含细胞因子溶液的新组合物的制作方法
【专利说明】含细胞因子溶液的新组合物
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]依据35USC§ 119(e)，本申请要求以2007年8月22日提交的美国临时申请60/965，707和2008年4月30日提交的美国临时申请61/125，960为优先权基础，这两项临时申请以引用的方式全文纳入本文。
技术领域
[0003]本发明的技术领域涉及含细胞因子溶液的新组合物(在本文中称为“CFS”组合物)，包括持续释放的含细胞因子溶液的新组合物(在本文中称为“SR-CFS”组合物)；制备这样的新组合物的方法；以及所述组合物的用途。
【背景技术】
[0004]已经在许多不同的疾病、障碍和损伤的治疗中评估了许多单独的细胞因子和生长因子的治疗效用。不幸的是，其结果仅部分地令人振奋。例如，PDGF-BB已被证明可用于治疗糖尿病足溃疡；GM-CSF在欧洲上市，用于治疗静脉性溃疡和糖尿病足溃疡；HGH(人生长激素)在美国上市，用于小儿烧伤。失败事件包括BDNF、CNTF和IGF-1，已经在被设计来测试其治疗ALS的有效性的临床研宄中对它们进行了评估，每个的结果都令人失望；TGFf3 2在静脉性溃疡的2期研宄中没有成功；IGF-1和TOGF的组合疗法在糖尿病足溃疡治疗中没有成功。
[0005]虽然不清楚为什么有这么多单独的细胞因子和生长因子在临床中失败，但是一个理论是所给予的蛋白剂量是非生理性的，即这些剂量远高于正常出现在体内的生理水平。同时，由于细胞因子和生长因子在一个给定的生理状况下的复杂相互作用，仅施用一种因子(特别是异常高水平的因子)无法重现所述生理状况，并且事实上可能会严重干扰其微妙的平衡。
[0006]综合它们在临床中有限的成功，细胞因子和生长因子以及其他基于蛋白的治疗剂通常比其他药物更难以给予患者。由于蛋白的有效性与其形状有关，基于蛋白的治疗剂不能经受可能引起其中包含的一种或多种蛋白解折叠或变性的条件。因此，在基于蛋白的治疗剂的制备、存储和给药方面需要特别小心。
[0007]除了避免任何的蛋白变性之外，经常还需要能够控制随时间给予患者的蛋白量。这有助于避免患者中的蛋白浓度达到不希望的高或低，或者距希望的水平偏差太多，而是有助于将患者中的所述治疗剂维持在稳定水平。为满足这一点，已经开发出或者正在开发许多治疗剂(包括基于蛋白的治疗剂)的持续释放制剂。基于蛋白的持续释放治疗剂可通过多种方法进行给药，所述方法包括但不限于片剂或胶囊剂的口服递送、粉剂的吸入、植入、整合至基质中，或者装入胶囊的治疗剂的局部外用，蛋白从该治疗剂中随时间逐渐释放。
[0008]这些持续释放制剂的制备方法是不同的。一种方法包括将蛋白与有机溶剂相混合。例如，粉末制剂可通过将蛋白和有机溶剂的混合物喷雾至液氮中进行制备。另一种方法涉及将蛋白与可生物侵蚀/可生物降解聚合物溶于有机溶剂所得到的溶液相混合，从而通过凝固所述混合物而形成包含所述蛋白和所述聚合物的微粒。在又一种方法中，可将蛋白、粉化制剂或微粒与有机溶剂混合，以产生可注射至患者体内或外部施用的液体剂或凝胶剂。不幸的是，使用有机溶剂的缺点是它们有引起蛋白变性的倾向。
[0009]添加剂已被用于在存在变性有机溶剂的情况下稳定蛋白。这些添加剂包括表面活性剂(参见美国专利5，096，885)、氨基酸(参见美国专利4，297，344)、多元醇(参见美国专利5，589，167)、天然聚合物(参见WO 8903671)、合成聚合物(参见Pharm.Res.8:285291, 1991)和金属(参见美国专利6，191，107B1)，这些文献的每一篇均通过引用的方式纳入本文。
[0010]迄今为止，尚没有这样的基于蛋白的治疗剂(即细胞因子和生长因子)，即所述治疗剂能有效地重现或模拟在健康状态以及疾病或受伤状态的体内天然出现的生理相关细胞因子和生长因子的复杂组合和生理水平。现有的每种基于蛋白的治疗剂的给药剂量均比体内正常出现的细胞因子或生长因子的水平高许多倍。另外，至今无人能以生理水平给予这些生理相关的细胞因子和生长因子。此外，至今无人能以持续释放制剂的形式以生理水平给予这些生理相关的细胞因子和生长因子。因此，申请人在本文中首次提出了本发明，其目标是满足这样的未被满足的医学需求，即以生理水平提供生理相关的生长因子和细胞因子(CFS组合物)，在一些情况下，使用一种持续释放的制剂(SR-CFS组合物)以生理水平递送这些生理相关的生长因子和细胞因子。
【发明内容】
