一种促肝细胞生长素原液及冻粉针剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及促肝细胞生长素技术领域，具体地说，涉及一种促肝细胞生长素原液 及冻粉针剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 促肝细胞生长素是从健康乳猪肝脏中提取的小分子生物活性多肽物质，能刺激正 常肝细胞DNA合成，促进肝细胞再生，主要用于治疗重症肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化等 疾病。
[0003] 从健康乳猪肝脏中提取制备促肝细胞生长素生物制剂类药物，已有较多专利 和文献报道。如专利ZL03116052. 2中公开了一种促肝细胞生长素注射液及制备方法， 其中的肝细胞生长素为从乳猪中提取分离获得的一种活性蛋白质；其没有采用低温匀 浆、细胞破碎等关键工序，且灭活温度高高至95±2°C，易导致活性可能降低等缺点。如 ZL201110264981.7中公开了一种促肝细胞生长素，其制剂和用途，其中虽然控制了匀浆 温度和灭活温度，但是没有采用细胞破碎，其通过控制解冻速度和反复冻融破碎细胞和 控制酶分解，来提高蛋白质及多肽释出并降低组胺产生，每次冻结的时间都需大于7天， 蛋白质降解依然效率不高，所得产品中多肽含量较低，降压物质水平依然较高，批间品质 控制难度大，生产周期较长，不易达到国家限定标准。其冻干技术采用常规冻干技术。如 ZL201110197386. 6中公开的一种注射用促肝细胞生长素制备方法，其中用磷酸调pH值为 1. 8-2. 0 ;较低的pH值，易破坏有效成分活性，没有浓缩工艺，原液含量较低，不易制备冻干 制剂；虽有病毒灭活工序，但IOkd超滤只有一次，终产品质量控制不易保证达到临床安全 使用要求。
[0004] 现有技术均无本工艺方法中所含高速低温剪切破碎工艺、浓缩中采取的内循环加 外循环浓缩工艺、病毒灭活结合二次超滤去热原配套工艺、以及冻干制剂制备采用两级温 度干燥等先进关键工艺。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种促肝细胞生长素原液及冻粉针 剂的制备方法。本产品具有生产周期短，较低能耗、病毒去除保障系数高，冻干制剂成型好、 速度快等优势，产品具有活性高，组分中多肽含量高，氨基酸比例稳定，指纹图谱表现稳定， 批间差异小、水分低、品质更稳定的优点。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种促肝细胞生长素原液的制备方法，包括以下步骤：
[0008] ⑴取新鲜健康乳猪肝脏纯化水清洗、去结缔组织杂质，切碎，0?KTC冷库内沥血 水，取出加纯化水洗绦，按1:1?1. 5的体积比加入< 10°C纯化水胶体磨匀衆，细胞破碎，分 装于合适容器内，-20°c以下冻结48小时以上；
[0009] ⑵解冻，加纯化水按照乳猪肝1:2?2. 5定容，调pH6. 0?7. 5,水浴加热80 ± 2°C， 15-20分钟，过滤离心后取上清液冷却至10?20°C ;
[0010] ⑶用60kd滤膜过滤后用截留分子量10000道尔顿的超滤膜超滤，即为促肝细胞 生长素粗提液；用RO膜连续浓内循环缩至乳猪肝重量的1/2-1/3 ;
[0011] ⑷_20°C以下冻结48小时以上，解冻，过滤去除沉淀；
[0012] (5)用截留分子量10000道尔顿的超滤膜超滤，除菌过滤后无菌分装，即为促肝细 胞生长素原液；-20°C以下冻结保存。
[0013] 一种促肝细胞生长素冻粉针剂的制备方法，包括以下步骤：
