氯 乙烯、聚乙烯和/或卤代碳氟化合物。
[0296] 含有一种或多种所请求保护的组合的药物的控释组合物还可处于漂浮片剂 (buoyant tablet)或胶囊剂的形式（即，在口服给予时，在一定的时间段内浮在胃的内容 物顶部的片剂或胶囊剂）。药物的漂浮片剂制剂可通过将具有赋形剂的药物与20% -75% w/w水胶体的混合物制粒而制备，所述水胶体例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或者羟丙基 甲基纤维素。然后，可将所获得的颗粒压制成片剂。在与胃液接触时，片剂在其表面周围形 成基本上不透水的凝胶屏障。该凝胶屏障参与了维持密度小于1，从而允许片剂保持漂浮在 胃液中。
[0297] 用于口服给予的液体
[0298] 适于通过加入水而制备水性混悬剂的散剂、可分散散剂或颗粒剂是用于口服给予 的方便的剂型。作为混悬剂的制剂提供了与分散剂或润湿剂、混悬剂以及一种或多种防腐 剂混合的活性成分。合适的悬浮剂为例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、藻酸钠等。
[0299] 肠胃外组合物
[0300]药物组合物还能够以剂型、制剂的形式通过注射、输注或植入（静脉内、肌内、皮 下等）经肠胃外给予，或者经由合适的递送装置或含有常规的且无毒的药学上可接受的载 体和佐剂的植入物经肠胃外给予。此类组合物的制剂和制品为药物制剂领域中的技术人员 所公知。
[0301] 肠胃外使用的组合物能够以单位剂型（例如，在单剂量安瓿瓶中）、或以含有多重 剂量的小瓶提供，并且其中可加入合适的防腐剂（参见下文）。组合物可处于溶液剂、混悬 剂、乳剂、输注装置或用于植入的递送装置的形式，或者组合物可作为干粉存在，以在使用 前用水或另外的合适的溶媒复原。除活性药物外，组合物可包含合适的肠胃外可接受的载 体和/或赋形剂。可将活性药物掺入用于控释的微球、微胶囊、纳米颗粒、微脂粒等中。组 合物可包含混悬剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂和/或分散剂。
[0302] 本发明所述的药物组合物可处于适用于无菌注射的形式。为制备此类组合物，将 合适的活性药物溶于或悬浮于肠胃外可接受的液体溶媒中。在可使用的可接受的溶媒和溶 剂中，可使用水，通过加入适量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲液、1，3- 丁二醇、林格氏溶液 和等渗氯化钠溶液将水调节至合适的PH值。水性制剂还可包含一种或多种防腐剂（例如， 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯）。在药物中的一种仅少量或 微溶于水的情况下，可加入溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可包含10% -60% w/w的丙二醇 等。
[0303] 控释的肠胃外组合物可处于水性混悬剂、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液剂、油混 悬剂或乳剂的形式。或者，可将活性药物掺入至生物相容的载体、微脂粒、纳米颗粒、植入物 或输注装置中。在制备微球体和/或微胶囊中使用的材料为例如可生物降解/可生物蚀解 的聚合物，例如聚乳酸羟基乙酸（polygalactin)、聚（异丁基氰基丙烯酸酯）、聚（2-羟乙 基-L-谷氨酰胺）。当配制控释的肠胃外制剂时，可使用的生物相容载体为碳水化合物（例 如葡聚糖）、蛋白质（例如白蛋白）、脂蛋白或抗体。植入物中使用的材料可为不可生物降 解的（例如，聚二甲基硅氧烷）、或可生物降解的（例如，聚（己酸内酯）、聚（乙醇酸）或 聚（原酸酯））。
[0304] 替代途径
[0305] 尽管不太优选并且不太方便，但可考虑另外的给予途径，以及由此可考虑另外的 制剂。在这方面，为了直肠应用，组合物的合适剂型包括栓剂（乳剂或混悬剂类型）和直肠 明胶胶囊（溶液剂或混悬剂）。在典型的栓剂制剂中，活性药物与适当的药学上可接受的栓 剂基质（例如可可脂、酯化的脂肪酸、甘油化的明胶、以及诸如聚乙二醇的多种水溶性或可 分散的基质）相结合。可掺入多种添加剂、增强剂或表面活性剂。
