峰效应(图1a)，其效力同吗啡相似(图1b；表1)。与吗啡相似，近侧尾段没有产生镇痛效应，而且M6G的效应容易被全身给药的纳洛酮逆转(图2a)。局部给药后，M6G作用的持续时间与DAMGO相似，长于吗啡(图1a)。选择性M6G拮抗剂3-甲氧纳曲酮(3MeONtx)(Brown等，1997)也显著降低M6G的反应(图2b)。相反，同样的3MeONtx剂量没有抗吗啡或DAMGO的止痛作用的活性(图2b)。除了支持3MeONtx对M6G受体的选择性外，这些观察结果强烈支持存在功能性外周M6G受体。
实施例4外周/中枢协同作用我们实验室的前期工作表明在外周和中枢吗啡系统存在有效的协同作用。在局部给药后，我们也检测了这些相互作用。在局部，吗啡的作用迅速散失，从1分钟时的80％下降到10分钟时的30％，在30分钟时，未见到止痛效应。鞘内或皮下给与吗啡的最小活性剂量可以显著提高局部吗啡的反应(图3)。在超过30分钟的时间点，这一作用非常明显，在这一时间点单纯的局部吗啡作用完全丧失。在这些长时间点，联合给药的止痛效应明显大于它们的累加作用(图3b)。
我们随后观察了固定剂量的局部吗啡对脊柱或全身给药的吗啡的ED50值的影响(表3)。
表3吗啡局部给药对吗啡全身或脊柱给药的止痛效应的影响
对吗啡单纯全身给药或联合一定剂量吗啡(15mM)的局部给药确定了ED50值及其95％可信区间。检测是在治疗30分钟后进行的，在该时间点检测不到吗啡单纯局部给药的效应。对吗啡单纯鞘内给药或联合一定剂量(15mM)的局部给药确定了ED50值及其95％可信区间。检测是在治疗15分钟后进行的，在该时间点吗啡单纯局部给药仅有有限的(15％)反应。
即使在测试的时间点(30分钟)单纯局部给药的吗啡没有活性，吗啡局部给药使吗啡全身给药的镇痛效力增加几乎7倍。局部给药的吗啡也将吗啡鞘内给药的效力增加几乎12倍。因而，这些结果支持早期的关于外周和中枢吗啡镇痛系统间相互增强的推论。
实施例5
外周吗啡耐受吗啡全身给药后，外周系统在耐受产生中很重要(Kolesinkov等，1996)。尾巴浸润途径允许药物反复在局部使用，而不造成组织损伤，方便了外周吗啡耐受的研究。每日吗啡局部给药(15mM)，在第三天产生显著的耐受性(图4)，将吗啡的ED50值改变9倍多(表4)。与每天全身给药相比，局部给药的耐受性产生得更迅速，程度更深，全身给药治疗5天，吗啡的剂量-效应关系仅改变2倍。
表4对吗啡全身及局部给药的耐受
在初次给药的小鼠和长期接受吗啡的小鼠中确定全身或局部给药后吗啡的ED50值。利用至少三个剂量的药物(n=10-20/剂)测定ED50值及其95％的可信区间。在全身给药组中，在检测前小鼠每日接受吗啡给药(5mg/kg，皮下注射)，连续4天；而局部给药组每天用吗啡溶液(15mM)处理，连续2天，第三天测定ED50值。至少用吗啡的三个剂量来计算ED50值。
吗啡全身给药的小鼠显示对局部给药的吗啡以及μ肽DAMGO显著的耐受性(图5)。然而，在这些小鼠中，局部M6G的镇痛活性依然未变，证实了缺少先前报道的交叉耐受(Rossi等，1996)。
实施例6NMDA拮抗剂MK801对外周吗啡耐受的阻断NMDA/一氧化氮级联放大在吗啡耐受的产生中起重要作用(Kolesnikov等，1993)。阻断该系统可阻止吗啡耐受的发展，且不影响止痛作用。NMDA拮抗剂MK801全身给药也可以阻止对吗啡局部给药的耐受产生(图6a)。MK801局部给药也可以阻断吗啡耐受，与全身给药一样有效(图6a)，但是MK801鞘内给药则无效。局部MK801的作用是剂量依赖性的，0.3mM可有效阻断耐受(图6b)。
此外，MK801局部给药可逆转已经建立的耐受(图6c)。小鼠用吗啡单纯局部给药处理3天后镇痛效应消失。在处理方案中增加MK801，尽管继续施与吗啡，但在随后两天恢复了镇痛药的敏感性。较高剂量的MK801比较低剂量的略更有效。首剂后伴随无效的慢速逆转强烈反驳了吗啡效力的单纯增强作用。