[0014] (1)上述原液解冻，加入赋形剂5 %?10%重量百分数，0.2 μπι膜除菌过滤，灌 装；
[0015] (2)冻干，灌装制品温度达到_40°C以下时，继续降温3?6小时，且冷凝器的温度 达到-50°C以下时，抽真空至真空度低于IOPa时，一次干燥温度设定为0°C以下干燥；二次 干燥温度设定为l〇°C?40°C，到达温度恒温干燥6小时以上，真空压塞。
[0016] 本发明的细胞破碎在低温下进行，且高速机械剪切可以更有效破坏酶分解成组 胺，此类产品注册质量标准降压物质限度为〇.5mg/kg注射剂量，本发明制备产品其降压 物质限度可达2mg/kg注射剂量，表明该制品在临床使用中具有更好的安全性。本方法使 用连续浓缩和内循环加外循环浓缩等先进工艺，膜的一端进浓缩前的稀液，另一端收集浓 液，在浓缩压力较低水平下，达到浓缩速度快、浓缩含量高同时膜的使用寿命长的目的。本 发明病毒灭活工艺采取多项复合工艺：依据《多组分生化药注射剂基本技术要求》设计在 80°C ±2°C加热，结合2次IOkd超滤后制得原液，病毒去除、热原性物质去除更有保障。本 发明冻干制剂制备技术中采取二次低温预冻，在较低温度下抽真空，且设定两次干燥温度 及干燥时间，所得制品水分可低于1. 5%以下，有良好的物理形态，颜色均匀一致，内部疏松 多孔，复水迅速而完全。
[0017] 在上述促肝细胞生长素原液及冻粉针剂的制备方法中，所述0?l〇°C冷库内沥血 水，去除血渍等杂质；加入< l〇°C冷纯化水胶体磨匀浆，以多40m/s剪切力细胞破碎，显微 镜观察细胞破损率大于95%，有效保证了提取率。水浴加热80±2°C，15-20分钟，能致人 畜共患病毒灭活。60kd滤膜过滤后用截留分子量IOkd的超滤膜超滤，分级超滤，减少杂蛋 白包裹小分子生物活性物质，所用60kd和IOkd膜均为耐高温聚醚砜卷式切向流膜；RO浓 缩为内循环连续低压力浓缩，大大减少浓缩液在膜内时间，浓缩液含量高，更好保证产品质 量。-20°C以下冻结48小时以上，解冻，过滤去除沉淀，可提高冻干后药品的不溶性微粒和 澄清度。该工艺顺序设计及多种病毒通过上述工艺的灭活正交验证。依据多组分生化药品 技术指导原则设定的80±2°C，15分钟病毒灭活，其后分级过滤及2次IOkd膜超滤交替工 艺设计致病毒灭活完全。二级冻干，温度分别为〇°C以下和10?20°C恒温6小时以上，温 度变化以脉冲方式直至稳定，所得制剂水分含量< 1. 5%。
[0018] 在上述促肝细胞生长素原液及冻粉针剂的制备方法中，该水解物制备的注射 剂，MTT方法采用人体抗肝癌细胞，以刺激指数衡量样品活力，所得的促肝细胞生长素活力 多5. 0 ;所得的促肝细胞生长素含有多种游离氨基酸。上述赋形剂为甘露醇。
[0019] 本发明是由健康乳猪肝脏提取制得的，含有多肽类、氨基酸类、核酸类等物质，均 含有肝细胞刺激因子（HSS)、肝细胞生长因子（HGF)及多种游离氨基酸和微量元素等。用 四氮甲唑蓝（MTT)法测定分析其活性。促肝细胞生长素（pHGF)的生物活性多肽制剂，主 要用于治疗重症肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化等疾病，由于疗效确切，副作用小，被广泛 应用于临床。本发明的制备方法提取率高、时间短、所得小分子肽含量较高，反相肽图色谱 鉴别指纹图谱相似度> 0. 90、所得促肝细胞生长素原液多肽含量多38mg/ml、多肽回收率 彡92%、活力检测刺激指数彡5. 0。
[0020] 与现有技术相比具有如下有益效果：
[0021] 1.现有技术中均无本方法所含的高速低温剪切破碎工