[0391] 将成肌细胞以380 000细胞/孔的密度接种在12孔板中。在增殖2天后，将细胞 置于降低的血清条件下（2%马血清）以诱导分化。在分化5天后使用肌管。
[0392] 将基于Dulbecco' s改良的Eagle' s培养基（DMEM)的培养基（Gibco， Ref. 31053-028)补充2%热灭活的马血清、2% Glutamax(Gibco,35050)，并漂洗用于葡萄 糖摄取试验。将化合物溶于DMSO中，以在使用之前达到期望的最终浓度。
[0393] 在试验之前，用本发明的组合物对分化的肌管处理24小时。
[0394] 葡萄糖摄取试验
[0395] 在葡萄糖摄取开始前，对细胞剥夺血清和葡萄糖。首先在含有还原的葡萄糖（lg/ L)并且无血清的DMEM培养基中进行剥夺。在以期望浓度加入化合物之后，将细胞在37°C下 孵育2小时30分钟。用胰岛素的对照使得能够对通过胰岛素途径诱导的葡萄糖摄取进行测 量。在37°C下于30分钟内进行胰岛素处理（IOOnM)。随后，在HBS缓冲液中于37°C下进行 葡萄糖和血清的剥夺，持续2小时。用10 yM的2-[3H]脱氧葡萄糖10Ci/mM+2-脱氧-D-葡 萄糖的混合物对细胞处理30分钟。用ImL冷的PBS对细胞清洗（rinced)两次。在500 yL 0. 05N的NaOH中裂解20分钟。将细胞裂解物转移至闪烁瓶中，用于使用MicroBeta计数器 进行放射性测量。
[0396] 结果
[0397] 本发明的组合物可提高人原代肌管中的葡萄糖摄取。例如，图13、图14、图15、 图16和图17显示出在通过托拉塞米（在0.01 yM和0.1 yM下，分别为+24%和18%， P〈0. 01 ;在IyM下为+14%，p〈0. 05)、芬司匹利（在0.01 yM和0? IyM下，分别为+34%和 30%，P〈0.01 ;在 IyM 下为+27%，p〈0.05)、托芬那酸（在 0.01yM、0.1 yM和 IyM 下，分 别为+13%、+13%和+12%，？〈0.05)、艾芬地尔（在0.011^下为+48%，？ = 0.07;并且在 0.1 yM和IyM下得以改进）和氨苯喋啶（在0.01 yM下为+13%，p〈0. 05)预孵育之后， 改善了糖尿病肌管中的葡萄糖摄取。
[0398] 1. 3. 3脂肪细胞3T3-L1中的葡萄糖摄取
[0399] 3T3-L1细胞是在适当条件下分化为脂肪细胞样细胞的成纤维细胞。使用这些细胞 以显示出当与对照相比时，本发明的组合物增加了脂肪细胞中的葡萄糖摄取。
[0400] 细胞培养和分化
[0401] 在37°C下于5 % CO2气氛中，将3T3-L1前成脂肪细胞在含有1 %青霉素-链霉素 (PS)和10%牛血清的DMEM中培养。为诱导分化，将融合2天后的前成脂肪细胞在MDI分 化培养基I (含有1 % PS、10% FBS、0. 5mM IBMX、I y M地塞米松、0. 5 y g/mL胰岛素的DMEM) 中培养2天。通过脂肪形成标记物的表达和脂肪滴的外观对分化进行测量，所述分化通常 在4天至8天之间完成。
[0402] 葡萄糖摄取活性试验
[0403] 通过测量放射性标记的葡萄糖的摄取对葡萄糖摄取活性进行分析。用无血清的 DMEM对在12孔板中生长的分化的3T3-L1脂肪细胞漂洗两次，并在37°C下用含有0. 1 % BSA 的 ImL 的 DMEM 孵育 2 小时。用 Krebs-Ringer-HEPES(KRH)缓冲液（2〇mM HEPES、pH L 4、 136mM NaCl、4.7mM KCl、1.25mM MgS04、1.25mM CaCl2、2mg/mL 牛血清白蛋白）漂洗细胞三 次，并在37 °C下用0. 9mL的KRH缓冲液孵育30分钟。
[0404] 接着，使用药物或不使用药物对细胞孵育不同的时间，以评价药物的短期作用和 长期作用。
[0405] 为评价药物的短期作用，在37°C下用本发明的药物孵育细胞4小时。为评价本发 明的药物的长期作用，在试验前一天，使用药物或不使用药物，将细胞预孵育16小时。一天 之后并在试验之前，漂洗细胞，并在测试分子存在的情况下孵育细胞4小时以上。
