血管生成素样4及其用于伤口愈合的方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求2012年7月19日提交的美国临时专利申请61/673, 463的优先权的 利益，为了所有目的其内容在此通过引用以其整体合并于此。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于伤口愈合的组合物和伤口愈合治疗的方法。
【背景技术】
[0004] II型糖尿病是一种医疗的威胁，其影响约2亿人，并因其视网膜病变、心血管疾病 和糖尿病肾病的发病率而继续在世界范围内对医疗保健资源产生日益加重的负担。受损 的伤口修复代表了当今世界上最显著的未满足的医疗需求之一，并且是糖尿病的主要并发 症，导致显著的发病率、生产力损失和医疗保健支出。此外，愈合不良的糖尿病性伤口为感 染打开门户，常引起慢性炎症、败血症、开裂和死亡。尽管这些慢性伤口具有巨大的影响，但 一直缺乏有效疗法。为了有效解决这些问题，我们必须了解愈合过程，并创造有利于愈合的 有益健康的物理和生化环境。
[0005] 正常伤口愈合通过一系列连续的事件进行，所述事件包括急性炎症、增殖和成熟 阶段3,4。这些事件牵涉结缔组织的形成、细胞活性和生长因子激活之间的复杂相互作用。所 有这三个生理过程在在糖尿病状态 5'6下被改变。胞外基质（ECM)成分对于伤口愈合的每个 阶段都是不可或缺，其以动态交互的方式与细胞和生长因子相互作用，最终导致创面闭合。
[0006] 慢性伤口例如静脉曲张性溃疡、糖尿病性溃疡或褥疮，代表了当今世界上最显著 的未满足的医疗需求之一，是糖尿病的主要并发症，导致显著的发病率，生产力损失和医疗 保健支出。糖尿病足溃疡是发病的一个显著原因，并且是为糖尿病患者入院的最常见的原 因。大约15%的糖尿病患者将在他们的一生中发展出慢性溃疡。在那些需要下肢截肢的患 者中，70-90%之前患有足溃疡 2。
[0007] 糖尿病性伤口的特征在于失活组织的积累，增加的/长时间的炎症，与不良伤口 相关的血管生成和ECM组分的不足6,7。糖尿病患者的伤口显示升高水平的基质金属蛋白 酶（MMP)、增加的ECM组分的蛋白降解，在损坏的ECM中积累的生长因子的失活（其不能支 持愈合） 5,8。异常的一氧化氮（NO)产生也促成了受损的愈合的发病机制。细胞，如角质形 成细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，同时显示表达和对许多生长因子和细胞因子的响应的功 能失调。因此，这些伤口通常对大多数治疗是非响应性的。由于这些原因，可能最有利的是 利用可在糖尿病性伤口中恢复损坏的细胞外微环境的侵袭性策略进行干预。替换丢失或功 能失调的ECM组分的伤口愈合策略可以是有益的。理想的是，这样的替换应该是多方面的 和交互性的，并且非常接近正常ECM的组分。在这个方面，细胞基质蛋白（matricellular protein)在伤口愈合中的作用引人关注。细胞基质蛋白可与胞外基质储库中的各种各样 的蛋白质结合，将它们与它们的同源细胞表面受体桥接 9_n。他们在伤口愈合过程中依时空 表达，并且保留住在细胞-基质通信的交叉路口，用作若干调控网络的调制剂。据推测，调 控途径由复杂网络组成，这使得很难设计用于伤口修复所需的补偿性调整。可能最有利的 是干预侵袭性的治疗方法是利用替换丢失的或功能失调的胞外基质（ECM)组分的侵袭性 愈合策略进行干预。理想的是，这样的替换应该是多方面的和互动性的，并且非常接近正常 ECM的组分，从而导致加速的创面闭合，以最低限度形成疤痕。因此，虽然靶向或替换必需细 胞基质蛋白可能比单独的细胞因子介导的候选者更有效，但难以知道从哪开始，或什么样 的策略可能会成功。
