管内皮细胞中的eNOS (C，右图框） 的相对mRNA水平。数据为以一式三份进行的3个独立研宄的平均值土SEM，林p〈0. 01。
[0031] (D)在创伤活组织检查后第7天，盐水和CANGPTL4处理的ob/ob伤口活检组织上 的iNOS (红色）的免疫荧光染色。用DAPI对细胞核（蓝色）进行复染。点线描绘表面与 真皮之间的界面，比例尺：50 μ m。WB :仓Il面。
[0032] 图 4.ANGPTL4 调节 iNOS 表达。
[0033] (A)在伤口活组织检查后第7天，ob/+、盐和CANGPTL4处理的ob/ob上的 pSTAT3 (Y705)(绿色）、pSTATl (Y701)(红色）和pNF κ B (S276)(绿色）的代表性免疫荧光 染色。利用DAPI对细胞核进行复染（白色）。点线描绘表皮与真皮之间的界面，比例尺： 40 μ m。WB :创面。
[0034] ⑶在伤□活组织检查的第7天，使用免疫前IgG或针对pSTAT3 (Y705)、 口5丁41'1(￥701)和口即1〇8(5276)的抗体在盐水处理的出）和〇4如?114处理的〇13/(*(1')中 进行ChIP测定。使用适当的引物（表SI)扩增小鼠 iNOS基因的横跨启动子结合位点的区 域。结合位点上游的对照区域用作阴性对照。
[0035] (C)在指定的CANGPTL4处理后时间上的人皮肤成纤维细胞中的ID3的CANGPTL4 相对mRNA表达。核糖体蛋白L27用作参照管家基因。数据为3个独立实验的平均值土 SEM。
[0036] (D)在放线菌素 D (10 μ g/ μ 1)存在的情况下CANGPTL4处理的或盐水（媒介物） 处理的人皮肤成纤维细胞中ID3 mRNA的相对稳定性。核糖体蛋白18S用作参照管家基因。 通过qPCR测定ID3的相对mRNA表达水平，将其针对18S值进行标准化，以占时间0时的值 的百分比作图。使用Orgin Pro 8.1通过线性回归分析计算每一种mRNA的半衰期。数据 为3个独立实验的平均值土 SEM。
[0037] 图5. ANGPTL4减少ob/ob伤口中的胶原瘢痕组织。
[0038] (A)来自盐水和CANGPTL4处理的ob/ob的指定的伤口组织的羟脯氨酸含量。从羟 脯氨酸标准曲线测定羟脯氨酸的总量（mg)，用通过UV 280nm分光光度法测量的总蛋白质 浓度对其进行标准化。数据为平均值土 SEM，η = 3***p〈0. 001。
[0039] (B)来自盐水和CANGPTL4-处理的ob/ob伤口的第10天伤口切片的代表性Van Gieson染色。胶原被染成红色，肌肉或血纤蛋白被染成黄色，细胞核被染成黑色。
[0040] (C)来自盐水处理的、CANGPTL4处理的以及CANGPTL4和氨基胍一起处理的ob/ob 伤口的第10天伤口切片的Masson三色染色。胶原纤维被染成蓝色，细胞质被染成红色，细 胞核被染成黑色。
[0041] (D)来自创伤后第10天的盐水和CANGPTL4-处理的ob/ob伤口的创面区域附近的 结缔组织的代表性扫描电子（SEM，最上方和中间的图框）和透射电子显微镜（TEM，最下方 的图框）图像。将来自对应伤口活检组织的胶原纤维尺寸的横切面图像进行TEM成像。比 例尺：最上方的图框，50 μπι ;中间图框，5 μπι和最下方图框，50nm。
[0042] 图6.伤口切片的苏木精伊红（H&E)染色。
[0043] (A)在指定的创伤后天数上的来自ob/+和ob/ob小鼠的创面切片的代表性苏木精 伊红（H&E)染色。WB，创面。箭头表示伤口边缘。点线描绘表皮与真皮之间的界面。比例 尺：100 μ m〇
[0044] (B)H&E染色的伤口切片（左图框）的图示（右图框）。将上皮细胞间隙（a)测量 为向内生长的上皮的两个边缘之间的再上皮形成间隔的距离。通过舌上皮内的上皮面积测 量表皮伤口面积（b)。
[0045] (C)ob/+和ob/ob伤口中活检组织切片的表皮伤口面积。对于每一个指定的时间 点，所有测量使用Adobe Photoshop CS5. 1从3个随机切片进行3次。使用比例尺将像素 针对μ m进行标准化。数据为平均值土 SEM，n-9 (*p〈0. 05)。