[0406] 通过加入0.1 mL含有2-脱氧-D-[3H]葡萄糖（37MBq/L)和葡萄糖（ImM)的KRH缓 冲液起始葡萄糖的摄取。20分钟之后，通过用冷的PBS漂洗细胞三次，终止葡萄糖的摄取。 通过在37°C下用0. 7mL的Triton X-100孵育细胞20分钟，使细胞裂解。使用闪烁计数器 确定细胞裂解物中的放射性水平。
[0407] 通过衍生自Lowry法的比色试验进行蛋白质定量。
[0408] 结果以nmol的掺入葡萄糖/5mn/mg蛋白质和对照或基础状态（100% )的％表示。
[0409] 结果
[0410] 本发明的药物能够提高脂肪细胞中的葡萄糖摄取。例如，图7、图12和图8中示出 了在分别通过喷托维林（〇? I UM，+58% )和吡贝地尔（10nM，+68% )进行短期孵育、或通 过阿米三嗪（I UM，+69% )进行长期孵育后，提高了分化的3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄 取。
[0411] 1. 3. 4在TNFa诱导的胰岛素抵抗3T3-L1分化的脂肪细胞中的葡萄糖摄取
[0412] 为评价本发明的药物在胰岛素抵抗条件下改善脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力，用 TNF-a对细胞进行预处理。一旦TNF-a曝露，预期葡萄糖的摄取将响应于胰岛素而减少。 相比之下，在用TNF-a和乙酰水杨酸处理3T3-L1细胞之后（阳性对照），预期到响应于胰 岛素的葡萄糖摄取将增加。
[0413] 细胞培养和分化
[0414] 在37°C下于10% CO2气氛中，将3T3L1成纤维细胞保持在补充有5%牛血清供体、 5%新生牛血清、lOOU/mL青霉素和lOOyg/mL链霉素的DMEM 4. 5g/L葡萄糖中。使细胞 在24孔板中以2560细胞/孔的密度于0. 5mL生长培养基（补充有10 % FCS、lOOU/mL青 霉素和100 y g/mL链霉素的DMEM 4. 5g/L葡萄糖）中生长。在所述板中培养5天后（90% 融合），在含有10% FBS、IBMX 100 y M、地塞米松0. 25 y M和胰岛素170nM的DMEM 4. 5g/L 葡萄糖中进行脂肪细胞分化的诱导。两天后，移除诱导培养基，并用含有10% FBS和胰岛 素170nM的DMEM 4. 5g/L葡萄糖进行替换。两天后，替换为新鲜的培养基。三天后，将脂肪 细胞在禁食培养基（含有〇. 2SVF、lOOU/mL青霉素、100 y g/mL链霉素的DMEM 4. 5g/L葡萄 糖）中孵育过夜。然后，在含有10% FBS的DMEM 4. 5g/L葡萄糖中，用H2O或5ng/mL的大鼠 TNF-a (Peprotech，400-14)对细胞处理48h。每天更新培养基。如下所述，在不同条件下 对葡萄糖摄取进行试验：在胰岛素（IOOnM)存在或不存在的情况下，进一步用含有或不含 有 5ng/mL TNF- a 的 〇. 1 % DMS0、或含有 5ng/mL TNF- a 和 5mM 乙酰水杨酸的 0. 1 % DMS0、 或含有5ng/mLTNF-a和IOOnM胰岛素的0. 1%DMS0、或含有5ng/mLTNF-a的测试化合 物对脂肪细胞处理24h。
[0415] 葡萄糖摄取活性试验
[0416] 在用2-脱氧-D_[1，23H]葡萄糖进行的孵育步骤5min之后，通过对掺入的放射性 标记葡萄糖进行定量，对葡萄糖摄取进行测量。通过在冰冷的PBS IX中的两个漂洗步骤， 抑制葡萄糖摄取。然后，在0.1 N NaOH中溶解30分钟。然后，在加入600 yL/孔的闪烁体 (Optiphase SuperMix3)之后，通过使用MicroBeta计数器，对细胞相关的放射性进行计 数。
[0417] 同时，通过衍生自Lowry法的比色试验确定蛋白质定量。结果以nmol的掺入葡萄 糖/5mn/mg蛋白质和对照或基础状态（100% )的％表示。
