牛磺酸在制备抗病毒药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及牛磺酸的用途，特别是涉及牛磺酸在制备抗鲤春病毒血症病毒或斑点叉尾鮰病毒药物中的应用。
【背景技术】
[0002]趣春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus，SVCV)，隶属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)、水疱性口炎病毒属(Vesiculovirus)，引起的鲤春病毒血症是一种急性、出血性并有严重传染性的疾病，被国际兽疫局(OIE)列为必须申报的疾病，中国农业部也将之列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》(2008)中的一类动物疫病。
[0003]斑点叉尾鮰病毒(CCV)隶属于疱疹病毒目(Herpesvirales)、鱼类疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、鮰鱼疱疹病毒属(Ictalurivims)，具有囊膜的双链DNA病毒。导致的斑点叉尾鮰病毒病可造成养殖场中鱼苗和鱼种的大量死亡，被国际兽疫局(OIE)列为必须申报的疾病，中国农业部也将之列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》(2008)中的二类动物疫病。
[0004]由上述病毒引起的疾病对我国水产养殖业危害巨大，暂时没有有效的药物和治疗方法，一旦爆发会对水产养殖业造成巨大的损失。寻找抗鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒的药物显得尤为重要和紧迫。
[0005]牛磺酸(Taurine)又称β -氨基乙磺酸，最早由牛黄中分离，现已工业合成。牛磺酸纯品为无色或白色斜状晶体，无臭。牛磺酸化学性质稳定、不溶于乙醚等有机溶剂，是一种含硫的非蛋白氨基酸。牛磺酸在体内以游离状态存在，与胱氨酸、半胱氨酸的代谢密切相关，主要依靠外源食物摄取。
[0006]目前已知:牛磺酸能清除羟自由基，抗脂质过氧化；参与细胞膜磷脂代谢、保护其免受降解JtCa2+起到双向调节作用，从而保护细胞膜的完整性、保持其功能；又可减少心肌酶漏，减轻细胞内钙超载，稳定线粒体膜电位，减少细胞凋亡和死亡；对急性心肌缺血也有一定的保护作用。牛磺酸作为药物已经被应用于强肝利胆、解热抗炎、保护视网膜等；作为保健品，其有促进免疫和保护神经细胞的作用。然而，尚未见其有抗鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒等水生动物病毒的报道，因此发明人对牛磺酸是否具有抗鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒进行了研究，发现其可以显著抑制这两种病毒的复制，在有效浓度下对细胞安全无毒，因此其作为抗水生病毒药物开发意义重大。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供牛磺酸在制备治疗或预防鲤春病毒血症病毒病药物中的应用，包括牛磺酸在体外抑制鲤春病毒血症病毒中的应用。
[0008]本发明的另一个目的在于提供牛磺酸在制备治疗或预防斑点叉尾鮰病毒病药物中的应用，包括牛磺酸在体外抑制斑点叉尾鮰病毒药物中的应用。
[0009]本发明的最后一个目的在于提供牛磺酸在制备同时治疗或预防抗鲤春病毒血症病毒病和斑点叉尾鮰病毒病药物中的应用。
[0010]为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施:
[0011]本发明以牛磺酸进行了细胞水平的抗病毒实验，分别用一定浓度的牛磺酸预处理FHM细胞和CCO细胞，再以0.1MOI的鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒感染，24h后检测病毒的复制水平。结果显示，细胞经牛磺酸处理后，这两种病毒的复制水平极显著降低，说明牛磺酸具有抑制鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒等水生病毒的作用。细胞毒性实验显示所使用浓度的牛磺酸对FHM和CCO细胞均没有毒副作用，可以作为鲤春病毒血症病毒病和斑点叉尾鮰病毒病的治疗剂和预防剂。
[0012]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0013]1.本发明首次发现牛磺酸可用于水产领域病毒的防治，为治疗鲤春病毒血症病毒病和斑点叉尾鮰病毒病提供了新的治疗途径和手段。
[0014]2.牛磺酸可以抑制SVCV的复制，也可以抑制CCV，存在浓度依赖性，且对细胞无毒，是一种低毒高效的抗病毒药物。
[0015]3.利用现代常用药物制剂手段，可将牛磺酸作为活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。
【附图说明】
[0016]图1是本发明实验中所采用浓度牛磺酸对FHM细胞的毒性实验结果。
[0017]图2是本发明实验中所采用浓度牛磺酸对SVCV的抑制实验结果。
[0018]图3是本发明实验中所采用浓度牛磺酸对CCO细胞的毒性实验结果。
[0019]图4是本发明实验中所采用浓度牛磺酸对CCV的抑制实验结果。
【具体实施方式】
[0020]下面通过实例具体说明本发明所述牛磺酸的应用。这些实施例仅对本发明进行说明，而不是对本发明进行限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。
[0021]实施例1:
[0022]牛磺酸对细胞毒性实验
