一种高效提取银杏黄酮的工艺方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种天然产物中有效成分提取技术，属于生物技术领域。具体涉及一种高效提取银杏黄酮的工艺方法。
【背景技术】
[0002]银杏(Ginkgo bilobaL.)是冰川时期存活在地球上的孑遗植物，素有“活化石”之美誉。银杏不仅可以作为著名的园林观赏树种，而且因其富含多种生理活性物质，具有很高的经济价值和营养价值。银杏叶提取物(EGB)具有独特药理活性和巨大的临床应用价值，应用领域包括医药、食品、保健品、化妆品、工艺品和植物保护。大量研宄表明，黄酮类化合物是银杏叶提取物(EGB)中主要生理活性成分之一，具有扩张血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、调血脂和抗肿瘤等药理作用。近年来，对银杏叶黄酮提取的研宄十分活跃，取得了较大的进展。目前，分离纯化银杏黄酮的方法主要包括:溶剂浸提法、微波法、超临界法、超声波法、大孔树脂吸附法和酶法等。其中最成熟的提取工艺是溶剂浸提法，如法国博福-益普生制药公司与德国施瓦伯公司联合开发研制的以EGB761为代号的银杏叶提取物。其生产工艺是以60%丙酮为起始溶剂粗提取，再经脱脂、去银杏酚酸等15道工艺制成提取物。国内银杏叶提取物的生产技术多采用水或醇类溶剂提取，再经大孔树脂吸附得到银杏黄酮提取物。但是，目前利用溶剂法提取黄酮工艺还存在许多问题，主要包括:1)提取过程中溶剂消耗量比较大，产品中易残留有机溶剂；2)生产周期长，成本较高；3)提取率不高，产品中黄酮含量低，且其水溶性较差。因此，开发新型银杏黄酮溶剂提取工艺，以期减少溶剂使用量、提高黄酮提取效率、增加水溶性银杏黄酮含量显得尤其重要。
【发明内容】
[0003]本发明目的是为了解决现有银杏黄酮溶剂法提取中存在的问题，克服其溶剂用量大、残留高、提取率低、水溶性银杏黄酮含量低等缺点，提供一种高效提取银杏黄酮的工艺方法，本方法溶剂使用量少，总黄酮提取率高，适用于工业化生产。
[0004]本发明所要解决的技术问题由以下技术方案来实现:
(1)超微气流粉碎:将银杏叶于60-70°C烘干，经超微气流粉碎至粒径500-3000目的银杏叶超微粉末；
(2)酶解浸提:
a)称取超微粉碎后的银杏叶粉末，按1:(10-20)的比例与水混合，加热80°C -100°C,40-60min ；
b)调节温度为40-50°C，调节pH值为4.2-4.8后加入银杏叶粉末质量比0.01-0.2%的复合酶，酶解2-12小时后加热至80-120°C，固液分离，得到酶解液；其中复合酶为纤维素酶:β -葡聚糖酶:果胶酶=2:1:1组成；
c)将上述酶解液的pH值调节至5.5-6.5，加入一定量乙醇使其浓度达到20-40%V/V，充分搅拌后再加入葡萄糖苷酶使其活力达到0.01-0.5AGU/L，反应12-24小时后弃去杂质，得到浸提液；
(3)浓缩:将浸提液回收乙醇并减压浓缩至原体积1/3-1/5得浓缩液；
(4)将浓缩液倾入大孔吸附树脂柱中吸附1-2小时，用蒸馏水洗涤至洗涤洗脱液基本无色，然后用浓度为10-60%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；
(5)将得到的乙醇洗脱液回收乙醇并减压浓缩至体积的1/3-1/6，然后将浓缩液加入体积8-10倍的去离子水，搅拌均匀，进行喷雾干燥，得到银杏叶黄酮化合物产品。
[0005]与国内外现有技术相比，本发明的积极效果和优点有:
A、利用超微气流粉碎技术将银杏叶粉碎成粒径为500-3000目左右，使银杏叶粉更加细微、均匀，可以增加银杏叶粉与提取试剂的比表面积。同时通过超微处理，使银杏叶细胞的破比率达到90%以上，可以使银杏叶中有效成分充分暴露出来，从而有利于银杏叶黄酮的提取。
[0006]B、银杏黄酮类化合物几乎被以纤维素为主构成的细胞壁所包围，传统的水提和醇提法不利于溶剂进入细胞壁内部微孔隙内，致使提取效果受到很大的限制，资源浪费严重。本发明采用富含纤维素酶、β -葡聚糖酶和果胶酶的复合提取酶能破坏银杏细胞壁结构，减小传质阻力，可以提高银杏黄酮提取效率。
[0007]C、银杏叶总黄酮在植物细胞中以苷元和苷的形式存在，在醇水体系中黄酮苷元由于其极性低不易被提取。本发明的优点是利用转苷酶的作用将极性低的黄酮苷元、黄酮苷转为更高极性的黄酮苷，从而提高总黄酮在醇水中的提取率。同时，由于被提取的物质极性的增加，可以在低浓度的纯水体系中进行提取，可以减少提取溶剂的用量，降低成本。
【具体实施方式】
[0008]以下通过不同具体实例对本发明做进一步描述，但本发明的内容不仅限于此。
[0009]实施例1
1)将银杏叶超微粉碎成1000目银杏叶粉；
2)称取Ikg超微粉碎后的银杏叶粉末，按照1:15质量比例与水混合，加热至80°C、60min处理灭活内源性酶；