[0306] 药物组合物还能够以含有常规、无毒的药学上可接受的载体和赋形剂（包括微球 和微脂粒）的剂型或制剂局部地施用于皮肤上，用于经皮吸收。制剂包括霜剂、软膏剂、洗 剂、搽剂、凝胶剂、水凝胶、溶液剂、混悬剂、药棒（Sticks)、喷雾剂、糊剂、硬膏剂和另外类型 的经皮药物递送系统。药学上可接受的载体或赋形剂可包括乳化剂、抗氧化剂、缓冲剂、防 腐剂、保湿剂、渗透增强剂、螯合剂、凝胶形成剂、软膏基质、香料和皮肤保护剂。
[0307] 防腐剂、保湿剂、渗透增强剂可为对羟基苯甲酸酯（例如对羟基苯甲酸甲酯或对 羟基苯甲酸丙酯）、以及苯扎氯铵、甘油、丙二醇和尿素等。
[0308] 上述用于在皮肤上局部给予的药物组合物还可与在待治疗的机体的部分上的局 部给予、或在待治疗的机体的部分附近的局部给予联合使用。组合物可适于直接施用、或者 通过特定的药物递送装置施用，所述药物递送装置例如敷料、或者贴膏（plasters)、垫、海 绵、条带或其它形式的合适的柔性材料。
[0309] 治疗的剂量和持续时间
[0310] 在一天的不同时间点，通过口服、或者经皮下注射、静脉内注射或肌内注射将本发 明所述的组合物给予受试者，从而改变血糖水平。在进行这一方法中，当期望对哺乳动物的 血糖水平进行改变、调节或正常化以治疗糖尿病或相关紊乱、或者同时治疗两者时，将本发 明的组合物以足以改变、调节或使受试者血液中葡萄糖水平正常化的剂量给予。在一天的 特定时间段内，例如当葡萄糖浓度刚好达到其在血浆中的峰值时、或者在刚好达到峰值之 前或之后，可将本发明的组合物给予显示出异常血糖水平的哺乳动物、特别是人类。哺乳动 物血液中的葡萄糖水平是时段相关的（time-of-day dependent)，并且是周期性的。在一天 的不同时间点，血液中的葡萄糖水平优选取决于进食时间以及身体活动/锻炼时间而上升 和下降。通常，葡萄糖浓度在餐后达到其在受试者血浆中的峰值，因此，本发明的组合物可 在例如优选餐前2小时至餐后2小时、更优选餐前1小时至餐后1小时、甚至更优选在进食 期间给予，以达到最大的治疗作用。
[0311] 将能理解的是，组合的药物能够以相同或不同的药物制剂同时给予或依次给予。 对本说明书所述的组合的最低要求是所述组合应该旨在与活性成分的组合的有效作用的 益处组合而使用。组合的预期用途可通过工具（facilities)、规定、适应症和/或其它方式 进行推断，以帮助使用本发明所述的组合。
[0312] 在本发明的组合中的药物的治疗有效量包括例如有效用于控制血液或血浆葡萄 糖水平的量。
[0313] 给予可每天一次至数次，持续数天至数年，甚至可能对患者终生给予。在大多数情 况下，需要长久或至少周期性重复的长期给予。
[0314] 术语"单位剂型"是指适合作为用于人类受试者的单一剂量的物理上离散的单位 (例如胶囊剂、片剂或装药的注射针筒），各单位含有经计算产生期望治疗效果的预定量的 活性物质或材料以及所需的药物载体。
[0315] 在优选的单位剂量组合物中的各药物的量取决于多种因素，所述因素包括：给予 方法、患者的体重和年龄、疾病的阶段、考虑到待治疗的人的总体健康状况的潜在副作用的 风险。此外，特定患者的药物基因组学信息（基因型对药物动力学、药效学或治疗有效性的 影响）可能会影响所使用的剂量。
[0316] 除了当响应于特别受损的葡萄糖水平时可能需要更高的剂量之外，组合物中的各 药物的优选剂量处于不高出通常用于长期维持性治疗或在3期临床研宄中证明安全的剂 量的范围内。
[0317] 本发明的一个显著优点是，在组合治疗中，各化合物能够以低剂量使用，同时对患 者产生组合的实质性的临床收益。在化合物单独使用时具有低的效果或无效果时的剂量 下，组合治疗能够在实际上有效。因此，本发明特别的优点在于，能够使用各化合物的亚最 佳剂量，即，比起通常所规定的治疗剂量而言更低的剂量、优选治疗剂量的1/2,更优选治 疗剂量的1/3、1/4、1/5,或甚至更优选治疗剂量的1/10。在具体实例中，使用治疗剂量的 1/20、1/30、1/50、1/100、或甚至更低的剂量。
