一种钛表面接枝ε-聚赖氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物材料技术领域，更加具体地说，涉及一种生物纯钛(Ti)表面接枝ε -多聚赖氨酸(ε -PL)的方法，主要应用于抗菌生物材料领域。
【背景技术】
[0002]钛及钛合金材料由于其良好的生物相容性，耐磨性，以及与人骨接近的弹性模量等，被广泛应用于生物医用材料，如血管支架，牙种植体，人工关节等。生物材料相关感染是目前临床种植体最重要的并发症之一，感染一旦发生常常很难治疗从而不得不去除种植体进行二次手术。生物材料相关感染高发有两个主要原因:第一，细菌粘附到种植体表面后会形成菌斑，菌斑里的细菌对宿主免疫力和抗菌治疗有很高的抵抗力很难去除；第二，由于目前种植体的生物活性仍非很理想，种植体与周围骨组织之间有一层无血管的纤维层，导致免疫细胞或通过全身给药的抗生素难以到达种植体表面。因此，具有更好骨传导特性从而能去除无血管纤维层以提高局部抵抗力，同时具有长期抗菌特性以防止菌斑形成的表面涂层非常有必要。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的不足，通过羟基(-0Η)和羧基(-C00H)官能团的偶合，将ε -PL接枝到羟基化的纯钛上，制备出具有抗菌性的涂层，此种制备方法，操作方便，成本低廉，费用低，耗时短，是一种高效经济的制备方法，可以改善钛合金植入器械的抗菌性能。
[0004]本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现:
[0005]一种钛表面接枝ε -聚赖氨酸的方法，按照下述步骤进行:
[0006]步骤I，将金属钛进行表面羟基化，选择将纯钛放入5Μ (moI/DNaOH水溶液中，然后将其放在80°C恒温水浴中进行碱处理工艺，处理时间为6h，将碱处理完的钛片在去离子水中超声处理5min，在空气中干燥；选择将试样命名为T1-OH。
[0007]步骤2，配制4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液，其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为20mM (mmol/L), NaCl为75mM，并利用NaOH水溶液调节pH为7.4，利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液配置ε-聚赖氨酸溶液，所述ε-聚赖氨酸浓度为I 一 10mg/ml，将羟基化的钛片放到该溶液进行接枝，反应时间为24— 40h，取出漂洗干燥，选择将试样命名为T1-ε-PL0
[0008]在进行步骤I羟基化之前，选择钛片经400#、1200#、2500#水砂纸依次打磨至表面光滑，无明显缺陷，将打磨好的试样依次在、无水乙醇、去离子水中超声清洗，室温下干燥。采用ε -聚赖氨的数均分子量为3600— 4500。
[0009]采用VERTEX80傅里叶变换红外仪分析材料表面的官能团组成和键合状况，扫描范围为4000-400CHT1，如附图1所示。相对于Ti, T1-OH的FTIR谱线在1632cm_\3721cm_1两处出现峰位，其中1632cm—1处吸收峰较为尖锐，是羟基(O-H)的伸缩振动特征峰，同时也表明碱处理后，纯钛表面引入了羟基，3721CHT1处吸收峰较宽，是羟基与羟基之间形成的氢键的红外特征峰。在T1- ε -PL的红外谱线中，新出现的1653CHT1峰位是ε -聚赖氨酸的特征峰，为氨基(-NH2)的伸缩振动峰，由于酯类物质的在1300?1050cm-1区域有C-O的特征峰，1059cm-1峰位可能是脱水后形成的C-O的伸缩振动峰。
[0010]细菌粘附实验选取大肠杆菌E.coli (革兰氏阴性)和金黄色葡萄球菌S.aureus(革兰氏阳性)作为模型细菌，分别用T1、T1-0H、T1- ε -PL试样对其的抗粘附作用进行表征。实验所用容器和试样在进行粘附实验之前进行灭菌。所用细菌浓度选为lXlOeCFUml—1，取50 μ I滴在试样上，在37°C下培养6h。取出试样后，用PBS冲洗3次，然后用2.5%戊二醛在4°C下固定lh，最后用依次用30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%的梯度酒精进行脱水处理后在变色硅胶提供的的干燥环境中保存，为SEM测试做准备(采用HITACHIS-4800扫描电子显微镜)。
[0011]图2和图3分别是大肠杆菌E.coli和金黄色葡萄球菌S.aureus在T1、T1-OH,T1- ε -PL表面培养6h后的SEM图片，可以看出，相比于Ti，T1-OH使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的粘附能力均减弱，这是由于碱处理之后，材料表面的亲水性增加，而亲水性是不利于细菌的粘附。T1-ε-PL由于聚赖氨酸的存在，它的抗粘附性是最强的。研究表明ε-聚赖氨酸对革兰式阳性细菌和革兰氏阴性细菌都有比较明显的抑菌活性，分子中的氨基在水溶液中质子化后带正电，而细菌体表面一般是带负电的，所以能够比较容易的附着在菌体表面，进而通过破坏细胞膜结构、抑制呼吸，影响蛋白质合成等作用杀死细菌。
【附图说明】
[0012]图1为本发明中T1、T1-0H、T1-ε-PL的FTIR图谱，其中I代表钛(Ti)试样，2代表轻基化的钛(Ti)试样,3代表接枝ε -聚赖氨酸的钛(Ti)试样。
[0013]图2为大肠杆菌在不同试样培养6h之后的SEM图,其中(a)代表钛(Ti)试样,(b)代表羟基化的钛(Ti)试样T1-OH，(c)代表接枝ε -聚赖氨酸的钛(Ti)试样T1- ε -PL0
[0014]图3为金黄色葡萄球菌在不同试样培养6h之后的SEM图，其中(a)代表钛(Ti)试样，(b)代表羟基化的钛(Ti)试样T1-OH，(c)代表接枝ε -聚赖氨酸的钛(Ti)试样T1-ε-PL0
