因子的TNF-a、IFN-y、IL-17A蛋白表达水平以及作为抗炎性细胞因子 的TGF-P和IL-10蛋白表达水平。实验结果显示，与对照组相比，伏立诺他治疗组能够抑 制TNF-a、IFN-y、IL-17A蛋白的表达量，IL-10表达水平得到提高，而TGF-表达水平基 本维持不变（如图9所示）。
[0243] 3. 6伏立诺他对视网膜中致病性巨噬细胞活性的抑制
[0244] 巨噬细胞渗出被认为是EAU病理中的一种基本损伤。巨噬细胞可能会增加视网膜 和脉络膜血管的通透性，破坏血视网膜屏障，导致更严重的细胞浸润。为了探究致病性巨噬 细胞是否能够被伏立诺他抑制，本研究通过ICC染色来检测效应细胞。结果显示，伏立诺他 治疗组的视网膜中巨噬细胞数量较少（如图10所示），进一步研究表明致病性巨噬细胞的 数量和活性都受到了抑制，同时在伏立诺他治疗组中几乎检测不到表达P65蛋白（红色） 的巨噬细胞（绿色）（如图11所示）。这与前文所述的TNF-a表达水平的下降是一致的 (如图9所示）。
[0245] 同时，对p65蛋白表达水平的westernblotting检测结果与上述染色检测结果一 致，即伏立诺他治疗组中的P65蛋白表达水平较之于对照组出现了显著下降（如图12所 示）。
[0246] 3. 7炎性细胞中NF-kB和STAT信号通路的抑制效应
[0247] 为了确定通过细胞哪种信号通路下调TNF-a、IFN-y、IL-17A等促炎性细胞因子 的表达，本研究利用westernblotting方法检测了STAT1、STAT3及其磷酸化物质还有p65 蛋白。结果显示，伏立诺他能够抑制STATl、p-STATl、STAT3的表达，p-STAT3的表达未发生 显著变化。如前文所述，伏立诺他能够显著降低P65蛋白的表达水平（如图12所示）。
[0248] 4 结论
[0249] 本研究于免疫后的第9天起，每日连续观察PBS组与治疗组小鼠眼底发病的情况 直至第21天，PBS组小鼠从第12天起开始出现发病迹象。在第21天对小鼠眼底损伤情况 的临床评分中。光学显微镜检查结果显示，PBS对照组小鼠视网膜可见渗出、血管炎、出血， 评分明显高于伏立诺他组，并且这种差异具有统计学意义。组织病理学检查，可见对照组小 鼠视网膜水肿增厚，玻璃体腔大量单核细胞浸润，而伏立诺他组小鼠玻璃体腔渗出较少，视 网膜结构更趋于正常。这些提示了伏立诺他对EAU有治疗性作用。
[0250] 以上实验结果揭示了伏立诺他对视网膜血管屏障所起到的保护作用。视网膜染色 图像显示在PBS对照组中可见伊文思蓝广泛弥散地从视网膜血管渗漏至周围血管间隙中， 这提示了EAU免疫病理损伤介导下的视网膜血管通透性的增加和血-视网膜屏障的破坏。 而应用伏立诺他干预的EAU小鼠未见到明显的荧光漏，说明治疗组小鼠的视网膜和脉络膜 血管受到了保护。眼内微血管通透性的维持和血管屏障的完整性主要依赖于BRB紧密连接 蛋白的完整性，亦即Z0-1，occludin-1以及claudin-5这3个紧密连接蛋白的表达量。免疫 荧光结果显示，伏立诺他治疗小鼠紧密连接蛋白claudin-5的表达量明显增多，另外，本研 究测定了两组小鼠视网膜紧密连接蛋白mRNA表达量，且发现伏立诺他组小鼠表达量升高。 这与以上结果所见的荧光渗漏改变表现出一致性。
[0251] 本研究通过流式细胞技术检测了PBS组和伏立诺他组小鼠脾脏的T淋巴细胞表型 的分类情况。⑶4+Thl细胞以及⑶4+Thl7细胞在PBS组小鼠的脾脏中明显克隆增殖并占据 优势，而在伏立诺他治疗组中这两类细胞亚群的增殖得到了有效控制。这表明伏立诺他通 过减少炎症性细胞的浸润来缓解EAU的严重程度，也就是说，通过下调能够产生IFN-y和 IL-17的淋巴细胞的数量来起到对小鼠眼内组织的保护作用可能是伏立诺他治疗EAU的机 制之一。
[0252] 本研究发现在EAU模型中，随着Thl和Thl7细胞的克隆增殖，⑶62L+的T细 胞数目处于明显的下降趋势，说明体内免疫系统的广泛激活和大量初始T淋巴细胞的活 化。而伏立诺他能够抑制和延缓这种非正常性的T细胞激活，在治疗组小鼠的脾脏中可见 ⑶4+⑶3+⑶62L+的T细胞较PBS对照组有显著地增长，这从另一个角度体现了伏立诺他能够 抑制过度激活的免疫系统并使其沉默，起到维持机体免疫稳态的作用。
[0253] 由于自身免疫性疾病的发生和发展在一定程度上取决于⑶4+⑶25+Foxp3+的自然 调节性T细胞负性调节能力的异常或被抑制，因此本研究考察了EAU发病过程中nTreg细 胞数量的变化和伏立诺他是否对该T细胞亚群产生影响。以上的结果证实了伏立诺他对于 自身免疫性疾病的免疫调理作用不仅在于减少前两类效应T淋巴细胞亚群对于组织的损 伤作用，更重要的是它可以活化nTreg细胞，重建效应T细胞和调节性T细胞之间的免疫平 衡，从而修复机体的自身免疫稳态，发挥免疫调理作用。
