一种戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疏水性病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用，特别涉及一种戊型肝 炎病毒样颗粒疫苗的制备方法及其应用，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV)是肝炎病毒科肝病毒属成员之一，含一 正向单链RNA，基因组有3个重叠开放阅读框架（ORFs)，包括01^1、01^2、01^3。病毒分为4 种基因型，基因 I型和基因 II型病毒主要从人体分离，基因 III型、基因 IV型病毒主要来 源于猪、鸡、兔、犬等动物，甚至有基因 V型病毒发现。基因 I型病毒主要在中国以及东南亚 流行，HEV是急性肝炎的主要病原，引起中度、严重肝炎，严重程度随年龄增加。
[0003] HEV在许多发展中国家流行，特别是南亚、东南亚、北非、中东地区，流行病学调查 全球有1/3人感染。HEV通过饮用污染水源的粪口途径传播。普通人感染的死亡率1-15%， 但对怀孕妇女引起致死急性感染，死亡率高达30%，感染存活的怀孕妇女发生高概率流产、 早产。对慢性肝炎病人，HEV二次感染导致严重后果。所以HEV是严重威胁公共卫生的疾 病，快速的诊断和预防HEV是非常有必要的。
[0004] 人的戊型肝炎尽管在普通人群中发病率小于1%，但在发展中国家或卫生条件不 好的地区，因为污染的水源大规模急性戊型肝炎经常发生，发达国家也有食品污染散发流 行。截至目前，已经鉴定和确定4个基因型HEV病毒，基因 I型、基因 II型病毒只在人群传 播，而基因 III型、基因 IV型病毒在动物之间传播，甚至发现了在野猪和大鼠中流行基因 V 型、基因 VI型戊型肝炎病毒。所有已经辨明的猪戊型肝炎病毒属于基因 III型或基因 IV 型病毒，可跨种属间的屏障传播，其他动物犬、兔的HEV也能感染猪。人的动物源性戊型肝 炎病毒感染经常多发生于消费了污染的猪肝、猪肉、鹿肉或其他污染传染性HEV的肉制品 或水。
[0005] 鸡戊型肝炎病毒引起肝炎脾肿大综合症（hepatitis splenomegaly syndrome (HS syndrome))，引起30-72周的蛋鸡卵巢萎缩，肝脾肿大、腹腔大量红色积液。禽HEV的基因 组基因测序显示禽HEV基因组结构和哺乳动物相似，核苷酸序列有50%的同源性，与人HEV 和猪HEV基因结构和功能相似。禽HEV的衣壳蛋白和哺乳动物有共同的抗原性和抗原表位。 美州的禽HEV、欧洲禽HEV、东南亚分离的禽HEV的核苷酸同源性达80 %，应属于肝炎病毒不 同的属，其他人、猪、犬HEV为肝炎病毒科不同肝炎病毒属。
[0006] 60周龄的SPF鸡静脉注射5X 104 5 50 %禽感染剂量，引起HS综合症，有淋巴 细胞lymphocytic periphlebitis和phlebitis为特征的肝损伤，约有25 %感染的鸡 有subcapsular出血或肝右中叶肥大现象，衆肝酶乳糖脱氢酶轻微上升（the plasma liverenzyme lactate dehydrogenase)。禽HEV的致病性的发现给HEV致病和免疫的研宄 提供了小个体动物模型，同时也为HEV疫苗的评估和研宄提供了平台，特别是疫苗对HS综 合症的防控效果。
[0007] 一般地，健康鸡感染HEV有抗体产生，显示为亚临床症状。从HS的鸡和健康鸡的 分离的病毒核苷酸的同源性为91%，其致病性不同，因此疫苗对不同HEV的毒株的保护性 不同，实例强调了对禽不同致病性的毒株的保护效果。
[0008] 禽戊型肝炎病毒在鸡群中流行，引起肝炎型脾肿大综合症，在澳大利亚、西班牙、 美国、中国发现已经鉴别了至少3个基因型HEV，和人、猪源的HEV核苷酸同源性50-60%。 除此之外，大鼠、獴、鹿、兔、鱼都发现有HEV，哺乳类HEV只有1个血清型。