[0418] 为评估细胞存活力，通过使用商业化的试剂盒（ABS pentra LDH IFCC CP，Ref. A11A01871)的UV方法，在上清液上进行LDH活性测量。非常简要地说，LDH通过将乳酸氧 化为丙酮酸而将NAD +还原为NADH。通过对340nm处的吸收进行测量，对所产生的NADH进 行评价。作为细胞毒性的结果，所产生的NADH的量与释放在培养基中的LDH的量成正比。 细胞存活力的结果以对照或基础状态（100% )的％表示。
[0419] 结果
[0420] 在胰岛素抵抗的模拟条件下，本发明的药物在单独测试时提高了脂肪细胞中的葡 萄糖摄取。例如，图18、图19、图20和图21显示出在通过托拉塞米（在0. 37nM下为+121%， p〈0. 05 ;在 InM和 3. 3nM下分别为+123%和+129%，p〈0. 01)、艾芬地尔（在 I yM为+140%， p〈0. 01 ;在IOnM和IOOnM下有改善，未示出）、芬司匹利（在InM下为+130%，p〈0. 01 ;在 0.37nM和3.3nM下有改善，未示出）和托芬那酸（在IOnM下为+127%，p〈0.01 ;在IOOnM 和IyM下所改善，未示出）的长期温孵育之后，通过TNF-a诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂 肪细胞进行的葡萄糖摄取显著提高。
[0421] 第1. 3节的结果表明，本发明的药物在改善正常肌细胞和脂肪细胞中的葡萄糖摄 取、以及在胰岛素抵抗模拟条件下的葡萄糖摄取中有效。
[0422] 1. 4通过肝细胞进行的葡萄糖生产
[0423] 细胞培养和分化
[0424] 在胶原酶存在的情况下，通过非原位肝灌注，将肝细胞从禁食24小时的雄性 Wistar大鼠（200g-250g体重）中分离。通过台盼蓝拒染试验对细胞的存活力进行验证。然 后，将细胞悬浮在补充有胰岛素的William' s培养基中，接种至6孔板（8 XlO5细胞/孔） 上，并在37°C下于95%空气/5% CO2的潮湿气氛中孵育。在所述板培养后，移除培养基，并 将细胞在无葡萄糖的RPMI培养基（补充有用于长期评价的测试药物）中培养16小时。第 二天，在糖新生（neoglucogenic)底物（IOmM乳酸和ImM丙酮酸）和测试分子存在的情况 下，在Krebs-Ringer Bicarbonate HEPES缓冲液（KRBH ;pH 7. 4)中对肝葡萄糖产生测试进 行评估，持续4小时（短期）。
[0425] 葡萄糖的定量
[0426] 收集上清液，并使用葡萄糖氧化酶试剂盒（仪器实验室0018250840)，确定葡萄糖 浓度。同时，使用比色Lowry法进行蛋白质的定量。
[0427] 结果以nmol的葡萄糖/mg蛋白质和对照状态（KLP:含有乳酸和丙酮酸的KRBH) 的％表示。
[0428] 结果
[0429] 本发明的药物在单独测试时可减少通过肝细胞产生的葡萄糖。例如，图9、图 10和图11显示出在通过D-甘露糖（10yM，-22% )短期处理后、或者通过艾芬地尔 (0? 01 yM，-22%)或氮卓斯汀（10yM，-36%)长期处理后，由肝细胞产生的葡萄糖显著减 少。
[0430] I. 5分离的器官
[0431] 1. 5. 1分离的胰岛中的胰岛素和胰高血糖素的分泌
[0432] 用一系列浓度的葡萄糖孵育的分离的胰岛显示出胰岛素释放的剂量依赖模式。因 此，分离的胰岛的使用是考察候选化合物作为引发剂和胰岛素分泌增强剂的作用的生理途 径。
[0433] 组织的制备
[0434] 通过腹膜内（ip)注射氯胺酮/xylasine对大鼠进行麻醉。暴露腹膜腔，并在胰主 管至肠之间夹住。然后，经由总胆管对胰腺进行插管，用胶原酶进行膨胀并移除。对胰岛进 行摘取、洗涤，并在离心之前经过无菌不锈钢筛。然后，对胰岛进行清洗，并置于含有2mM谷 氨酰胺、10%胎牛血清和1%抗生素/抗真菌溶液的CMRL培养基中，放置在含有5% 0)2的 37 °C的培养室中。