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。使用材料为1mmX 14mmX Imm的纯钛片(纯度为99.9%)作为试样，无水乙醇(C2H6O,天津市华东试剂厂)，氢氧化钠(NaOH，天津市华东试剂厂)，ε -聚赖氨(ε -Polylysine，天津联星生物试剂公司)，4_羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，天津联星生物试剂公司)，氯化钠(NaCl，天津联星生物试剂公司)，变色硅胶(天津联星生物试剂公司)，磷酸缓冲液(PBS，天津联星生物试剂公司)，戊二醛(C5H8O2,美国 Sigma-aldrich 公司)，梯度酒精(30%，50%, 70%, 80%, 90%, 95%，100%)。抗菌实验中所用细菌为革兰氏阴性大肠杆菌E.coli (天津医科大学提供)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌S.aureus (天津医科大学提供)。培养基为LB培养基，其组成为胰蛋白胨(10g/L)、酵母提取物(5g/L)、氯化钠(NaCl，10/L)，固体培养基则需另加琼脂(15/L)。实验中所涉及的药品均为分析纯级。
[0016]在进行步骤I羟基化之前，选择钛片经400#、1200#、2500#水砂纸依次打磨至表面光滑，无明显缺陷，将打磨好的试样依次在、无水乙醇、去离子水中超声清洗，室温下干燥。
[0017]实施例1
[0018]步骤I，将金属钛进行表面羟基化，选择将纯钛放入5M (mol/UNaOH水溶液中，然后将其放在80°C恒温水浴中进行碱处理工艺，处理时间为6h，将碱处理完的钛片在去离子水中超声处理5min，在空气中干燥；
[0019]步骤2，配制4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液，其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为20mM(mmol/L)，NaCl为75mM，并利用NaOH水溶液调节pH为7.4，利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液配置ε -聚赖氨酸溶液,所述ε -聚赖氨酸浓度为lmg/ml，将羟基化的钛片放到该溶液进行接枝，反应时间为40h,取出漂洗干燥。
[0020]实施例2
[0021]步骤I，将金属钛进行表面羟基化，选择将纯钛放入5M (mol/UNaOH水溶液中，然后将其放在80°C恒温水浴中进行碱处理工艺，处理时间为6h，将碱处理完的钛片在去离子水中超声处理5min，在空气中干燥；
[0022]步骤2，配制4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液，其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为20mM(mmol/L)，NaCl为75mM，并利用NaOH水溶液调节pH为7.4，利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液配置ε-聚赖氨酸溶液，所述ε-聚赖氨酸浓度为10mg/ml，将羟基化的钛片放到该溶液进行接枝，反应时间为24h，取出漂洗干燥。
[0023]实施例3
[0024]步骤I，将金属钛进行表面羟基化，选择将纯钛放入5M (moI/DNaOH水溶液中，然后将其放在80°C恒温水浴中进行碱处理工艺，处理时间为6h，将碱处理完的钛片在去离子水中超声处理5min，在空气中干燥；
[0025]步骤2，配制4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液，其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为20mM(mmol/L)，NaCl为75mM，并利用NaOH水溶液调节pH为7.4，利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液配置ε-聚赖氨酸溶液，所述ε -聚赖氨酸浓度为5mg/ml，将羟基化的钛片放到该溶液进行接枝，反应时间为30h，取出漂洗干燥。
[0026]以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种钛表面接枝ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，按照下述步骤进行: 步骤I，将金属钛进行表面羟基化，选择将纯钛放入5mol/LNaOH水溶液中，然后将其放在80°C恒温水浴中进行碱处理工艺，处理时间为6h，将碱处理完的钛片在去离子水中超声处理5min，在空气中干燥； 步骤2，配制4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液，其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为20mmol/L, NaCl浓度为75mmol/L，并利用NaOH水溶液调节pH为7.4，利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液配置ε -聚赖氨酸溶液，将羟基化的钛片放到该溶液进行接枝，取出漂洗干燥，所述ε -聚赖氨的数均分子量为3600— 4500。
2.根据权利要求1所述的一种钛表面接枝聚赖氨酸的方法，其特征在于，在所述步骤2中，利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲水溶液配置的ε -聚赖氨酸溶液的浓度为I一1mg/ml，将羟基化的钛片放到该溶液进行接枝反应时间为24— 40h。
3.根据权利要求1所述的一种钛表面接枝聚赖氨酸的方法，其特征在于，在进行步骤I羟基化之前，选择钛片经400#、1200#、2500#水砂纸依次打磨至表面光滑，无明显缺陷，将打磨好的试样依次在、无水乙醇、去离子水中超声清洗，室温下干燥。
4.如权利要求1一3之一所述的一种钛表面接枝ε-聚赖氨酸的方法在抗菌中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
【专利摘要】本发明公开了一种钛表面接枝ε-聚赖氨酸的方法，通过羟基和羧基官能团的偶合，将ε-聚赖氨酸接枝到羟基化的纯钛上，制备出具有抗菌性的涂层，此种制备方法，操作方便，成本低廉，费用低，耗时短，是一种高效经济的制备方法,可以改善钛合金植入器械的抗菌性能。
【IPC分类】A61L27-54, A61L27-34, C23C22-68, A61L31-16, A61L27-06, A61L31-10, A61L31-02
【公开号】CN104667347
【申请号】CN201310636438
【发明人】王志鸿, 杨贤金, 崔振铎, 朱胜利, 李朝阳, 梁砚琴
【申请人】天津大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年12月2日