实施例7NMDA受体拮抗剂氯胺酮对外周吗啡耐受的阻断每天吗啡局部给药(15mM)可导致耐受，在第三天止痛作用完全消失(图7A和7B)。NMDA受体拮抗剂氯胺酮全身给药可阻止局部吗啡用药的耐受，但是鞘内氯胺酮给药无效(资料未示)。局部氯胺酮与吗啡联合给药与全身给药一样有效，均以剂量依赖的方式阻断耐受性(图7A)。低剂量(3.6mM)延缓耐受的出现，而高剂量(36mM)有效阻断耐受。在该检测中，单纯氯胺酮无可检测到的作用。
局部氯胺酮还可逆转已经建立的耐受(图7B)。小鼠用一定浓度的吗啡单独局部治疗3天后，止痛作用消失。在治疗方案中增加氯胺酮，尽管继续施与吗啡，但在随后的三天恢复了镇痛药的敏感性。
氯胺酮局部给药的阻止和/或逆转吗啡耐受的能力提示一个外周作用机制，而且与利用dizocilpine(MK801)的上述实验相似。机理上，这些观察结果与外周耐受由外周NMDA受体介导的可能性一致，所述受体可能位于含阿片样受体之相同背根神经节的神经元上。
讨论外周阿片样物质的作用在我们理解阿片样物质的作用中变得越来越重要，这由在吗啡全身给药的作用中外周和中枢的协同作用所证实(Kolesnikov等，1996)。此外，外周作用位点对全身给药的耐受的发展起主要作用。探讨外周机制并不是简单的事。早期的研究利用尾部局部注射来检测外周机制。虽然有用，但这种方法有许多缺点，尤其是在反复给药观察时。为了避免这个问题，我们发展了一种局部给药的方法，这种方法普遍适合于生物碱和肽。尾浸泡技术有许多优点。首先可以反复治疗小鼠，而在注射后不产生组织损伤。此范例是选择性的针对局部机制的。检测尾的近侧端没有发现任何镇痛效应，证实了用I125-阿片样物质进行的分布研究，此研究证明放射性标记物仅定位在被溶液浸润的区域，而且在血液或中枢神经系统中没有发现任何可检测到的吸收。同样重要的是，单纯DMSO对甩尾检测没有影响。推测该方法并不限于DMSO，其他溶剂或局部膏剂也可以使用。我们没有预测局部肽溶液是否有活性，但是在该范例中许多不同的μ和δ肽是有效的。很明显，局部给药方法为这些全身给药并不非常有效的肽提供了新的临床应用可能性。因而，局部给药方法为外周阿片样物质机制的检测提供了有效的方法，且可在疼痛治疗中作为一种治疗方法。
在外周，所有被检测的阿片样物质都是有效的镇痛药，在这三种中，DAMGO最为有效。吗啡和M6G相似的外周效力与它们中枢作用相反，在中枢M6G的活性比吗啡高约100倍多。在所有的实验中，没有暴露于阿片样物质溶液的近侧尾段没有止痛效应，证实了在阿片样物质溶液中浸泡的部位的外周作用位点。这些反应容易被纳洛酮拮抗。在中枢，3-MeONtx选择性的逆转M6G的止痛作用，而不影响吗啡的止痛作用，这与作用的不同受体机制相一致(Brown等，1997)。3-MeONtx也可以逆转外周M6G的止痛作用，而不影响DAMGO或吗啡的作用。因而，与中枢一样，外周M6G止痛作用有相同的拮抗剂选择性。
先前的研究已经证实了外周和中枢吗啡作用的协同作用。本研究证实了这些早期研究。吗啡局部给药与全身或脊柱给药联合应用表明可显著增加效应，超过它们相互间简单的累加。因而，如果在临床上将要应用阿片样物质局部给药时，这些结果提示与全身给药联合应用可能是最有效的。通过降低全身给药的必需剂量，阿片样物质局部给药可能大大减少现有与阿片类镇痛药相关的副作用。
吗啡长期全身给药治疗会导致耐受。定位吗啡耐受的位点是困难的。吗啡全身给药耐受的小鼠对于吗啡脊柱给药和棘上给药显示正常的敏感性(Roeig等，1984)，但对外周给药则不行(Kolesnikov等，1996)。事实上，在局部吗啡剂量效应曲线中19倍的变化，远远超过了全身给药后的变化。我们当前的研究支持外周位点在吗啡耐受中的作用。长期吗啡局部给药可非常迅速地产生耐受性，三天便使效应降低至检测不到的水平，相应的剂量效应曲线改变9倍多。长期用DMSO单独给药没有作用。相同镇痛剂量全身给药时，耐受的发展速度较慢，程度较低，5天后剂量效应曲线仅改变2倍。小鼠的外周吗啡耐受与DAMGO有交叉耐受，但与M6G没有。这种交叉耐受的缺失与3-MeONtx选择性逆转M6G的镇痛作用一致，也与M6G作用的独特受体机制一致。
