。将单核细胞用含20 %胎牛血清的RPMI 1640培 养基重悬，以I X IOfVmL密度接种，加入60ng/mL GM-CSF和30ng/mL IL-4,培养5-7天获 得imDC。收集细胞，用无血清的RPMI 1640培养基重悬，调整密度为2. 5X IO6AiL接种于 transwell上室中（8ym孔径），下室放入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基。实验设 为空白血清对照组，该制剂含药血清的高、中、低剂量组。对照组在下室中加入含或者不含 LPS(100ng/mL)的5%、10%和20%体积的大鼠空白血清，药物高、中、低剂量组在下室中加 入含或者不含LPS(100ng/mL)的5%、10%和20%体积的大鼠含药血清。经37°C孵育48小 时，用血细胞计数板计数迀移到下室中的细胞数量。
[0066] 结果：随着imDC分化成熟，其迀移能力降低（123. 33±49. 33vs 80.0 O±17. 32, P〈0. 05,见图2)。具体表现为与空白组相比，该制剂的高、中、低剂量均可显著降低 imDC 的迀移能力（90. 00±26. 46vs 40. 00±17. 32，P〈0. 05 ;123. 33±49. 33vs 53.33±11.55，P〈0.001 ;140.00±40.00vs 56.67±11.55，P〈0.001，见图 2)，但该制剂各 剂量对经LPS刺激的imDC没有影响，提示该制剂可抑制imDC的迀移能力。
[0067] 实施效果例3 :
[0068] 本发明提供的中药复方制剂对DC诱导淋巴细胞增殖能力的影响
[0069] 材料：CD14+磁珠购自 Miltenyi Biotec ;RPMI 1640 培养基购自 Hyclone Thermo Scientific ;胎牛血清购自 Biological Industries ;GM_CSF 与 IL-4 购自 R&D Systems ; LPS 购自 Sigma-Aldrich。anti_CD4+FITC 抗体和 7-AAD 抗体购自 BioLegend0
[0070] 方法：取健康志愿者的外周血，经梯度离心法获得外周血单个核细胞，用⑶14+磁 珠筛选出纯度达90%的⑶14+单核细胞。将单核细胞用含20 %胎牛血清的RPMI 1640培 养基重悬，以I X IOfVmL密度接种，加入60ng/mL GM-CSF和30ng/mL IL-4,培养5-7天获 得imDC。收集imDC，分为空白血清对照组，该制剂含药血清的高、中、低剂量组。对照组分 别加入含或者不含LPS (lOOng/mL)的5 %、10 %和20 %体积大鼠空白血清，药物高、中、低剂 量组分别加入含有LPS的5 %、10 %、20 %体积的含药血清。48小时后，将DC作为刺激细胞 (IX IO4AiL)，淋巴细胞（IXIO5AiL)作为应答细胞，二者以1:10的比例接种于24孔板中共 培养5天，再用100 y L PBS重悬，用anti-CD4+FITC和7-AAD的抗体标记淋巴细胞，最终用 流式细胞仪检测CD4+7-AAD-的细胞数量。
[0071] 结果：随着imDC分化成熟，其刺激同种异体T细胞增殖的能力也随之增 强（1142. 00± 10.0 Ovs 1760. 50±68. 50, P〈0. 001，见图 3)。研究发现该制剂的高、 中、低剂量可显著降低经LPS刺激的DC促进T细胞增殖的能力（1760. 50 ± 68. 50vs 1276. 00 ± 250. 00, P〈0. 001 ; 1641. 00 ± 138. OOvs 1024. 00 ±83. 00, P〈0. 001 ; 1752. 50±39. 50vs 1293. 50±33. 50，P〈0. 001，见图3)。提示该制剂能显著抑制DC介导的 淋巴细胞增殖作用。
[0072] 实施效果例4 :
[0073] 本发明提供的中药复方制剂对DC分泌细胞因子的影响
[0074] 材料：CD14+磁珠购自 Miltenyi Biotec ;RPMI 1640 培养基购自 Hyclone Thermo Scientific ;胎牛血清购自 Biological Industries ;GM_CSF 与 IL-4 购自 R&D Systems ; LPS购自Sigma-Aldrich。人IL-10酶联免疫试剂盒购自达科为。