[0435] 胰岛的灌注
[0436] 在37°C下用5% CO2将胰岛在含有10% FBS和3mM葡萄糖的RPMI1640培养基中 预孵育90分钟。然后，在37°C下，使对照组和治疗组的胰岛在具有恒定流速（500 y L/min) 的葡萄糖灌注系统中孵育90分钟。将胰岛在基础条件下（3mM葡萄糖）放置30min，在高葡 萄糖浓度（20mM)培养基中放置30min，最后再在基础条件下（3mM葡萄糖）放置30min。在 整个灌注过程中，从输出部分处收集培养基的样品，并在-80°C下冷冻。在灌注结束时，收获 胰岛并冷冻在-8〇°C下。使用酸乙醇（处于95%乙醇中的0. 18M HC1)对胰岛中的总蛋白 质进行提取。通过ELISA，实现对所收集的输出部分中的胞内胰岛素和胰高血糖素、或释放 的胰岛素和胰高血糖素的定量。
[0437] 1.5. 2分离的肌肉中的葡萄糖摄取
[0438] 肌肉的孵育程序
[0439] 在29°C下，将切出的滑车（印itrochlearis)在3mL连续充气（％% 02、5% CO2) 的预孵育培养基中孵育50分钟，所述预孵育培养基由Krebs-Henselheit碳酸氢盐缓冲液 (KHB)、8mM葡萄糖、32mM甘露醇和0. 1%的牛血清白蛋白（BSA)组成。在预孵育之后，将肌 肉转移至另外的小瓶中，并在29°C下，在3mL连续充气的洗出培养基中孵育10分钟，所述洗 出培养基由KHB、2mM丙酮酸、38mM甘露醇和0. 1% BSA组成。
[0440] 最后，在29°C下，将肌肉在3mL摄取培养基中孵育20分钟，所述摄取培养基由 KHB、2mM丙酮酸、6mM葡萄糖和32mM甘露醇、0. 1 % BSA组成，所述摄取培养基具有或不具有 280以(^/_)1[311]2-脱氧葡萄糖（2-06)和1(^(^/_)1[ 14(：]-甘露醇以及指定的处理。
[0441] 在孵育之后，立即将肌肉短暂地在用0. 9%盐水溶液浸湿的纱布上吸取，并在液氮 中冷冻夹紧。
[0442] 肌肉葡萄糖摄取的测量
[0443] 在摄取培养基中，在孵育的20分钟内，由2-DG进入肌肉纤维中的掺入速率对葡萄 糖的摄取进行计算。在60°C下，使冷冻的肌肉样品在ImL的IM KOH中消化20分钟。用ImL 的IM HCl将肌肉匀浆中和，并将300 y L加入闪烁混合物中。在LS-6000液体闪烁分光光 度计中，对二重复的样品的3H和14C进行计数。
[0444] 作为总肌肉2-DG和胞外空间2-DG之间的差，对肌肉2-DG的摄取进行计算。通过 组织中的[14C]-甘露醇的量确定胞外空间的2-DG浓度。
[0445] L 5. 3由分离的肝脏产生的葡萄糖
[0446] 离体灌注大鼠模型的模型使得能够对完整器官的直接作用进行研宄，而不受肝外 激素和其它代谢流的系统性改变的影响。
[0447] 组织的制备
[0448] 通过ip注射硫喷妥（50mg/kg)对大鼠进行麻醉。实施无血红蛋白的非循环灌注。 在门静脉和腔静脉插管之后，将肝脏放置于有机玻璃室中。灌注流体为在37°C下通过带有 同步温度调节的膜氧合器用氧气和二氧化碳（95:5)的混合物饱和的Krebs/Henseleit-碳 酸氢盐缓冲液（pH 7. 4)。由懦动泵提供的流量为30mL/min-33mL/min。在用无脂肪酸的牛 血清白蛋白补充Krebs/Henseleit-碳酸氢盐缓冲液之后，将候选化合物或溶媒加入至灌 注液以确保药物的充分溶解。对于药物的所有浓度，摩尔白蛋白/药物的比例等于2. 4。
[0449] 从氧气摄取速率和灌注流体从其表面的泄漏这两方面对经灌注肝脏的细胞存活 力进行判定。当氧气摄取下降至0.7 ymol mirTig'或者当表面流体泄漏超过门脉血流的 2. 5%时，丢弃肝脏。收集流出的灌注液体样品，并对所述样品的代谢物含量进行分析。通过 标准酶法程序对下列化合物进行分析：葡萄糖、乳酸和丙酮酸。采用特氟隆屏蔽的铂电极， 连续地对流出的灌注液中的氧气浓度进行监测，所述铂电极恰好位于灌注液出口处的有机 玻璃室中。由输入-输出差和总流速计算代谢率，并称为肝脏的湿重。