[0009] 减毒或灭活的疫苗因为无适合的细胞系统未能开发，只有中国开发注册了一大肠 杆菌表达的HEV病毒样颗粒疫苗，但表达的病毒样颗粒制造工艺复杂，表达的蛋白为包涵 体，需要复杂的变复性过程才能组装成病毒样颗粒。在HEV蛋白中，ORFl编码非结构蛋白， 在免疫中不形成中和抗体，0RF3编码一种功能不清的非结构蛋白，短期形成抗体，但无中和 作用。0RF2编码72kD衣壳蛋白，有660个氨基酸组成，其中的组成片段具有免疫原性且在 各基因型戊型肝炎病毒高度保守。衣壳蛋白的抗体体外中和HEV，保护非人类灵长动物猿猴 免受感染，且长期保护。0RF2全长衣壳蛋白（72kDa)不适宜作为疫苗抗原，因为其掩盖主 要免疫表位，有一定的疏水性性质。截断的衣壳蛋白55kDa是一种较为稳定、安全且具有免 疫原性的疫苗抗原。由于HEV缺乏有效的组织培养体系，对于HE灭活及减毒活疫苗的研制 造成了难度，目前HE疫苗研宄主要集中于HE基因工程疫苗的研制。0RF2含有重要的中和 抗原表位，目前已有0RF2许多片段在不同表达系统中成功地进行了表达，如原核、昆虫、酵 母、植物细胞等表达系统，且表达产物均具有一定的免疫原性。
[0010] HEV重组的衣壳蛋白在人、非人类灵长动物、鸡上可诱导HEV中和抗体，其中截断 的衣壳蛋白，含HEV的免疫表位并形成病毒样颗粒，增强疫苗免疫效果，并对异源HEV病毒 攻击产生交叉保护。
【发明内容】
[0011] 戊型肝炎病毒由于缺乏适宜的疫苗细胞基质，用细胞培养的方法不能达到生物制 品用抗原或疫苗的要求，现多采用基因工程方法制备，一般采用真核系统进行表达，如昆 虫、哺乳动物细胞、酵母。用真核系统表达、提取、纯化的步骤多，收率低，仪器和厂房的成本 费用昂贵且要求高。全长衣壳蛋白（72kDa)不适宜作为HEV病毒样颗粒疫苗抗原，因为其 掩盖主要免疫表位，有一定的疏水性性质。截断的衣壳蛋白55kDa是一种较为稳定、安全且 具有免疫原性的疫苗抗原。
[0012] 针对以上问题，本发明公开了一种制备戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的方法，其特征 在于，包括以下步骤：
[0013] (1)合成野生型戊型肝炎病毒全长0RF2基因，基因合成后，插入克隆质粒 pGEM-T ；
[0014] (2)合成戊型肝炎病毒截断的A0RF2基因
[0015] 使用大肠杆菌喜好的密码子，设计编码戊型肝炎病毒112-660位氨基酸的截断的 Λ 0RF2基因，然后以野生型戊型肝炎病毒全长0RF2基因为模板，设计引物合成Λ 0RF2基 因，合成的A0RF2基因产物与同样酶切的pMAL_p4x表达质粒片段连接；
[0016] (3)戊型肝炎病毒截断的A0RF2基因在大肠杆菌中的表达
[0017] 连接产物转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序，得到pMAL_p4X MBP- Δ 0RF2重组质 粒；重组质粒pMAL-p4xMBP-A〇RF2接种LB培养基，按1 : 200~I : 1000(V/V)转接到 含有18L LB培养基的20L的发酵罐中，以250rpm转速37°C培养4~6h，菌液0D600达到 0· 6~0· 8时，按浓度0· 5~0· 7mmol/L加入IPTG诱导4h，4000rpm离心25min，获得湿重 为110~120g/L的菌体培养物；
[0018] (4)戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白Λ 0RF2的提取和纯化
[0019] a裂解剂筛选和细菌膜蛋白提取
[0020] 将步骤（3)得到的菌体培养物融化，重悬于层析缓冲液，用超声仪在冰浴中破碎 细胞壁，超声液75, 000g、4-8°C离心1小时分离上清和沉淀，沉淀用溶解液溶解，加入裂解 剂在4°C搅拌2h提取大肠杆菌膜蛋白，测定提取物的活性，以确定总蛋白和裂解剂的比例， 提取物以100, OOOg超速离心1小时，获得可溶性上清，再用层析缓冲液稀释至最终裂解物 的浓度为〇. 5-1. 0% (w/v)以便于后续纯化；
[0021] 其中，所述的层析缓冲液含有20mM NaH2PO4, IOOmM NaCl，l μΜ蛋白酶抑制剂 E-64、0.3mM三羧甲基磷酸，pH 7.5,；
[0022] 所述的溶解液含有 20mM Tris-HCl，300mMNaCl，Im