[0008] 为了有效地解决这些问题，我们必须了解愈合过程，创造有利于愈合的有益健康 的物理和生化环境。这些非愈合伤口一直是过去15年中广泛研宄的主题。许多努力集中 在重组生长因子。鉴于表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子（PDGF) 以及转化生长因子β家族的成员的靶是参与皮肤伤口修复过程的细胞，因此合乎逻辑地 首次使用该模型涉足涉及这些生长因子的临床研宄。有一个明显的例外（PDGF-BB或贝 卡普勒明），这种药物的开发工作因为几个原因可以说是失败的（Pierce&Mustoe 1995)， 其中最明显的原因是这些生长因子通常针对向伤口愈合所必需的单个生物过程。迄今天 为止，被美国食品和药物管理局批准的用于治疗糖尿病性足溃疡的唯一生长因子是重组 TOGF-BB (贝卡普勒明），其被配制在局部乳膏中。已知TOGF-B是间质细胞的有效促细胞分 裂剂和趋化剂，并且可用于通过刺激血管生成来增加创伤血管形成。因此目前迫切需要更 好的、新的或辅助性治疗。
[0009] 血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)是主要在肝中表达的分泌蛋白，已证明其通过抑 制富含甘油三酯的脂蛋白的脂解来调节甘油三酯代谢。实验结果表明，ANGPTL4在不同的 营养状态过程中调节循环甘油三酯水平，从而在喂食/禁食过程中通过脂蛋白脂酶（LPL) 的差异抑制来在脂质代谢中起作用。已显示促血管生成素样蛋白的N-末端结构域在脂质 代谢中发挥积极作用。通过使用缺失突变体，证明了包含片段-(17-207个）的N端结构 域而非包含片段-(207-460)的C末端血纤蛋白原样结构域升高小鼠的血浆甘油三酯水平： ANGPTL4已被鉴定为脂质代谢的新型旁分泌和可能地内分泌调节剂，以及过氧化物酶体增 殖物激活受体（PPAR)的靶标。其在许多细胞类型例如脂肪细胞和肝细胞中表达，并且在禁 食和缺氧后被上调。重要的是，ANGPTL4经历蛋白水解加工以释放其C-末端的血纤蛋白原 样结构域（CANGPTL4)，其作为单体循环，然而其功能还不清楚。ANGPTL4的N-末端卷曲螺 旋结构域（HANGPTL4)介导ANGPTL4的寡聚化并结合至脂蛋白脂酶以调节脂蛋白代谢，从而 介导寡聚化和脂蛋白代谢。与此相反，CANGPTL4以单体形式存在，然而其功能仍然未知。已 显示ANGPTL4在血管生成和血管通透性 1H5中起着背景依赖性作用。ANGPTL4最近被鉴定 为牵涉能量代谢和伤口愈合12的调节的细胞基质蛋白。小鼠（ANGPTL47+)中ANGPTL4的 缺乏导致延迟的伤口再上皮化，减少基质蛋白表达，增加炎症和受损的伤口相关血管生成 16>17。然而，ANGPTL4的表达和在慢性伤口修复例如糖尿病性伤口修复中的作用仍然不清楚。
【发明内容】
[0010] 因此，本发明的第一方面包括用于增进有此需要的个体的伤口愈合的方法，所述 方法包括施用血管生成素样4 (ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段。
[0011] 本发明的另一个方面包括用于增进个体的伤口愈合的药物组合物，其包含血管生 成素样4 (ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段；和药学上可接受的载体。
[0012] 本发明的另一个方面包括确定伤口部位是否将变成慢性缓慢愈合伤口的方法，包 括以下步骤：(a)测定存在于获自伤口部位的样品中的血管生成素样4蛋白（ANGPTL4)的 水平，（b)将样品的血管生成素样4蛋白（ANGPTL4)的水平与来自健康个体（具有正常伤 口愈合）的对照相比较，其中相较于对照，样品中降低的水平的ANGPLT4表明伤口部位将变 成慢性缓慢愈合伤口。
[0013] 通过参考以下附图和各种非限定性实施方式的描述，本发明的其它方面对于本领 域普通技术人员来说是显而易见的。
【附图说明】
[0014] 附图不必按比例绘制，而是通常将重点放在举例说明各种实施方式的原理上。在 下列说明中，本发明的各种实施方式参考下列附图来进行描述。