[0011]本发明的目标是，提供含细胞因子溶液(CFS)的新组合物，所述组合物可对出现于生物学状况中的这些细胞因子和生长因子的复杂且独特的组合和生理水平进行重现。本发明的另一目标是提供持续释放的含细胞因子溶液(SR-CFS)的新组合物，所述组合物含有天然出现于生物学状况中的所述细胞因子和生长因子的复杂且独特的组合和生理水平。由于所述细胞因子的存在水平与出现于体内的生理水平相当，它们最适合在需要介入的治疗应用中使用，以支持、启动、代替、加速又或影响疾病和/或损伤的治疗和/或愈合中涉及的生化过程和生物过程。对于SR-CFS组合物，细胞因子随时间缓慢释放，以提供持续稳定生理水平的这些因子，以优化愈合和/或恢复。
[0012]除了本发明描述的所述新CFS组合物外，本发明的目标还在于提供用于制备所述新CFS组合物和SR-CFS组合物的方法及所述组合物的治疗用途，所述方法包括合并源自细胞的组合物(即合并的ECS组合物和合并的ACCS组合物)。
[0013]源自细胞的合并组合物具有数种重要性质和特征，包括与非合并组合物相比，降低了治疗效果所必需的生理相关细胞因子水平的变异性。所述细胞因子的存在水平与出现于体内的生理水平相当，因此最适合在需要介入的治疗应用中使用，以支持、启动、代替、加速又或影响疾病和/或损伤的治疗和/或愈合中涉及的生化过程和生物过程。本文描述的将源自细胞的组合物合并以降低变异性的新方法有这样的效果，即:使得每个合并物中的分泌因子的水平优化，从而实现其全部治疗潜力。除了这种合并组合物的治疗价值之外，所述将样品合并以降低非合并的组合物与组合物之间的变异性的方法也具有重要的商业优势，即:可以通过使非合并组合物因不满足产品规格而被淘汰的情况最少从而提高产率，其结果是降低生产成本并增加收益。
[0014]因此，本发明的第一方面是一种源自胚外细胞的细胞因子溶液的组合物，包含生理浓度的a)选自VEGF、TGFβ 2、血管生成素和TOGF的至少一种因子；以及b)至少一种MMP抑制剂。在另一个实施方案中，所述第一方面的组合物包含生理浓度的a)选自VEGF、TGF β 2、血管生成素和TOGF的至少两种因子；以及b)至少一种MMP抑制剂。在另一个实施方案中，所述第一方面的组合物包含生理浓度的a)选自VEGF、TGF β 2、血管生成素和TOGF的至少三种因子；以及b)至少一种MMP抑制剂。在一个具体的实施方案中，所述MMP抑制剂选自??ΜΡ-1和??ΜΡ-2。在又一个实施方案中，所述第一方面的组合物包含生理浓度的VEGF、TGF β 2、血管生成素、PDGF和??ΜΡ-1。在又一个实施方案中，所述第一方面的组合物包含生理浓度的VEGF、TGF β 2、血管生成素、PDGF和??ΜΡ-2。在一个具体的实施方案中，所述第一方面的组合物包含生理浓度的VEGF、TGF β 2、血管生成素、PDGF, TIMP-1和??ΜΡ-2。
[0015]本发明的第二方面是这样的，即其中所述源自胚外细胞的细胞因子溶液为源自羊膜的细胞因子溶液。在第二方面的一个具体实施方案中，所述源自羊膜的细胞因子溶液包含生理浓度的VEGF、TGF β 2、血管生成素、PDGF, TIMP-1和??ΜΡ-2。
[0016]本发明的第三方面是一种持续释放组合物，所述组合物包含第一方面的源自胚外细胞的细胞因子溶液或第二方面的源自羊膜的细胞因子溶液。
[0017]本发明的第四方面是一种制备源自羊膜的细胞因子溶液的方法，包括a)从胎盘羊膜分离羊膜上皮细胞，b)从所述羊膜上皮细胞选取AMP细胞，c)培养所述AMP细胞直至它们汇合，d)更换培养基，e)在所述培养基中培养所述细胞，以及f)收集步骤e)的培养基以得到源自羊膜的细胞因子溶液。在第四方面的一个具体实施方案中，将步骤(f)重复多次，并将每个步骤(f)中得到的源自羊膜的细胞因子溶液合并以形成合并的源自羊膜的细胞因子溶液。
[0018]本发明的第五方面是通过第四方面的方法制备的源自羊膜的细胞因子溶液。在一个实施方案中，第五方面的源自羊膜的细胞因子溶液是这样的，即其中所述溶液包含生理浓度的因子^^^^6叩2、血管生成素、？06?、1'頂?-1和/或1'頂?-2。在本发明组合物的一些实施方案中，VEGF的生理浓度为约5.0-16ng/mL，血管生成素的生理浓度为约3.5-4.5ng/mL，PDGF的生理浓度为约100_165pg/mL，TGF β 2的生理浓度为约2.5-2.7ng/mL, TIMP-1的生理浓度为约0.68 μ g/ml, TIMP-2的生理浓度为约1.04 μ g/mL。