[0318] 在此类亚治疗剂量下，化合物将表现出没有副作用或较少的副作用，而本发明所 述的组合在控制血液或血浆中的葡萄糖水平方面完全有效。
[0319] 优选的剂量相当于通常用于长期维持性治疗的规定剂量的1%至50%的量。
[0320] 最优选的剂量可相当于通常用于长期维持性治疗的规定剂量的1%至10%的量。
[0321] 下面提供了在本发明中使用的药物剂量的具体实例：
[0322] _阿坎酸，口服每天约9mg至200mg ;
[0323] -阿米三嘆，口服每天约0? 5mg至IOmg ;
[0324] -氨来咕诺，口服每天约0? 75mg至15mg ;
[0325] -氮卓斯汀，口服每天约0. 04mg至0. 4mg ;
[0326] -巴氯芬，口服每天约0? 15mg至50mg ;
[0327] -喷托维林，口服每天约0? 6mg至18mg ;
[0328] -西咪替丁，口服每天约4mg至160mg ;
[0329] -西那卡塞，口服每天约0? 3mg至36mg ;
[0330] -D-甘露糖，口服每天0? Olg至I. 6g ;
[0331] -右溴苯那敏，口服每天约0? 06mg至I. 2mg，；
[0332] _乙胺嘆，口服每天约0? 6mg至600mg ;
[0333] -二轻丙茶碱，口服每天约9mg至320mg ;
[0334] -芬司匹利，口服每天I. 6mg至24mg ;
[0335]-非索非那定，口服每天I.2mg至18mg;
[0336] -艾地苯醌，口服每天约4. 5mg至225mg ;
[0337] -艾芬地尔，口服每天约0? 4mg至6mg ;
[0338] -左西孟旦，口服每天约0? 05mg至4mg ;
[0339] -二甲双胍，口服每天约Img到2. 5mg ;
[0340] _美西律，口服每天约6mg至120mg ;
[0341] -尼麦角林，口服每天约0? 6mg至6mg ;
[0342] -吡贝地尔，口服每天约0? 8mg至25mg ;
[0343] -利美尼定，口服每天约10 y g至200 y g ;
[0344] -托哌酮，口服每天约I. 5mg至4. 5mg ;
[0345] -托芬那酸，口服每天约3mg至60mg ;
[0346] -托拉塞米，口服每天约0. 05mg至4mg ;
[0347] -氨苯蝶啶，口服每天约I. 5mg至25mg。
[0348] 在本发明的组合中，药物之间的摩尔比可从例如0. 001变化至1000。此外，在本发 明的组合物中，药物与赋形剂之间的比优选在0. 001至1000之间变化。
[0349] 将能理解的是，实际给予的药物的量将由医生根据相关情况确定，所述相关情况 包括：待治疗的一种或多种病症；待给予的确切的组合物；个体患者的年龄、体重和响应； 患者症状的严重程度；以及所选择的给予途径。因此，上述剂量范围旨在提供一般性指导和 对本文教导的支持，但并不旨在对本发明的范围进行限制。
[0350] 以下实施例仅用于说明目的，而并非进行限制。
[0351] 实施例
[0352] 糖尿病是极度影响能量稳态的代谢性疾病，并且在患者中观察到的葡萄糖的高血 浆水平可具有多种诱因。1型糖尿病的特征在于胰岛的0细胞的破坏。2型糖尿病的特征 部分上在于，通过胰腺e细胞产生的胰岛素减少、e细胞渐进性死亡、胰岛素抵抗（即，肌 细胞和脂肪细胞对葡萄糖的较低的捕获）、或肝糖异生的异常升高。因此，基于数种的体外 和体内研宄进行候选化合物的疗效确定，以解决（address)表征该复杂的病理学的大多数 的代谢和生理损伤。首先对药物进行单独测试，然后试验它们的组合作用。给予多种模型 确定药物的活性，这表明了代表血糖水平异常的不同生理特征，例如糖尿病或相关紊乱中 涉及的血糖水平。
[0353] 1.体外研宄
[0354]1.10细胞凋亡的预防
[0355] 已对本发明的药物保护0细胞避免细胞凋亡的作用进行了试验。可考虑在1型 糖尿病以及2型糖尿病中应用该活性。
[0356] 细胞培养和培养基
