金精三羧酸合成的复合物低分子量组分对补体的膜攻击复合物和c3转化酶的选择性抑制作用
【技术领域】
[0001]金精三羧酸复合物的合成
[0002]金精三羧酸复合物的合成是根据公布的标准程序进行(Cushman和kanamathareddy,1990)。
[0003]1.合成3，3’ - 二氯-5，5’ - 二羧基_4，4’ - 二羟基二苯基甲烷:
[0004]3-氯水杨酸(I克)溶解在甲醇(10毫升)中。加入水(2.5毫升)，在冰盐(NaCl)浴中烧瓶冷却至_5°C。历经20分钟慢慢加入浓硫酸(30毫升)，温度保持在_5°C。反应混合物然后在此温度下搅拌I小时，同时加入37%甲醛溶液(4毫升)。温度保持在0°C I小时，然后混合物在室温放置24小时。反应混合物倒入碎冰(150克)，和过滤沉淀，干燥，得到产物，3，3’ -二氯-5，5’ - 二羧基-4，4’ -二羟基二苯基甲烷(产量0.92g，92% )，作为粉末。样品经甲醇重结晶。
[0005]2.合成3，3’ - 二羧基-4，4’ - 二羟基二苯基甲烷:
[0006]3，3’ - 二氯-5，5’ - 二羧基-4，4’ - 二羟基二苯基甲烷(0.92克)溶解在乙醇(18毫升)和三乙胺(10毫升)中。钯碳被添加到该溶液中，在氢气气氛下搅拌混合物48小时。滤去催化剂，蒸发溶剂，和水(100毫升)加入到残留物中。将溶液冷却，和加入浓盐酸(5毫升)。将白色沉淀物过滤和干燥，得到产物，3，3’ - 二羧基_4，4’ - 二羟基二苯基甲烷(0.75克，90%)，作为固体。将它从甲醇溶解和再结晶。在剧烈搅拌下粉末状的亚硝酸钠(4克)加入浓硫酸(4毫升)。化合物3，3’- 二羧基-4，4’- 二羟基二苯基甲烷(0.75克)和水杨酸(0.38克)的混合物被搅拌，直到达到均匀。然后将其倒入硫酸钠硝酸溶液。在室温继续搅拌额外的18小时。混合物倒入碎冰(100克)，同时搅拌。将暗橙色沉淀过滤和干燥，得到粗产物(0.6克，收率60%)。粉末溶于2%氢氧化铵，用于分析。
[0007]3.3，3’，3’ -三羧基-4，4’，4’ -三羟基三苯基甲醇复合物(金精三羧酸复合物):
[0008]在剧烈搅拌下粉末状的亚硝酸钠(4克)加入浓硫酸(4毫升)。化合物3，3’- 二羧基-4，4’ - 二羟基二苯基甲烷(0.75克)和水杨酸(0.38克)的混合物被搅拌，直到均匀。然后将其倒入硝酸钠硫酸溶液。在室温继续搅拌额外的18小时。混合物倒入碎冰(100克)，同时搅拌。将暗橙色沉淀过滤和干燥，得到粗产物(0.6克，收率60%)。粉末溶于2%氢氧化铵，用于分析。
[0009]ATAC的分离和分析
[0010]从合成，或从西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)商业购买的金精三羧酸,或来自GFS化学品公司(GFS Chemicals Inc.)(哥伦布，0H)的招试剂(Aluminon)得到的粉末被分为高、低分子量组分。在一个典型的实验中，五克物质溶解在0.2%氢氧化铵(45毫升)和在空气压力下(70-75磅，5.3千克/平方厘米，持续6小时)强制通过IkDa过滤器(plac04310,微孔,Ballerica,MA)。通过冷冻干燥使过滤的物质重结晶。滤液(I毫升4.5毫克)然后装上尺寸排阻色谱柱(S^hadex LH-20填料在60%乙醇中，GE医疗，皮斯卡塔韦，新泽西(GE healthcare, Piscataway, NJ))。收集三种不同的洗脱液懼分。在Waters ZQ装置上通过质谱分析三种馏分，以及起始混合物，所述Waters ZQ装置配有ESCI离子源和Waters Alliance四极探测器。所有样品均暴露于正、负模式电喷雾电离，以及大气压化学电离。扫描范围为m/z 0-1100和m/z 500-1500。三种分子被检测为422，572，858MW。这些分子量分别对应于ATA，AQA,和AM’如图3所示。没有检测到其他小于1.5kDa的衍生物。分离和通过质量光谱学分析成分。来自三个来源的结果几乎是相同的。低分子量成分只占了总的12-16%。它们都含有分子量422，572，和858的三种分子。
[0011]低分子量产物作为膜攻击复合物和C3转化酶的选择性抑制剂的评价