[0015] 图1.伤口愈合在糖尿病（ob/ob)小鼠中被延迟。
[0016] (A)在创伤后第1、3、5、7和10天获自的正常（ob/+)和糖尿病（ob/ob)伤口活检 组织的代表性图像。比例尺：5_。
[0017] ⑶ob/+和ob/ob小鼠的创面闭合动力学。将伤口表面积以占第0天（=100%) 的伤口表面积的百分比作图。数据为平均值土SEM，η = 10。
[0018] (C)通过qPCR测定的在指定的创伤后天数上的ob/+和ob/ob伤口活检组织中的 ANGPTL4的相对mRNA表达。核糖体蛋白L27用作参照管家基因。数据为以一式三份进行的 3个独立研宄的平均值土SEM。
[0019] (D)来自ob/+和ob/ob伤口活检组织的CANGPTL4的免疫印迹分析。β微管蛋白 用作上样和转移对照。示图显示在指定的创伤后天数上来自Ob/+和ob/ob伤口活检组织 的CANGPTL4的相对蛋白质表达水平。使用imagej软件测定蛋白质条带的光密度值。数据 为3个独立伤口研宄的平均值土SEM。
[0020] (E) ob/+和ob/ob伤口活检组织的ANGPTL4 (红色）的免疫荧光染色。利用DAPI (蓝 色）对切片进行复染。点线描绘表皮与真皮的界面，比例尺：40 μ m，使用Mann-Whitney检 验：*ρ〈0· 05 ;**p〈0. 01 和 ***ρ〈0· 001。
[0021] 图2. ANGPTL4的局部施用改善糖尿病性伤口愈合。
[0022] ⑷利用单份剂量的盐水或1%羧甲基纤维素中的cANGPTL4(50 μ g)处理的糖尿 病ob/ob伤口的创面闭合动力学。将伤口表面积以占第0天（=100% )的伤口表面积的 百分比作图。数据为平均值土SEM，η = 10。使用Mann-Whitney检验：**p〈0. 01和***p 0.0 Olo
[0023] (B)显示ob/+、盐水和CANGPTL4处理的ob/ob伤口的基因表达谱的热图。按照它 们的生物学基因功能：增殖、血管生成、迀移、ECM、细胞凋亡和炎症对基因进行分选和聚类。 从蓝色至红色的有色光谱描述从-1. 0至1. 0的Log-倍数变化。
[0024] (C)比较来自ob/+ (蓝色）、盐水处理（红色）和CANGPTL4处理的ob/ob (黑色） 的基因的总数的维恩图。
[0025] (D)在创伤后不同的天数上的来自ob/+、盐水和cANGPTL4处理的ob/ob伤口愈合 的指定的蛋白质的代表性免疫印迹。β微管蛋白用途上样和转移对照。
[0026] (E)示图显示在指定的创伤后天数上的来自ob/+、盐水和CANGPTL4处理的ob/ob 伤口活检组织的指定的蛋白质的相对表达水平。使用imagej软件测定蛋白质条带的光密 度值。数据为3个独立研宄的平均值土SEM。*ρ〈0· 05 ;#ρ〈0· 01，*#ρ〈0· 001。
[0027] (F) ob/+、盐水和CANGPTL4处理的ob/ob伤口活检组织的CD31 (褐色）和Ki67 (绿 色）的免疫组织化学和免疫荧光染色。点线描绘表皮与真皮之间的界面，比例尺：40μπι。
[0028] 图3. ANGPTL4调节ob/ob小鼠中的NO产量。
[0029] (A)通过DAF-FM双乙酸盐荧光测定的在指定的创伤后天数上的ob/+、盐水和 CANGPTL4处理的ob/ob的一氧化氮产量（任意单位，AU)。将值针对利用通过UV280nm分 光光度法测量的总蛋白质浓度进行标准化。数据为3个独立实验的平均值土SEM，n = 10。
[0030] (B-C)显示通过qPCR测量的在指定的创伤后天数上的ob/+、盐水和CANGPTL4处 理的伤口活检组织的eN0S(B，左图框）和iN0S(C，左图框）的相对mRNA表达水平。核糖体 蛋白L27用作参照管家基因。示图显示在用CANGPTL4处理后相较于同种未处理的对照原 代人成纤维细胞中的iNOS (B，右图框）和原代人真皮微血