3)调节温度为45°C，调节pH值至4.2后加入银杏叶粉末质量0.1%的复合酶，该复合酶由纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶按2:1:1配比组成，酶解10小时后加热至100°C，经固液分1?，得到酶解液；
4)将上述酶解液的pH值调节至5.5，加入无水乙醇使其浓度达到30%V/V，充分搅拌后再加入葡萄糖苷酶使其活力达到0.1AGU/L，反应24小时后弃去杂质，得到浸提液；
5)将浸提液回收乙醇并加热浓缩至原体积1/4，得浓缩液；
6)将浓缩液倾入大孔吸附树脂柱中吸附2小时，用蒸馏水洗涤至洗涤洗脱液基本无色，然后用浓度为50%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；
7)将得到的乙醇洗脱液回收乙醇并减压浓缩至体积1/3，得浓缩液，然后将浓缩液加入体积8倍量去离子，搅拌均匀，进行喷雾干燥，得到银杏叶黄酮化合物产品；
8)经检测，最终产品中银杏总黄酮醇苷含量达到32.0%，银杏萜类内酯含量8.0%，银杏酸含量小于0.003ppm，银杏叶中总黄酮提取率达到92%左右。
[0010]实施例2 1)将银杏叶超微粉碎成2000目银杏叶粉；
2)称取5kg超微粉碎后的银杏叶粉末，按照1:20质量比例与水混合，加热至100°C、40min处理灭活内源性酶；
3)调节温度为50°C，调节pH值至4.5后加入银杏叶粉末质量0.2%的复合酶，该复合酶由纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶按2:1:1配比组成，酶解12小时后加热至100°C，经固液分1?，得到酶解液；
4)将上述酶解液的pH值调节至5.0，加入无水乙醇使其浓度达到40%V/V，充分搅拌后再加入葡萄糖苷酶使其活力达到0.2AGU/L，反应20小时后弃去杂质，得到浸提液；
5)将浸提液回收乙醇并加热浓缩至原体积1/4，得浓缩液；
6)将浓缩液倾入大孔吸附树脂柱中吸附1.5小时，用蒸馏水洗涤至洗涤洗脱液基本无色，然后用浓度为60%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；
7)将得到的乙醇洗脱液回收乙醇并减压浓缩至体积1/4，得浓缩液，然后将浓缩液加入体积10倍的去离子水，搅拌均匀，进行喷雾干燥，得到银杏叶黄酮化合物产品；
8)经检测，最终产品中银杏总黄酮醇苷含量达到32.8%，银杏萜类内酯含量8.02%，银杏酸含量小于0.005ppm，银杏叶中总黄酮提取率达到95%左右。
【主权项】
1.一种高效提取银杏黄酮的工艺方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)超微气流粉碎:将银杏叶于60-70°C烘干，经超微气流粉碎至粒径500-3000目的银杏叶超微粉末； (2)酶解浸提: a)称取超微粉碎后的银杏叶粉末，按质量比为1:(10-20)的比例与水混合，加热800C -1OO0C>40-60min ； b)调节温度为40-50°C，调节pH值为4.2-4.8后加入银杏叶粉末质量比0.01-0.2%的复合酶，酶解2-12小时后加热至80-120°C，固液分离，得到酶解液；其中复合酶为纤维素酶:β -葡聚糖酶:果胶酶=2:1:1组成； c)将酶解液的pH值调节至5.5-6.5，加入一定量乙醇使其浓度达到20-40%V/V，充分搅拌后再加入葡萄糖苷酶使其活力达到0.01-0.5AGU/L，反应12-24小时后弃去杂质，得到浸提液； (3)浓缩:将浸提液回收乙醇并减压浓缩至原体积1/3-1/5得浓缩液； (4)将浓缩液倾入大孔吸附树脂柱中吸附1-2小时，用蒸馏水洗涤至洗涤洗脱液基本无色，然后用浓度为10-60%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液； (5)将得到的乙醇洗脱液回收乙醇并减压浓缩至体积的1/3-1/6，然后将浓缩液加入体积8-10倍的去离子水，搅拌均匀，进行喷雾干燥，得到银杏叶黄酮化合物产品。
【专利摘要】本发明涉及一种采用超微粉碎辅助生物酶法从银杏中高效提取银杏黄酮的方法，包括（1）银杏叶经超微粉碎至500-3000目；（2）加入物料重量3-5倍的水，并加入0.01-0.2%复合酶酶解提取2-12小时；（3）调节pH值至5.5-6.5，加入一定量无水乙醇和葡萄糖苷酶，反应12-24小时；（4）提取液浓缩回收乙醇；（5）浓缩液进行大孔树脂吸附，乙醇洗脱；（6）洗脱液经回收乙醇减压浓缩后喷雾干燥，得到银杏叶黄酮化合物产品。本发明是一种新型银杏黄酮提取工艺，可以减少提取过程中溶剂使用量、提高黄酮提取效率、增加水溶性银杏黄酮含量。
【IPC分类】A61P35/00, A61P7/02, A61K36/16, A61K127/00, A61P9/08, A61P3/06
【公开号】CN104906153
【申请号】CN201510311487
【发明人】周彬, 程耀波, 王荣彬
【申请人】邳州鑫源生物制品有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月9日