[0075] 方法：取健康志愿者的外周血，经梯度离心法获得外周血单个核细胞，用⑶14+磁 珠筛选出纯度达90%的⑶14+单核细胞。将单核细胞用含20 %胎牛血清的RPMI 1640培 养基重悬，以I X IOfVmL密度接种，加入60ng/mL GM-CSF和30ng/mL IL-4,培养5-7天获得 imDC。收集imDC，分为空白血清对照组，该制剂含药血清的高、低剂量组。对照组分别加入 含或者不含LPS(100ng/mL)的10%、20%体积大鼠空白血清，药物高、低剂量组分别加入含 或者不含LPS(100ng/mL)的10%、20%体积的含药血清。48小时后，收集培养细胞的上清， 用酶联免疫试剂盒检测IL-10的含量。
[0076] 结果：IL-10是DCregs的特异性标志物之一。实验发现，与imDC对照组比较， 该制剂低剂量组能抑制DC分泌IL-10(127. 17±5. 52vs 110. 26±6. 14，P〈0. 01)。但与 经LPS刺激的imDC对照组比较，该制剂低剂量组可促进IL-10的表达（168. 52±4. 89vs 209. 29±8. 50, P〈0. 001，见图4)，提示该制剂可促进细胞因子IL-IO的分泌，为该制剂能将 DCs诱导分化为DCregs提供科学依据。
[0077] 实施效果例5 :
[0078] 本发明提供的中药复方制剂对DC表型的影响
[0079] 材料：CD14+磁珠购自 Miltenyi Biotec ;RPMI 1640 培养基购自 Hyclone Thermo Scientific ;胎牛血清购自 Biological Industries ;GM_CSF 与 IL-4 购自 R&D Systems ; LPS 购自 Sigma-Aldrich。anti_CD86 抗体、anti-CDllb 抗体、anti-HLA-DR 抗体、同型抗体 均购自 BioLegencL
[0080] 方法：取健康志愿者的外周血，经梯度离心法获得外周血单个核细胞，用⑶14+磁 珠筛选出纯度达90%的⑶14+单核细胞。将单核细胞用含20 %胎牛血清的RPMI 1640培 养基重悬，以I X IOfVmL密度接种，加入60ng/mL GM-CSF和30ng/mL IL-4,培养5-7天获 得imDC。收集imDC，分为空白血清对照组，该制剂含药血清的高、低剂量组。对照组分别加 入含或者不含LPS(100ng/mL)的5%、10%体积大鼠空白血清，药物高、低剂量组分别加入 含或者不含LPS(100ng/mL)的5%、10%体积的含药血清。48小时后，收集细胞，用IOOyL PBS 缓冲液重悬，加入 FITC 或 PE 标记的抗体（anti-CD86、anti-CDllb、anti-HLA-DR、同 型抗体），于4°C孵育20-30min，用流式细胞仪检测细胞标记的阳性率或平均荧光强度，用 FlowJo软件分析。
[0081] 结果：为了验证经药物作用后的DC是否呈现DCregs表型，我们选用anti-⑶86、 anti-⑶Ilb和anti-HLA-DR抗体标记细胞。根据表面分子的表达情况，发现经该制剂高、低 剂量作用后，imDC与经LPS刺激的imDC⑶86阳性细胞百分率均显著低于对照组（imDC组： 11.84±2. 97vs 24. 10±0. 70，P〈0. 001;16. 95±2. 05vs 39. 50±6. 20，P〈0. 001。imDC+LPS 组：65. 20±6. OOvs 75. 25±4. 15，P〈0. 01 ;56. 00±3. IOvs 75. 15±1. 75, P〈0. 001，见 图5A、B)。经该制剂高、低剂量作用后，imDC与经LPS刺激的imDC⑶lib阳性细胞 百分率高于对照组（imDC 组：9. 49±0. 08vs 3. 24±0. 74, P〈0. 001 ;10. 16±0. 95vs 5. 13±0. 99，P〈0. 001。imDC+LPS 组：7. 81±0. 18vs 1.79±0. 56，P〈0. 001;6. 64±0. 44vs 4. 91±0. 46, P〈0. 01，见图5A、B)。此外，经该制剂高、低剂量作用后，imDC与经LPS刺 激的imDC HLA-DR平均荧光强度显著低于空白血清组（imDC组：989. 00±72. OOvs 1540. 00 + 4