松、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、二丙酸氯地米松、曲安 西龙和其混合物。 实施例
[0093] 实施例1. As2O3的MH7A细胞增殖抑制作用 材料和方法： 成纤维细胞样滑膜细胞MH7A细胞系 MH7A 购自 Riken BioResource Center (Tsukuba, Japan)。细胞在 37°C、5 % C02 下 维持在补充有10%热灭活的胎儿牛血清（FBS;Invitrogen)的RPMI1640 (Invitrogen， Carlsbad，CA，USA)中。
[0094] 试剂和抗体 试剂包括 As2O3和二甲基亚砜（DMSO) (Sigma, St. Louis, M0，USA)、氯化铵（NH4C1) (Amresco, Solon, OH, USA)、蛋白酶体抑制物MG115、pan-胱天蛋白酶抑制物Z-VAD-FMK、 JNK抑制物SP600125和它的阴性对照（Merck, Darmtadt, Germany)和重组人类IL-6 (P印rotech，Rocky Hill, NJ，USA)。初级抗体包括兔抗 IL-6 受体 a (IL-6Ra)和 gpl30 (C-20)抗体（Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA，USA)、兔-IL-6 抗 体(]^1^1〇、兔抗-磷酸化的见1((1111'183/^1'185)、抗-胱天蛋白酶3、抗-0-肌动蛋白和抗 NFkB 抗体（Cell SignalingTechnology, Beverly, MA, USA)，以及小鼠抗-遍在蛋白抗 体FKl和FK2 (Biomol, PlymouthMeeting, PA, USA)。次级抗体包括辣根过氧化物轭合 的山羊抗-兔IgG和兔抗-小鼠IgG (Invitrogen)。
[0095] MTT分析 通过MTT分析评估细胞增殖（GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)(Cheung et al·， Zeii.，246:122-8(2007))。细胞（96孔平板中2X IO4个细胞/反应孔)孵育过夜， 之后用对照或试剂处理2-6天。处理的细胞然后与MTT标记溶液（10 μ L/反应孔）孵育。 在4小时孵育之后，裂解细胞，在37°C下formazan晶体溶解过夜。在570 nm ( μ-quant? 微板光谱仪，Bio-Tek Instruments Inc.，VT, USA)检测Formazean信号。获得的数据 通过 KC junior 软件（BLD Science, Garner, NC, USA)分析。
[0096] Western 印迹分析 进行 Western 印迹分析（Pang et al·，fesiroefliero/ogT'，132:1088-103 (2007))〇 细胞裂解和蛋白质采集根据标准方案进行。蛋白质样品（一般30 μ g)通过十二烷基硫 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)在12%分辨凝胶中分离，电转移到硝化纤维膜上 (400 mA 2小时)。在用含有5%无脂奶的Tris-缓冲盐水-TWEEN (TBS-T)在室温下阻断 30分钟之后，膜与初级抗体和具有5%牛血清白蛋白的TBS-T在4°C孵育过夜。膜然后用 TBS-T洗绦三次，在室温下与1:2000辣根过氧化酶轭合的次级抗体（Amersham-Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA)孵育 1 小时。免疫反应性条带使用 SuperSignal West Pico化学发光底物（Pierce Chemical Co.，Rockford, IL, USA)用化学发光来检测， 显现在X射线底片上。条带信号的密度定量使用ImageJ I. 36b软件（National Institutes of Health, USA)进行。所有实验一式三份进行。
[0097] 膜联蛋白V细胞凋亡分析 对于细胞凋亡分析，I X IO6个细胞在10-cm平板中孵育过夜，之后用对照或试剂处理 24小时。细胞然后胰蛋白酶化，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS)洗涤两次，重悬浮在500 UL结合缓冲液中，在冰上与FITC轭合的膜联蛋白-V和碘化丙锭（PI) (Immunotech ; Fullerton，CA, USA)孵育10分钟。细胞凋亡的细胞(膜联蛋白-V-阳性，PI-阴性）在合 适的补色下通过流式细胞术（Epics, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) -式三份 地计数。数据分析通过 WinMDI 2.8 软件（The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA)进行。
