下，经口气管插管，接小动物呼吸机，潮气量2-3ml，吸呼比I : 2,呼吸频率60次 /分。沿左胸骨第4~5肋间开胸。暴露心脏并打开心包，在左心耳和右心室流出道之间 以6. 0无创丝线结扎左冠状动脉前降支，肉眼观察前降支供血区变苍白，心电图导联ST段 弓背向上抬高，提示AMI手术成功，然后挤压胸腔以排出空气并逐层关闭胸腔，术后经腹腔 注射庆大霉素2. 4X IO4U. Kg' cf1，共3日，预防感染。
[0039] AMI术后4周存活51只，将这些大鼠随机分为慢性心力衰竭组（η= 10只，简称为 C组），本发明药物高、中、低剂量治疗组（n = 11，11，10只，分别简称为Ql、Q2和Q3组），呋 塞米治疗组（η = 9,只简称为F组），假手术组（η = 10只，简称为S组）为仅穿线而未行冠 状动脉结扎大鼠，各组大鼠经苦味酸标记，置于代谢笼饲养，待适应3日后，开始药物灌胃， 本发明药物粉〇. 3、0. 6、I. 2g溶于2ml去离子水中灌胃，呋塞米组药物剂量为4mg. kg4，假手 术组、慢性心衰组大鼠给予生理盐水2ml灌胃，收集大鼠24小时尿液并记录尿量，大鼠灌胃 4周后，称量大鼠体重，行超声心动图和血液动力学检查，然后处死大鼠，采集血液和组织标 本。
[0040] I. 2. 2尿液收集和尿渗量的测定
[0041] 记录大鼠代谢笼内24h尿量，所收集尿液在4°C条件，3000r/min离心10min，去除 细胞残骸和食物残渣，然后用冰点抑制法测定尿渗量。
[0042] 1.2.3超声心动图检查
[0043] 用彩色Doppler超声显像仪，M型曲线在左室短轴乳头肌水平测量，测定大鼠舒张 期左室前壁厚度（AWTd)、后壁厚度（PWTd)、左室舒张末内径（LVEDd)及收缩末内径（LVESd) 等指标，计算出射血分数（EF)、短轴收缩率（FS)等数值，以连续3个心动周期测量值的平均 值作为最后的检测数据，用MO盘储存资料，专人分析。
[0044] 1. 2. 4血流动力学指标测定
[0045] 戊巴比妥钠（30mg. kg，腹腔麻醉下，钝性分离大鼠右侧颈总动脉，聚乙烯导管系 统充满0. 3%肝素生理盐水以抗凝血，将导管插入颈动脉、升主动脉，稳定IOmin后，应用多 道生理仪记录平均动脉压（MBP)，然后继续送入导管，直至出现左心室压力曲线后，保持血 流动力学稳定15min时，分别记录左室收缩末压（LVESP)、左室舒张末压（LVEDP)、左室内压 最大上升速率（+dp/dtmax)、左室内压最大下降速率（-dp/dtmax)等指标，取3次测定结果 的平均值作为实验值，所有电信号均用计算机软件分析处理。
[0046] L 2. 5免疫荧光
[0047] 大鼠肾脏髓质标本快速冷冻后，经恒温冷冻切片，片厚3 μπι。冷冻切片在空气中 自然干燥，加入含30mg/L Triton Χ-100的PBS室温放置30min，经兔抗大鼠 AQP2 (稀释度 为1 : 200) 4°C孵育12h后，用FITC标记的山羊抗兔（稀释度为1 : 200) IgG抗血清室温 避光孵育2h。最后用甘油与PBS(1 : 1)的混合液封片。每步骤后均用0.01m〇l/L PBS(pH 7.4)充分洗涤。自然风干后，荧光显微镜下观察。
[0048] 1. 2. 6实时荧光定量法（qPCR)检测大鼠肾脏髓质AQP2mRNA表达
[0049] 用 Trizol 抽提的大鼠肾脏组织总 RNA 1 μ g，按照 First Strand cDNA Synthesis Kit的操作流程用Olig0(KT)18进行反转录获得单链cDNA。同时定量PCR的引物设计参考基 因在NCBI标准序列，利用Primer Premier 5进行跨内含子设计，其中Aqp2(NM_012909. 2) 上游引物：5' -ggttgctccatgaatccag-3'，下游引物：5' -ggttgctccatgaatccag-3' ； 内参照 GAPDH(NM_017008. 3)上游引物：5' -ggaccaggttgtctcctgtg-3'，下游引物： 5' -tgtaggccatgaggtccac-3'。整个实时定量PCR检测在iQ5?荧光定量PCR仪 (BIO-RAD)上完成，反应体系为20 μ 1，包含上下游引物各0.4 yM，2XAllinone? Q-PCR Mix(GeneCopoeia) 10 μ 1，模板 cDNA 0· 5 μ 1。PCR 循环条件设置为 95°C预变性 10min，95°C 变性10s，57°C退火20s，72°C延伸15s并读荧光，共40个循环，每个基因做3个复管，PCR 产物的特异性通过融解曲线分析确认。所得到的原始数据经内对照GAPDH归一化处理后用 Δ Δ Ct法进行Aqp2和NKCC2的表达量分析。