N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂或一氧化氮合成酶抑制剂可阻止吗啡耐受的产生(Trujillo和Akil,1994；Gutstein和Trujllo,1993；Ben-Eliyahu等，1992；Kolesnikov等，1993)。在这些范例中，考虑到耐受中外周阿片类物质机制的重要性，我们观察了外周NMDA拮抗剂的作用。吗啡局部用药的耐受可以被MK801全身给药或局部给药有效地阻断，但脊柱给药则不能。MK801全身给药可能会进入到整个动物体内，包括外周位点，而鞘内给药将被限制在中枢位点。同样，氯胺酮局部给药可阻止和/或逆转吗啡耐受。因而，在该模型中，只有进入到外周位点的治疗才是有作用的，提示外周NMDA受体负责介导吗啡局部用药的耐受。最近的证据支持在外周皮肤的轴突上存在兴奋性氨基酸(EAA)受体(Carlton等，1995；Davidson等，1997；Zhou等，1996)。还需要进行另外一些研究以证实作用位点。然而，局部NMDA拮抗剂的活性为疼痛治疗提出了许多临床可能性。许多现有NMDA受体拮抗剂由于较强致神经错乱副作用而不适合于临床应用。将它们的应用限制于局部制剂可以提供一种途径以利用它们干扰耐受的发展而不产生限制性副作用的能力。
外周阿片样物质显然在止痛和耐受中起重要作用。阿片样物质局部给药可单独产生止痛作用并且可增加全身给药的效应，这种能力提供了一种新的治疗方法，其临床上可能会被证明是有效的。局部应用的肽的活性进一步加强了该方法，因为它为许多高度选择性药剂找到了通过非μ阿片受体机制发挥作用的应用方法。最后，利用外周作用的NMDA拮抗剂阻断局部给药的耐受性在临床治疗疼痛中是另一个另人兴奋的进展。
参考文献Barber,A和Gottschlich,R(1992)。阿片样物质激活剂和拮抗剂评估它们在炎症中的外周作用。医学研究综述(Med Res Reviews)12:525-562Ben-Eliyahu,S,Marek,P,Vaccarino,AL,Mogil,JS,Sternberg,WF和Liebeskind,JC(1992).NMDA受体拮抗剂MK-801在大鼠中防止长期非相关性吗啡耐受。脑研究(Brain Res)575:304-308。
Brown,GP,Yang,K,King,MA,Rossi,GC,Leventhal,L,Chang,A和Pasternak,GW(1997)。3-甲氧纳曲铜，一种选择性海洛因/吗啡-6β-葡糖苷酸拮抗剂。欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett)412:35-38。
Carlton,SM,Hargett,GL和Coggeshall,RE(1995)谷氨酸受体在大鼠无毛皮肤的有髓轴突中的定位和激活。神经科学快报(Neurosci Lett)197:25-28。
Chien,C-C,Carroll,FI,Brown,GP,Pan,Y-X,Bowen,W和Pasternak,GW(1997)[125I]3′(-)-碘戊唑辛，一种选择性σ1受体配体的合成和鉴定。欧洲药理学杂志(Eur J Pharmacol)321:361-368。
Dahl,MR,Dasta,JF,Zuelzer,W和McSweeney,TD(1990)利多卡因对关节镜膝手术的局部镇痛作用。麻醉和镇痛(Anesth Analg)71:670-674。
Dalsgaard,J,Felsby,S,Juelsgaard,P和Froekjaer,J(1994)在日常做膝关节镜时关节内吗啡镇痛作用随机双盲前瞻性研究。疼痛(Pain)56:151-154Davidson,EM,Coggeshall,RE和Carlton,SM(1997)外周NMDA和非NMDA谷氨酸受体在大鼠福尔马林检测中促成疼痛感觉。神经报道(Neuroreport)8:941-946。
Gustein,HB,和Trujillo,KA(1993)MK801在脊柱位点抑制吗啡耐受的发展。脑研究626:332-334。