[0046] 图7.在糖尿病ob/ob小鼠的全厚夹板伤口上局部施用重组ANGPTL4。
[0047] (A)举例说明糖尿病小鼠的背部皮肤上全厚切开夹板伤口的位置和尺寸。对每一 只小鼠进行CANGPTL4和对照盐水的局部施用。旋转施用部位以避免部位偏倚性。蓝色点 线描绘中央切开的伤口组织。
[0048] (B)在创伤后第3、5、7和10天拍摄的盐水和CANGPTL4-处理的ob/ob伤口活检组 织的照片。比例尺：5mm〇
[0049] (C)来自盐水和CANGPTL4-处理的ob/ob小鼠伤口活检组织的代表性H&E染色。 红色箭头表示伤口边缘。点线描绘表皮与真皮之间的界面。比例尺：1〇〇μπι。WB，创面。
[0050] 图8.利用ANGPTL4处理的或未利用其处理的伤口听一氧化氮和iNOS水平。
[0051] ㈧利用检测一氧化氮的DAF-FM双乙酸盐（绿色）染色的伤口活检组织的代表性 荧光图像。伤口切片来自〇b/+、盐水和CANGPTL4-处理的ob/ob的创伤后第7天的活检组 织。点线描绘表皮与真皮之间的界面。比例尺：50μπι。WB，创面。
[0052] (B)来自如（A)中描述染色的伤口切片的DAF-FM双乙酸盐的平均荧光强度。从 每一个组织的至少3个活检组织和3个显微镜视野计算平均荧光强度值（任意单位，AU， 土SEM)。*ρ〈0·05，**ρ〈0·01。
[0053] (C)创伤后第7天的ob/+、盐水和CANGPTL4-处理的ob/ob伤口活检组织的代表 性免疫荧光染色iNOS (绿色）。细胞核用DAPI (蓝色）进行复染。点线描绘表皮和真皮之 间的界面。比例尺：50 μπι。
[0054] 图9.氨基胍对ANGPTL4介导的伤口愈合的作用。
[0055] (A)来自2只小鼠的盐水、CANGPTL4-处理的ob/ob以及CANGPTL4和氨基胍（AG) 处理的ob/ob伤口的照片。在创伤后第7天拍摄图像。比例尺：5mm。
[0056] (B)来自创伤后第7天盐水、CANGPTL4以及CANGPTL4和AG -起处理的ob/ob伤 口的伤口切片的代表性苏木精伊红（H&E)图像。比例尺：500 μm。箭头指向上皮伤口边缘。
【具体实施方式】
[0057] 我们显示了 ANGPTL4,特别地C末端血纤蛋白原样结构域（CANGPTL4)的局部施用 加速了糖尿病小鼠的夹板伤口模型的创面闭合，并在斜面使命的重塑阶段减少胶原沉积即 瘢痕形成。CANGPTL4为细胞基质蛋白，从而其可在伤口愈合过程中调节许多关键调控网络。 因此，细胞基质蛋白ANGPTL4比单个细胞因子介导的候选更有效。
[0058] 因此，本发明的第一方面包括用于增进有此需要的个体的伤口愈合的方法，所述 方法包括施用血管生成素样4 (ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段。
[0059] 血管生成素样4 (ANGPTL4)多肽的多肽优选具有约406个氨基酸，编码具有许多活 性，例如与创面中的特定基质蛋白相互作用，延迟其被基质金属蛋白酶蛋白水解降解的酶， 并通过改变完整基质蛋白的可用性直接影响细胞-基质通信的交叉对话。ANGPTL允许各种 细胞例如伤口角质形成细胞、皮肤成纤维细胞、内皮细胞或炎症细胞与周围ECM的。我们还 显示，ANGPTL4减少朝向伤口愈合的后期阶段的胶原沉积。
[0060] 优选地，血管生成素样4 (ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段包含；（i) SEQ ID NO: 1 中所示的氨基酸序列：或（ii)在整个长度上与SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列具有至少 60,至少70,至少80,至少85,至少90,至少95,至少97,至少98或至少99%的序列一致性 的氨基酸序列：升在其整个长度；或（iii)在其整个长度上与SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸 序列具有至少70,至少80,至少85,至少90,至少95,至少97,至少98或至少99的序列同 源性的氨基酸序列；或（iv) (i)至（iii)中任一项的片段。