[0357] 选择0胰腺INS-I细胞用于该项研宄。细胞在完全培养基中进行培养，所述完全 培养基如由Asfari等（23)描述的补充有ImM丙酮酸钠、50 yM 2-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、 IOmM HEPES、100IU/mL青霉素、lOOyg/mL链霉素和10%热灭活的胎牛血清（FCS)的RPMI 1640 IOmM葡萄糖。将INS-I细胞接种入聚鸟氨酸包被的96孔板中（4. 5 X IO4细胞/孔）， 并在37°C下于95%空气/5% CO2的潮湿气氛中培养。一天后，将细胞与测试分子预孵育1 小时。然后，在更换培养基后，将细胞在含有测试分子和葡萄糖30mM、肉豆蔻酸0. 05mM、INF 25ng/mL、TNF 25ng/mL和IL 5ng/mL的培养基中培养24小时。
[0358] 细胞凋亡的定量
[0359] 随后，通过来自Chemicon的高度特异性凋亡检测试剂盒，对化合物预防细胞凋亡 的效力进行评价（Ref. APT225)。该过程基于单链DNA (ssDNA)的测定，所述单链DNA为凋亡 细胞的特异性标记物（24)。
[0360] 结果以光密度（OD)任意单位和由凋亡情况诱导的细胞凋亡减少的％表示。接着 进行Dunettt-检验，与凋亡对照条件相比，显示出凋亡细胞的％显著下降的所有化合物均 被认为具有活性。
[0361] 结果
[0362] 结果示于图1和表3中，结果表明，当对本发明的药物单独进行测试时，诱导了针 对0细胞凋亡的实质性的保护作用。在图1中，当与处于凋亡条件的未经处理的细胞相比 时，D-甘露糖诱导了针对细胞凋亡的显著并且完整的0细胞的保护。D-甘露糖赋予了超 过129%的避免细胞凋亡的保护。同样地，表3示出了由本发明的药物赋予的保护的百分 比。
[0363] 表3
[0364]
[0365] I. 2响应于葡萄糖刺激的胰岛素分泌
[0366] 细胞培养和培养基
[0367] 选择0胰腺INS-I细胞用于研宄它们响应于如下物质的胰岛素分泌性质：葡萄糖 和另外的生理学或药理学胰岛素促分泌素（如磺酰脲和GLP-1)。细胞在完全培养基中进行 培养，所述完全培养基如由Asfari等（23)描述的补充有ImM丙酮酸钠、50 yM 2-巯基乙 醇、2mM谷氨酰胺、IOmM HEPES、lOOIU/mL青霉素、100 y g/ml链霉素和10%热灭活的胎牛血 清（FCS)的RPMI 1640 IOmM葡萄糖。为进行胰岛素分泌试验，将INS-I细胞接种（4. 5 X IO4 细胞/孔）并培养于聚鸟氨酸包被的96孔板中。在37°C下于95%空气/5% 0)2的潮湿气 氛中培养三天之后，移除培养基，并将细胞在含有5mM葡萄糖、1 % FCS (以及用于长期评价 的测试药物）的培养基中培养16h。
[0368] 在膜岛素分泌试验的当天，用Krebs-Ringer Bicarbonate HEPES缓冲液（KRBH ; pH 7.4)0. 1%的Bovin Serum Albumin(BSA)对细胞进行漂洗，并在含有2. 8mM葡萄糖的 KRBH 0? 1% BSA 中于 37°C 下预孵育 30min。
[0369] 再次用KRBH漂洗细胞，并在含有3. 5mM葡萄糖和测试分子的KRBH 0. 1 % BSA中孵 育1小时。收集上清液用于胰岛素的确定和乳酸脱氢酶（LDH)活性的测量。
[0370] 胰岛素的定量
[0371] 根据制造商的建议，使用大鼠胰岛素抗体（胰岛素大鼠高范围ELISA Alpco Cat no 80-INSRTH-E10)，通过ELISA试剂盒对在所收集的上清液中的胰岛素浓度进行测定。非 常简要地说，将对胰岛素具有特异性的大鼠单克隆抗体固定至96孔板。向合适的孔中加入 标准品、样品和对照品，所述孔具有辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体（缀合物）。在孵育 后，对微孔板进行漂洗以移除未结合的缀合物，并加入TMB底物溶液与结合的缀合物进行 反应。最后，在加入终止溶液后，使用620nm作为参考波长，在450nm下对光密度进行测量。 黄色的强度与样品中的胰岛素的量直接成正比。