Heard,SO,Edwards,T,Ferrari,D,Hanna,D,Wong,PD,Lil和,A和Willock,MM(1992)在关节镜手术后关节内给药的布比卡因或吗啡的镇痛效应前瞻性随机双盲研究。麻醉和镇痛74:822-826。
Joris,JL,Dubner,R和Hargreaves,KM(1987)阿片样物质在外周位点的镇痛作用在应激或炎症时是释放的阿片样物质的靶点吗？麻醉和镇痛66:1277-1281Junien,JL和Wettstein,JG(1992)阿片样物质在外周止痛中的作用。生命科学(Life Sci)51:2009-2018。
Khoury,GF,Chen,CAN,Garl和，DE和Stein,C(1992)膝关节镜检查后为控制疼痛而吗啡、布比卡因和吗啡/布比卡因关节内给药。麻醉学(Anesthesiology)77:263-266Kolesnikov,YA,Jain,S,Wilson,R和Pasternak,GW(1996)外周吗啡镇痛作用与中枢位点的协同作用和吗啡耐受的靶点。药理学实验治疗杂志(JPharmacol Exp Ther)279:502-506。
Kolesnikov,YA,Pick,CG,Ciszewska,G和pasternak,GW(1993)一氧化氮合成酶抑制剂阻断对吗啡的耐受但不阻断对χ阿片耐受。美国国家科学院院刊(Proe natl acad sci USA)90:5162-5166Mays,KS,Nejat,R和Schnapp,M(1987)吗啡外周神经束注射产生镇痛作用而无麻醉作用。麻醉和镇痛66:417-420。
Pick,CG,Nejat,R和Pasternak,GW(1993)在遗传上不同的小鼠品系中两种药理学上不同的μ镇痛系统的独立表达。药理学实验治疗杂志2265:166-171Raja,SN,Dickstein,RE和Johnson,CA(1992)膝关节镜手术后布比卡因和吗啡关节内给药治疗后的镇痛作用的比较。麻醉学77:1143-1147Reisine,T和Pasternak,GW(1996)阿片类镇痛药及其拮抗剂。见Goodman和Gilman’s；治疗学的药理基础，JG Hardman和LE Limbird编，521-556页，McGraw-Hill。
Roerig,SC,O′Brien,SM,Fujimoto,JA和Wilcox,GL(1984)吗啡镇痛作用的耐受脊柱和棘上位点多重相互作用的减少。脑研究308:360-363Rossi,GC,Brown,GP,Leventhal,L,Yang,K和Pasternak,GW(1996)新的海洛因和吗啡-6β-葡糖苷酸的受体机制。神经科学快报216:1-4Stein,C(1993)阿片样物质镇痛作用的外周机制。麻醉与镇痛76:182-191Stein,C,Schafer,M和Hassan,AHS(1995)外周阿片样物质受体。医学纪事(Ann med)27:219-221Trujillo KA和Akil,H(1994)非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂对阿片耐受的抑制。脑研究633:178-188Zhou,S,Bonasera,L和Carlton,SM(1996)NMDA、AMPA或KA的外周给药导致大鼠的疼痛。神经报道7:895-900
权利要求
1.一种局部药物组合物，其包括至少一种N-甲基-D-夭冬氨酸受体拮抗剂和至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药，以及一种可药用的局部赋形剂。
2.根据权利要求1的局部药物组合物，其包括至少一种镇痛药，且其中的镇痛药选自阿片、阿片衍生物、阿片样物质、脑啡肽、内啡肽及合成的阿片肽。
3.根据权利要求2的局部药物组合物，其中阿片样物质选自乙基吗啡、氢吗啡、吗啡、羟基二氢吗啡酮、可待因、左啡诺、羟考酮、戊唑辛、丙氧酚、芬太尼、舒芬太尼、洛芬太尼、吗啡-6-葡糖苷酸和丁丙诺啡。