[0254] 流式细胞术的结果显示，破坏性T细胞的克隆表达被伏立诺他有效控制。本研究 进一步利用WesternBlotting检测了刺激原始T细胞向Thl细胞分化的转录因子STAT-1， 以及刺激其向Thl7细胞分化的转录因子STAT-3的表达。以上的结果表明，伏立诺他能够抑 制STAT-1及STAT-3的表达量。磷酸化的STAT-1及STAT-3的表达同样被伏立诺他抑制。 因此有理由相信，抑制效应T细胞分化过程中的信号通路是伏立诺他抑制自身免疫性疾病 的作用机制之一。
[0255] 本研究通过免疫组织化学染色和免疫荧光染色表明，巨噬细胞的激活被伏立诺他 抑制。伏立诺他组小鼠视网膜巨噬细胞浸润较少。由于受到IkB的抑制，存在于细胞胞浆 内的NF-kB处于静止状态。IkB降解后，p50/p65被释放，进入细胞核，活化固有免疫和 炎症反应中起重要作用的细胞因子的转录基因。这一信号转导通路在很多炎性分子（包括 TNF-a)的活化中起到重要作用。伏立诺他能够抑制视网膜中表达P65的巨噬细胞，抑制 TNF-a的表达量。另外，以上结果还还表明，伏立诺他组小鼠视网膜p65表达量显著降低。 综上，有理由认为伏立诺他能够通过降低P65表达水平，减弱巨噬细胞活性，减少p65进入 细胞核，抑制TNF-a的转录。
[0256]综上所述，伏立诺他是治疗EAU模型的有效药物，对于缓解疾病的发生，限制症状 的发展，有着确切的疗效。因此，本研究充实了HDAC抑制剂伏立诺他在治疗自身免疫性疾 病中的疗效价值，尤其是在眼科免疫炎症性疾病的应用这一空白领域得到了一定的扩展。 具体来看，伏立诺他抑制Thl、Thl7细胞，促进Treg细胞，抑制巨噬细胞活性，从而缓解EAU。 伏立诺他的抗炎症作用依赖于对STAT及NF-kB通路的调节。本研究为HDAC抑制剂，如伏 立诺他等，用于治疗炎症性疾病，如葡萄膜炎，提供了证据。
[0257] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 伏立诺他用于制备免疫调节药物的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是抑制STAT-I信号通路 的药物。3. 根据权利要2所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是通过抑制STAT-I信号通 路而抑制初始T细胞向Thl淋巴细胞分化的药物。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是抑制STAT-3信号通路 量的药物。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是通过抑制STAT-3信号 通路而抑制初始T细胞向Thl7淋巴细胞分化的药物。6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是上调⑶4 +⑶25+Foxp3+ 的nTreg细胞数量的药物。7. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是抑制NF-KBP65表达 的药物。8. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是上调紧密连接蛋白 claudin-5表达量的药物。9. 根据权利要求1~8任一项所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是自身免疫 疾病治疗药物。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述自身免疫疾病是自身免疫性葡萄膜 炎。
【专利摘要】本发明提供了伏立诺他用于制备免疫调节药物的应用。本研究通过大量实验确定了伏立诺他的新性质，这些新性质包括：伏立诺他可抑制STAT-1和STAT-3信号通路，从而抑制初始T细胞向Th1、Th17淋巴细胞分化，进而降低IFN-γ和IL-17表达量；伏立诺他可上调CD4+CD25+Foxp3+的nTreg细胞数量；伏立诺他可抑制NF-κB？P65的表达，从而抑制TNF-α表达量，进而缓解巨噬细胞的浸润；伏立诺他还可以上调紧密连接蛋白claudin-5的表达量，从而修复血视网膜屏障损伤。基于以上性质，确定了伏立诺他作为免疫调节药物的新用途，并进一步确定了其用于自身免疫性葡萄膜炎治疗药物的用途，实验表明伏立诺他对自身免疫性葡萄膜炎疗效确切，具有全新的治疗通路且无副作用，具备良好的应用前景。
【IPC分类】A61P37/02, A61K31/167, A61P27/02
【公开号】CN105055386
【申请号】CN201510493232
【发明人】颜华, 孟祥达, 方思捷, 刘媛媛, 郑芳, 张竹红
【申请人】天津医科大学总医院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月12日