[0098] 结果: As2O3诱导了 MH7A细胞的剂量和时间依赖性抑制作用（附图1A)，50%抑制浓度是约5 μ M。流式细胞计分析确认了，细胞生长的抑制作用是由细胞凋亡的诱导所介导的。MH7A细 胞与As2O 3 (5 μΜ)孵育0-24小时，用碘化丙锭（PI)和膜联蛋白-V染色以区分细胞凋亡 的细胞和死亡的细胞。在代表性的分析中，13%的对照细胞是膜联蛋白-V阳性、碘化丙锭 阴性的(细胞凋亡的)，2. 36%是膜联蛋白-V阳性、碘化丙锭阳性的(死亡的)，而38. 2%的处 理的细胞是膜联蛋白-V阳性、碘化丙锭阴性的(细胞凋亡的)，5. 76%是膜联蛋白-V阳性、碘 化丙锭阳性的(死亡的)。FACS分析的结果显示了在As2O3处理之后细胞凋亡细胞的提高。
[0099] Western印迹分析显示了，As2O3诱导了胱天蛋白酶3的剂量和时间依赖性的活化。 胱天蛋白酶3被胱天蛋白酶抑制物Z-VAD-FMK (25 μM)的抑制显著地降低了，但是不能完 全地改善As2O3的细胞毒性效应（附图1Β)。结果意味着，ΜΗ7Α中As 2O3诱导的细胞毒性同 时涉及胱天蛋白酶依赖性和胱天蛋白酶独立性的途径。
[0100] 实施例2. IL-6中和抗体的MH7A细胞增殖抑制作用 材料和方法: 逆稼灵袭合靡靈式反应6?/1-/??*总RNA使用TRIzol (Invitrogen)制备。进行逆转 录 PCR (RT-PCR) (Cheung, et al·，246:122-8 (2007))。根据厂家的说 明书，用Superscript? III第一链合成系统（Invitrogen)逆转录RNA。反应混合物含有 1.2 yL 的 cDNA、18 yL 的Platinum? PCR Supermix (Invitrogen)和 200 nM 每对引物。 对于每组引物，退火温度和进行的扩增循环数在下表中列出。
[0101] 表1. RT-PCR的引物和条件。
【主权项】
1. 一种治疗或预防类风湿性关节炎和其他炎症性关节炎的一种或更多种症状的方 法，包括向需要它的受试者以有效量施用包含三氧化二砷的组合物，来降低或治疗类风湿 性关节炎的一种或更多种症状。
2. -种降低或抑制滑膜细胞的增殖或促进滑膜细胞的细胞凋亡的方法，包括使滑膜细 胞与有效地降低或抑制它们的增殖或促进它们的细胞凋亡的量的三氧化二砷接触。
3. -种降低细胞中IL-6受体的细胞表面表达的方法，包括使所述细胞与通过将IL-6 受体靶向溶酶体而有效地促进IL-6受体降解的量的三氧化二砷接触。
4. 一种用于治疗受试者中类风湿性关节炎或其他炎症性关节炎的一种或更多种症状 的药物组合物，包括抑制滑膜细胞的增殖或促进滑膜细胞的细胞凋亡的有效量的三氧化二 砷，以及任选地，药学上可接受的赋形剂。
5. 权利要求4的任一项的药物组合物，其中所述三氧化二砷以1到10 mg的量存在。
6. 权利要求5的任一项的药物组合物，其中所述三氧化二砷以5到10 mg的量存在。
7. 三氧化二砷在制备用于治疗或预防类风湿性关节炎和其他炎症性关节炎的一种或 更多种症状的药物中的用途。
8. 三氧化二砷在制备用于降低或抑制滑膜细胞的增殖或促进滑膜细胞的细胞凋亡的 药物中的用途。
9. 三氧化二砷在制备用于降低细胞中IL-6受体的细胞表面表达的药物中的用途。
10. 权利要求9的用途，其中所述IL-6受体在滑膜细胞中表达。
【专利摘要】治疗或预防类风湿性关节炎或其他类型的炎症性关节炎的一种或更多种症状的方法，涉及向受影响的患者施用含有有效量三氧化二砷的组合物。包含三氧化二砷的组合物可以口服地施用，例如，作为溶液、悬浮液、糖浆、乳剂、片剂或胶囊剂。
【IPC分类】A61P19-02, A61P29-00, A61K33-36
【公开号】CN104825487
【申请号】CN201510114235
【发明人】邝沃林
【申请人】香港大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2010年5月17日
【公告号】CN102427822A, EP2432480A1, EP2432480A4, US20100291234, WO2010133087A1