4.根据权利要求2的局部药物组合物，其中脑啡肽选自[D-Ala2,MePhe4,Gly(ol)5]脑啡肽和内啡肽。
5.根据权利要求1的局部药物组合物，其中镇痛药为吗啡。
6.根据权利要求1的局部药物组合物，其中NMDA受体拮抗剂选自右美沙酚、右啡烷、氯胺酮、吡咯并喹啉醌、顺-4-(膦酰甲基)-2-哌啶羧酸、MK801、美金刚和它们的混合物及它们的可药用盐类。
7.根据权利要求1的局部药物组合物，其进一步包括一种局部麻醉剂。
8.根据权利要求7的局部药物组合物，其中局部麻醉药选自利多卡因、丁哌卡因、甲哌卡因、罗哌卡因、丁卡因和苯唑卡因。
9.一种为哺乳动物提供外周镇痛作用的方法，其包括在局部施与至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药之前、同时或之后局部应用减轻或预防耐受的剂量的至少一种NMDA受体拮抗剂。
10.根据权利要求9的方法，其中NMDA受体拮抗剂选自右美沙酚、右啡烷、氯胺酮、吡咯并喹啉醌、顺-4-(膦酰甲基)-2-哌啶羧酸、MK801、美金刚和它们的混合物及它们的可药用盐类。
11.根据权利要求9的方法，其中镇痛药选自阿片、阿片衍生物、阿片样物质、脑啡肽和内啡肽。
12.根据权利要求11的方法，其中阿片样物质选自乙基吗啡、氢吗啡、吗啡、羟基二氢吗啡酮、可待因、左啡诺、羟考酮、戊唑辛、丙氧酚、芬太尼、舒芬太尼、洛芬太尼、吗啡-6-葡糖苷酸和丁丙诺啡。
13.根据权利要求9的方法，其中脑啡肽选自[D-Ala2,MePhe4,Gly(ol)5]脑啡肽和内啡肽。
14.根据权利要求9的方法，其中NMDA受体拮抗剂的给药剂量为大约0.1％至大约5％。
15.为已针对一种镇痛药产生耐受性的哺乳动物提供镇痛作用的方法，其包括在局部或全身施与至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药的同时或之后，局部施与有效逆转耐受的剂量的至少一种NMDA受体拮抗剂。
16.一种抑制对镇痛药耐受的药剂盒，其包括(A)一种局部或全身给药的药物组合物，其包括至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药；(B)一种局部给药的药物组合物，其包括至少一种抑制耐受的NMDA受体拮抗剂。
17.一种为哺乳动物的提供镇痛作用的方法，其包括在全身或鞘内施与通过阿片受体发挥作用的第二种镇痛药之前、同时或之后，局部施与至少一种通过阿片受体发挥作用的镇痛药。
18.根据权利要求17的方法，其进一步包括局部施与减轻或预防耐受的剂量的至少一种NMDA受体拮抗剂。
全文摘要
本发明开发了一种阿片样物质局部给药的范例来确定吗啡的外周镇痛效应。在辐射热甩尾实验检测中,吗啡以及如[D－Ala2,MePhe4,Gly(ol)5]脑啡肽(DAMGO)的肽局部给药产生有效的剂量效应依赖的镇痛作用。局部给药可以增强全身给药的效力,这与先前确定的外周和中枢位点的协同作用相似。反复每天局部接触吗啡可迅速产生局部耐受。吗啡局部耐受可以被全身或局部给药的N－甲基－D－天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂MK801和氯胺酮有效阻断。NMDA受体拮抗剂可以逆转已存在的吗啡耐受。局部给药的NMDA拮抗剂阻断局部吗啡耐受的作用说明外周NMDA受体介导局部吗啡的耐受。吗啡与[D－Ala2,MePhe4,Gly(ol)5]脑啡肽(DAMGO)有交叉耐受,但与吗啡－6β－葡糖苷酸没有交叉耐受,说明有不同的作用机制。这些结果对阿片样物质的临床设计和利用有重要作用。本文描述了产生镇痛作用但不诱导耐受的局部药物组合物,其包括一种通过阿片受体发挥作用的镇痛剂以及一种NMDA受体拮抗剂。
文档编号A61K31/21GK1309562SQ99808693
公开日2001年8月22日 申请日期1999年7月15日 优先权日1998年7月16日
发明者尤里·科勒斯尼科夫, 加夫里尔·W·帕斯特纳克 申请人:纪念斯隆-凯特林癌症中心