[0061] 优选地治疗活性片段包含血管生成素样4 (ANGPTL4)多肽的C末端区域或其功能 性片段。在各种不同的实施方式中，片段包含：（i)SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列；或 (ii)在其整个长度上与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少60%、至少70%、至少 80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98或至少99 %的序列一致性的氨基 酸序列；和（iii)在其整个长度上与SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列具有至少70%、至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98或至少99的序列同源性的氨 基酸序列。
[0062] ANGPTL4(cANGPTL4)的C末端血纤蛋白原样结构域的功能性结构域包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或其等位变体、同源物或片段的氨基酸186至406或由所述氨基酸 组成。CANGPTL4结构域优选包含SEQ ID NO. 2或与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有同 源性的序列。
[0063] 术语"多肽"指的是氨基酸和其等同物的聚合物，并且不指特定长度的产物；因此， 肽、寡肽和蛋白质均包括在多肽的定义内。该术语也不指或不包括多肽的修饰，例如，糖基 化、乙酰化、磷酸化等。包括在该定义内的是例如含有氨基酸（包括例如，天然氨基酸等） 的一种或多种类似物的多肽，天然和非天然存在的具有取代键以及本领域中已知的其他修 饰的多肽。
[0064] 术语"伤口"是指其中皮肤的真皮被破坏从而在动物的皮肤中形成撕裂、切割、穿 刺、切口、撕裂、擦伤、裂开、刀痕、划痕、裂缝或破裂的一类伤口。这样的伤口可以包括溃疡 例如静脉曲张性溃疡、压迫性溃疡或糖尿病足。糖尿病足是指可能患有糖尿病的个体的下 肢上的慢性缓慢愈合伤面。在各种不同的实施方式中，伤口选自溃疡、慢性缓慢愈合伤口和 开放性伤口。
[0065] 增进伤口愈合是指减小伤口表面积的大小，优选直至真皮几乎或完全覆盖区域， 基本上愈合伤口。伤口愈合可被测量为伤口表面积相对于施用组合物或本文中描述的组合 物时初始表面积的减少的百分比。"治疗"和"医治"和其同义词是指其中通过在最短时间内 减小伤口表面积的尺寸来使对象加速（增进）伤口愈合的治疗性治疗。增进伤口愈合可包 括减少伤口部位的胶原蛋白的量，减少可见瘢痕形成或增加的一氧化氮合酶（iNOS)表达。 治疗可包括手术时患者的预防性被动治疗。需要这种治疗的那些对象包括具有伤口例如切 口、溃疡或皮肤的破坏或糖尿病个体中常见的慢性缓慢愈合伤口的对象。个体是指动物，例 如哺乳动物，优选人。在各种不同的实施方式中，个体具有糖尿病。
[0066] 在各种不同的实施方式中，本发明的方法还可包括执行辅助治疗的步骤。辅助治 疗可包括清创治疗如使用木瓜蛋白酶或本领域中已知的其他清创剂。辅助治疗可包括细胞 因子治疗。辅助治疗可包括高压氧治疗。类似地，辅助治疗可以包括敷料选择和糖尿病鞋 或本领域中已知的任何其它治疗。
[0067] 优选地，血管生成素样4 (ANGPTL4)多肽包含；（i) SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序 列：或（ii)