[0012]为了评价金精三羧酸复合物(即ATA加AQA加AHA)的低分子量的产物阻断经典补体途径的强度，应用标准的CH50测定。通过采用兔抗绵羊红细胞抗体孵育过夜致敏绵羊红细胞。然后含有和不含不同量的低分子量金精三羧酸馏分(ATAC)的稀释的血清与致敏的红细胞在37°C孵育I小时。孵育物以5000rpm离心lOmin。从被补体攻击破坏的红细胞释放到血清中的血红蛋白，是通过读取在405nm处的光密度(OD)而测定的。作为阳性对照，用水100%溶解红细胞，作为阴性对照，无血清加入到孵育物。
[0013]结果如图3所示。这些成分中的每一个几乎以相同程度抑制人类补体介导的红细胞溶血。ATA 的 IC50值为 544nM, AQA 的 IC 50值为 576nM，AHA 的 IC 50值为 559nM 和 ATAC 的IC5tl值为580nM。大鼠血清ATAC的IC 5(|为268nM。这些数据证明了低分子量金精三羧酸衍生物抑制补体激活是在纳摩尔范围，包括啮齿类动物以及人类的血清。
[0014]为了确定在补体级联的哪个阶段发生阻断，变化CH50测定。不测量溶血，而是运行蛋白质印迹分析，以确定哪个血清补体蛋白被消耗并转化为在敏感膜上的活化的补体产物。补体蛋白质仅仅在阻断阶段被消耗和转换。在阻断之外的阶段，它们在血清中保持不变，但它们的活化的产物出现在细胞膜。结果如图4所示。人血清稀释16倍。然后用ATA，AQA，AHA或ATAC将其处理30分钟。然后加入相同体积的抗体缀合的绵羊红细胞。将所得混合物在37°C孵育I小时。然后用裂解缓冲液处理它们，之后用加载缓冲液处理它们，以用于蛋白质印迹。来自每个样品的等量的蛋白质加载到凝胶上，和用10%的SDS分离。SDS后，将蛋白转移到PVDF膜。然后对膜采用以下进行处理:采用不同的一抗，之后采用标记的二体，使用成熟的技术(李(Lee)等人，2011)。利用的抗体的列表，如表I所示。通过使用增强的化学发光系统和曝光照相胶片而可视化由抗体识别的谱带。对于采用不同的抗体探测相同的膜，采用剥离液处理膜(李等人，2011)，然后与之前一样采用不同的一抗处理。
[0015]典型的结果如图4a所示。左泳道仅加载血清，和显示，Clq，C3，C4和C5谱带很容易检测到。相邻泳道说明加入致敏的红细胞的影响，所述致敏的红细胞然后被补体攻击溶血。天然的血清蛋白被消耗，并且被并入红细胞膜。Clq不被代谢，但由于其从Cl复合物的解离，谱带加强。不再检测到天然的C3，因为它已裂解，和C3b片段已共价连接到膜。检测到降解产物C3d。C4不再被检测到，因为它同样被裂解，和C4b片段附着于细胞膜，和代谢为降解产物C4d。该片段也被检测到。C5被裂解，检测到C5a产物的谱带。最后，检测到C5b-9膜攻击复合物，其形成在红细胞膜上，引起它的溶血。
[0016]接下来膜显示，在ATAC的存在下血清加致敏的红细胞的孵化影响。对于调理步骤的相同的谱带进行检测，但红细胞不溶血，和未检测到膜攻击复合物。
[0017]为了确定膜攻击复合物的组装被阻断的阶段，进行额外的分析。除了在被处理以用于蛋白质印迹分析前红细胞从残留血清中分离和洗涤，孵育与之前一样。采用C6，C7，C8和C9的抗体对印迹进行探测。结果是显示在图中，图4b针对ATAC，图4c针对ATA，图4d针对AQA和图4e针对AHA。每个成分结果是相同的。单独的人血清泳道I显示，C6，C7，C8和C9在未经处理的血清中容易检测到。泳道2表明，在被补体攻击溶血的无保护红细胞中，这些抗体仅仅检测C5b-9，完全形成的膜攻击复合物。泳道3，其中的细胞是受ATAC保护，表明膜攻击复合物不完全形成而在C8阶段被停止。C6抗体检测C5b6，C5b67，和C5b678。C7抗体检测C5b67，和C5b678，而C8抗体检测到C5b678。这些数据表明，在C9附着C5b678的阶段ATAC停止形成膜攻击复合物。由于C9(n)被需要用于创建膜破坏孔，这一阻断是高度特异于防止C9附着。
[0018]为了确定ATAC对旁路途径的影响，进行了实验，其中采用Cl抑制剂(1.8微克/ml)或采用C4b抗体(11000倍稀释)阻断经典途径。在这些实验中，人血清(15倍稀释)与Cl抑制剂和ATA(5微米，泳道3)，或ATA与备解素(lmicrogm/ml,泳道4)或因子D (0.lmicrogm/ml,泳道5)孵育Ih,之后加入调理的酵母聚糖(lmicrogm/ml)。混合物在37°C孵育I小时，以5000rpm离心lOmin。采用汉克平衡盐溶液(HBSS)洗两次颗粒，将其采用样品加载缓冲液处理以用于SDS-PAGE和免疫印迹法。50mM Tris-HCl (pH 6.8)，
0.1% SDS，0.1%溴酚蓝和10%甘油构成缓冲液。为了保存形成的分子复合物，之后采用SD