[0019]本发明的第六方面是一种生理性细胞因子溶液的组合物，含有基本由生理浓度的以下成分组成的治疗组分:a)选自VEGF、TGF β 2、血管生成素和TOGF的一种或多种因子，b)至少一种MMP抑制剂；以及c)载体，其中VEGF的生理浓度为约5.0_16ng/mL，血管生成素的生理浓度为约3.5-4.5ng/mL，PDGF的生理浓度为约100_165pg/mL，TGF β 2的生理浓度为约2.5-2.7ng/mL，并且其中所述载体为生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液或细胞培养基。在第六方面的一个实施方案中，所述MMP抑制剂为??ΜΡ-1和/或??ΜΡ-2，并且??ΜΡ-1的生理浓度为约0.68 μ g/mL，??ΜΡ-2的生理浓度为约1.04 μ g/mL。第六方面的另一个实施方案含有基本上由生理浓度的以下成分组成的治疗组分:a)VEGF、TGFf3 2、血管生成素和TOGF，b)TIMP-1和/或??ΜΡ-2 ;以及c)载体；其中VEGF的生理浓度为约5.0_16ng/mL，血管生成素的生理浓度为约3.5-4.5ng/mL，PDGF的生理浓度为约100_165pg/mL，TGF β 2的生理浓度为约2.5-2.7ng/mL，TIMP-1的生理浓度为约0.68 μ g/mL，TIMP-2的生理浓度为约1.04 μ g/mL，并且其中所述载体为生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液或细胞培养基。
[0020]本发明的第七方面是一种生理性细胞因子溶液的组合物，含有基本上由选自以下的组合物组成的治疗组分和载体:组合物A:VEGF和??ΜΡ-1 ;组合物B:VEGF、血管生成素和??ΜΡ-1 ;组合物C:VEGF、血管生成素、PDGF-BB和??ΜΡ-1 ;组合物D:VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGF β 2和??ΜΡ-1 ;组合物E:VEGF和??ΜΡ-2 ;组合物F:VEGF、血管生成素和??ΜΡ-2 ;组合物G:VEGF、血管生成素、PDGF-BB和??ΜΡ-2 ;组合物H:VEGF、血管生成素、PDGF-BB, TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-2 ;组合物 1:VEGF、TIMP-1 和 TIMP-2 ;组合物 J:VEGF、血管生成素、TIMP-1 和 ??ΜΡ-2 ;组合物 K:VEGF、血管生成素、PDGF-BB, TIMP-1 和 ??ΜΡ-2 ;组合物 L:VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、??MP-l和??ΜΡ-2 ;组合物M:血管生成素和??ΜΡ-1 ;组合物N:血管生成素、PDGF-BB和??ΜΡ-1 ;组合物O:血管生成素、PDGF_BB、TGF β 2和??ΜΡ-1 ；组合物P:血管生成素和??ΜΡ-2 ;组合物Q:血管生成素、PDGF-BB和??ΜΡ-2 ;组合物R:血管生成素、PDGF-BB, TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-2 ;组合物 S:血管生成素、PDGF-BB, TGF β 2、TIMP-1和 ΤΙΜΡ-2 ;组合物 T:PDGF-BB 和 TIMP-1 ;组合物 U:PDGF-BB, TGF β 2 和 TIMP-1 ;组合物V:PDGF-BB 和 ΤΙΜΡ-2 ;组合物 W:PDGF-BB, TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-2 ;组合物 X:PDGF-BB, TIMP-1和??ΜΡ-2 ；以及组合物Y:PDGF-BB, TGFβ 2、TIMP-1和??ΜΡ-2 ;其中VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGF0 2、??ΜΡ-1 和 ??ΜΡ-2 为:VEGF 约 5.0_16ng/mL、血管生成素约 3.5-4.5ng/mL、PDGF 约 100-165pg/mL、TGF β 2 约 2.5-2.7ng/mL,TIMP-1 约 0.68 μ g/mL、??ΜΡ-2 约 1.04 μ g/mL,并且其中所述载体为生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液或细胞培养基。
[0021]本发明的第