[0050] I. 2. 7 Western blot检测大鼠肾脏髓质AQP2蛋白的表达
[0051] 取肾脏髓质l〇〇mg，剪碎后加入I. 5ml含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液（50mmol/L Tris-HCl，ρΗ7· 4, lOmmol/LEDTA，ρΗ7· 2,1 %去氧胆酸钠，0· 6mmol/L PMSF，4 μ mol/L 亮抑制 肽，lOOkU/L抑肽酶），冰上裂解肾脏髓质10min，lOOOOr/min低温离心15min，取上清装入 EP管中，总蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。取蛋白质样品每份10 μ 1，加等量样本处理液， KKTC煮沸5min，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转到硝酸纤维膜上，然后用含5% 脱脂牛奶的TBS-T封闭2h，加入兔抗鼠 AQP2多克隆抗体（I : 500)孵育，4°C过夜，洗膜液 洗涤剂5min，共3次，加入辣根过氧化物酶（HRP)标记羊抗兔IgG(l : 5000)孵育lh，洗膜 液洗5min，共3次，然后显影并压片曝光，结果用图像分析系统测定蛋白质条带相对吸光度 比值（Α)/β -actin比值。
[0052] 1.3统计学处理
[0053] 实验结果均以均数土标准差（X土s)表示，应用SPSS 11. 5软件包行统计学分析， 组间比较采用方差分析。P < 0. 05为差异有统计学意义，P < 0. 01为差异有非常显著意 义。
[0054] 2 结果
[0055] 2. 1各组大鼠心脏功能的变化（见表1和表2)
[0056] 表1各组大鼠心脏超声心动图变化（X土s)
[0057]
【主权项】
1. 一种中药组合物在制备治疗急性心肌梗死的药物中的应用，所述中药组合物由如下 重量份的原料药制成： 黄芪450g、附子112. 5g、人参225g、丹参225g、葶苈子150g、香加皮180g、泽泻225g、红 花90g、玉竹75g、陈皮75g、桂枝90g， 该药物的制备方法： (1) 将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照上述处方加8倍量70%乙醇回流提取2 次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60°C测定相 对密度为1. 25-1. 30的清膏，备用； (2) 桂枝、陈皮按照比例蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量 水煎煮1小时，滤过，合并水溶液，备用； (3) 附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步 骤（2)中桂枝、陈皮水溶液合并，浓缩至60°C测定相对密度为1. 25-1. 30清膏，搅拌中加入 乙醇，至醇浓度70%，4°C以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60°C测定相对 密度为1. 25-1. 30清膏，与步骤（1)的醇提清膏混合，65-70°C烘干； (4) 干膏混合粉碎成100目粉，加70%乙醇适量制粒，喷入桂枝、陈皮挥发油，混匀，装 胶囊，即得； 其特征在于所述药物具有降低尿渗量的作用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物具有改善心功能的作用。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物具有降低肾脏水通道蛋白2表达的 作用。
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物具有降低血浆血管加压素的作用。
【专利摘要】本发明公开了一种中药组合物在制备治疗急性心肌梗死的药物中的应用。本发明中药组合物由黄芪、人参、丹参等11味中药组成，以益气温阳药为治络强心之本，辅以活血通络药，使气旺血行络通，阻断血瘀络阻。实验研究证实，本发明中药组合物可以显著降低尿渗量，改善心脏功能。
【IPC分类】A61P13-12, A61P9-12, A61P43-00, A61K9-48, A61P9-10, A61K36-8969, A61K35-64
【公开号】CN104666893
【申请号】CN201410775655
【发明人】李向军, 安军永
【申请人】河北以岭医药研究院有限公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2009年6月10日