[0372] 通过对培养基中存在或不存在本发明的药物的情况下分泌的胰岛素的量（以 pmol/L表示）进行评价，从而显示出药物的效力。
[0373] 结果
[0374] 本发明的药物诱导了响应于葡萄糖刺激的胰岛素分泌。例如，图2和图3显示出 氨苯喋啶（10 UM，+37% )和西那卡塞（I yM，+55% )分别能够显著提高响应于葡萄糖刺激 的胰岛素分泌，随后分别进行短期或长期的孵育。
[0375] I. 3在肌肉或脂肪细胞中的葡萄糖摄取
[0376] 1. 3. 1在小鼠肌细胞中的葡萄糖摄取
[0377] 已在用于胰岛素抵抗的多种模型中对本发明的药物进行了测试。在处于正常或病 理状况下的肌细胞和脂肪细胞中，对本发明组合物的葡萄糖摄取增强能力进行了测量。根 据培养条件，肌细胞显示出连续的有丝分裂、或最终分化为肌管。
[0378] 细胞培养和培养基
[0379] 如此前由Fryer等所述的，在允许的条件下（33°C、在95%空气/10%CO2的潮湿 气氛下；补充有20%FCSUO%马血清、2 %谷氨酰胺、0. 5 %鸡胚胎、20mU/mL小鼠INFy、 lOOU/mL青霉素和100yg/mL链霉素的DMEM5. 5mMD-葡萄糖），使小鼠肌细胞H-2Kb以 0. 8XIO4个细胞/孔的的密度在包被有基质胶的24孔板上生长4天（25)。为了成肌细胞 中的分化，将细胞转移至非允许的培养条件下（37°C、在95%空气/5% 0)2的潮湿气氛下； 补充有2%FCS、10%马血清、2%谷氨酰胺、1%鸡胚胎、lOOU/mL青霉素和lOOyg/mL链霉素 的DMEM5. 5mMD-葡萄糖）。
[0380] 葡萄糖的摄取
[0381] 对于长期效果的评价，在葡萄糖摄取试验的前一天，在测试分子存在的情况下，将 细胞在补充有10%马血清、2% SVF、1 %鸡胚胎、2%谷氨酰胺的DMEM 5. 5mM D-葡萄糖中孵 育16小时。一天之后并在试验之前，对细胞进行漂洗，并在测试分子存在的情况下于含有 5. 5mM D-葡萄糖的无血清培养基（DMEM)中孵育4小时以上。
[0382] 对于短期效果的评价，在葡萄糖测试的4小时前，对细胞进行漂洗并在无血清培 养基（DMEM)中孵育。然后，通过在Krebs-Ringer HEPES缓冲液（KRBH ;pH 7. 4)0. 1 % Bovine Serum Albumine (BSA) fraction V(Sigma_A_4503)中用放射性标记的 2-脱氧-D-[1，23H] 葡萄糖孵育细胞5-10分钟，对葡萄糖的摄取进行测量。通过在冰冷的0. 9%氯化钠中的两 个漂洗步骤，抑制葡萄糖的摄取。然后，将细胞溶于0.1 N NaOH中30分钟。然后，对细胞 相关的放射性进行计数，并使用比色Lowry法确定蛋白定量。在加入600 y L/孔的闪烁体 (Optiphase SuperMix3)后，通过Microbeta计数器对掺入细胞中的放射性进行测量，从而 估量葡萄糖摄取。
[0383] 通过衍生自Lowry法的比色试验进行蛋白质定量。
[0384] 结果以nmol的掺入葡萄糖/5mn/mg蛋白质和对照或基础状态（100% )的％表示。
[0385] 结果
[0386] 本发明的药物在单独测试时能够提高肌细胞中的葡萄糖摄取。例如，图4、图5 和图6示出了相比于未经处理的肌细胞时，分别在用阿坎酸（0.1 yM，+45% )和阿米三嗪 (lyM，+80% )短期孵育后、或由尼麦角林（10yM，+28% )长期孵育后，由肌细胞H-2Kb摄 取的葡萄糖显著提高。
[0387] 1. 3. 2人糖尿病肌管原代培养物中的葡萄糖摄取
[0388] 为建立最能反映糖尿病病理条件的模型，对药物增强糖尿病肌管中的葡萄糖摄取 的效力进行了测试。事实上，已显示出从糖尿病受试者建立的肌管中的糖尿病表型得以保 留。
[0389] 细胞培养和培养基
[0390] 使来自糖尿病患者的肌管在补充有15%胎牛血清、ImM谷氨酰胺的基于HAM's FlO的培养基（Sigma，Ref. N6908)上生长。