[0450] 1. 6结果的综合
[0451] 表4汇集了在所有先前描述的模型中获得的结果（参见上述I. 1至1. 5的点）。 值归因于各候选化合物，所述候选化合物取决于它们在不同的体外模型中相比于溶媒而言 的作用。将结果进行归一化和权衡，以产生各候选化合物的相对性能值。高的值反映了化 合物使葡萄糖水平正常化的高潜力，并因此反映了控制葡萄糖水平和/或治疗糖尿病或相 关紊乱的显著效力。
[0452]表 4
[0453]
[0454] 还在上述体外模型中对本发明的药物组合的效力进行了评估。在这些试验中所使 用的方案与上述第1部分相同。在下表5中列出的药物组合显示出特别高的相对性能值 (如上述所确定）。
[0455] 结果：
[0456] 将所有的药物组合详述于表5中，使得对血糖水平的正常化具有全球性的积极作 用，并因此认为是有效的糖尿病疗法。
[0457] 表5
[0458]
[0461] 2?体内研宄
[0462] 2. 1组合在Zucker糖尿病肥胖（ZDF)大鼠模型中的抗炎作用
[0463] 在Zucker糖尿病肥胖（ZDF)大鼠模型中，对本发明的包含表4和表5的化合物的 药物组合物的效力进行确认。Zucker糖尿病肥胖（ZDF)大鼠是基于通过引起胰岛素抵抗的 遗传的肥胖基因突变造成的葡萄糖耐量受损的2型糖尿病的精确模型。发生在ZDF大鼠中 的fa突变产生了缩短了瘦素受体蛋白，所述瘦素受体蛋白不能有效地与瘦素相互作用。该 突变在表型上表现为肥胖，同时血液中具有高水平的正常瘦素。
[0464] 已知的是，炎症在2型糖尿病和代谢综合征的病因中发挥作用。C反应蛋白（CRP) 的异常的高血浆水平与糖尿病和代谢综合征有关。已将ZDF大鼠用于对本发明的组合物针 对2型糖尿病的炎性成分的作用进行研宄。ZDF大鼠显示出增加的血浆CRP水平。
[0465] 饲养和长久治疗
[0466] 将大鼠单独饲养，并保持在22±2°C下的12小时亮/暗的循环下。动物随意获取 食物（Purina 5008)和水。一组接受溶媒，而其它各组分别用表5和表6中列出的候选化 合物处理4周。通过口服途径以一天两次进行给予。
[0467] 血液样品
[0468] 从所有组中的过夜禁食的大鼠的局部麻醉的尾部获取血液样品。
[0469] 血浆CRP水平的测量
[0470]根据制造商的建议（来自Millipore的ref CYT294)，通过ELISA试剂盒，对所有 大鼠（瘦大鼠（Lean rats)、经溶媒处理过的ZDF大鼠以及经巴氯芬-阿坎酸处理过的ZDF 大鼠）血浆中的CRP浓度进行测量。大鼠C反应蛋白（CRP)试剂盒是测量大鼠CRP的双多 克隆抗体夹心酶联免疫法（EIA)。将血浆的标准品、质量对照品和样品在包被有多克隆抗大 鼠CRP抗体的微量滴定孔中孵育30分钟。在彻底漂洗后，将标记有辣根过氧化物酶（HRP) 的多克隆抗大鼠CRP抗体加入至孔，并与固定化的抗体-CRP络合物孵育30分钟。接着，进 行另一洗涤步骤，使得剩余的HRP偶联抗体能够与底物和四甲基联苯胺（TMB)反应。通过 加入酸性溶液终止反应（5-10分钟），并在450nm处用分光光度计对得到的黄色产物的吸光 度进行测定。吸光度与CRP浓度成正比。通过绘制相对于标准品的CRP浓度的吸光度值构 建标准曲线，并使用该标准曲线确定未知样品的浓度。
[0471] 结果
[0472] 本发明的组合物有效地降低了 ZDF大鼠血浆中的CRP浓度。例如，图22示出了当 与经溶媒处理的ZDF大鼠相比时，通过阿坎酸和巴氯芬处理（分别为7. 5mg/kg和0. 5mg/ kg)的CRP浓度显著降低，并达到瘦大鼠的CRP水平。这些结果表明，本发明的组合具有全 身性抗炎作用。
[0473] 2. 2db/db小鼠模型中的葡萄糖稳态控制
[0474] 缺乏瘦素受体的db/db小鼠品系是用于评价靶向于糖尿病的化合物的众所周知 且特征性的小鼠模型。使用db/+杂合（heterozygotous)小鼠作为对照。
[0475] 适应期和预研宄期<