[0023]采用MTT法检测药物毒性，具体方法:收集对数生长期的胖头鲤细胞(Fat headminnow cell, FHM)细胞或CCO细胞(斑点叉尾鮰卵巢细胞)，调整细胞悬液浓度，将其加入到96孔板中，每孔加入200 μ L培养液，细胞密度在1000-5000/孔，边缘孔用无菌PBS填充；5%C02，28°C孵育至细胞贴壁后(约6-8h)即可加入浓度梯度的牛磺酸，每一梯度设6个复孔，继续孵育48h，倒置显微镜下观察细胞状态；每孔加入20 μ L MTT溶液(5mg/ml，即0.5% MTT)，继续培养4h后终止培养，小心吸尽孔内培养液；每孔加入150 μ L 二甲基亚砜，置于脱色摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪0D490nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率。
[0024]本实验同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相应浓度的溶剂、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
[0025]结果如图1所示，实验所采用的各浓度牛磺酸处理FHM细胞24h后细胞存活率与对照组相比没有显著性变化，表明所使用浓度的牛磺酸对FHM细胞没有毒性作用。
[0026]结果如图3所示，实验中所采用的各浓度牛磺酸处理CCO细胞24h后细胞存活率与对照组相比没有显著性变化，表明所使用浓度的牛磺酸对CCO细胞没有毒性作用。
[0027]实施例2:
[0028]牛磺酸在制备治疗或预防鲤春病毒血症病毒病药物中的应用，包括以下步骤:
[0029]接种FHM于12孔板，待长到70-80%单层后，吸弃培养液，加入含有60mM、30mM、15mM、7.5mM牛磺酸和PBS的完全培养液预处理6h，吸弃培养液，用0.1MOI的SVCV 100 μ L吸附细胞，28°C孵育lh，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度牛磺酸和PBS的完全培养基，28°C、5% C02培养箱中继续培养24h (每一个浓度处理都设置三个独立重复组)。24h后收集细胞提取总RNA，反转录后荧光定量检测SVCV-G基因表达水平。定量检测SVCV-G基因的引物序列为 TGCTGTGTTGCTTGCACTTATYT/TCAAACKAARGACCGCATTTCG。SVCV 共编码核蛋白(N)、磷蛋白⑵、膜蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA聚合酶(L-蛋白)等5个结构蛋白，其中由G基因编码的糖蛋白决定SVCV的宿主范围，同病毒毒力相关，常作为病毒载量的检测靶标。
[0030]结果如图2所示，与对照组相比，当牛磺酸浓度为30mM时SVCV-G基因的表达显著降低(P < 0.05)，较对照组下降32.64%。当牛磺酸浓度为60mM时基因表达量极显著降低(P <0.01),较对照组下调84.79%。表明牛磺酸可以抑制SVCV的复制，其EC50为35.95mM。表明牛磺酸可以抑制SVCV的复制，并具有浓度依赖性。
[0031]实施例3:
[0032]牛磺酸在制备治疗或预防斑点叉尾鮰病毒病药物中的应用，包括以下步骤:
[0033]接种CCO细胞于12孔板，待长到70-80%单层后，吸弃培养液，加入含有60mM、30mM、15mM、7.5mM牛磺酸和PBS的完全培养液预处理6h，吸弃培养液，用0.1MOI的CCV100 μ L吸附细胞，28°C孵育lh，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度牛磺酸和PBS的完全培养基，28 °C、5 % C02培养箱中继续培养24h (每一个浓度处理都设置三个独立重复组)。24h后收集细胞提取总RNA，反转录后荧光定量检测CCV-0RF46基因表达水平。定量检测CCV-0RF46 基因的引物序列为 GTCTATTTTGGAGGCTGC/ATTCGGGTTATCGGTGGC。CCV-0RF46 编码CCV的主要结构蛋白，同病毒的入侵相关，常作为病毒载量的检测靶标。
[0034]结果如图4所示，与对照组相比，当牛磺酸浓度为15mM时CCV的复制水平显著降低(P < 0.05)，较对照组下调46.63%,当牛磺酸浓度为30mM和60mM时CCV的复制水平极显著降低(P < 0.01)，较对照组分别下调48.96%和64.82%。结果表明牛磺酸处理CCO细胞后可以显著提高细胞抗CCV效果，并具有浓度依赖性。
[0035]通过上述实验证明，牛磺酸显著降低鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒的复制水平，对FHM细胞和CCO细胞安全无毒。牛磺酸可以用于制备预防和治疗鲤春病毒血症或/和斑点叉尾鮰病毒病的药物。
【主权项】
1.牛磺酸在制备治疗或预防鲤春病毒血症病毒病药物中的应用。2.牛磺酸在体外抑制鲤春病毒血症病毒中的应用。3.牛磺酸在制备治疗或预防斑点叉尾鮰病毒病药物中的应用。4.牛磺酸在体外抑制斑点叉尾鮰病毒药物中的应用。5.牛磺酸在制备同时治疗或预防抗鲤春病毒血症病毒病和斑点叉尾鮰病毒病药物中的应用。6.根据权利要求1或3或5所述的应用，所述的药物为任何一种医学上可接受的剂型。
【专利摘要】本发明提供了牛磺酸在制备抗病毒药物中的应用，包括牛磺酸在制备治疗或预防鲤春病毒血症病毒病药物中的应用，包括牛磺酸在制备治疗或预防斑点叉尾鮰病毒病药物中的应用。通过以一定浓度的牛磺酸预处理FHM细胞和CCO细胞，再以0.1MOI的鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒感染，24h后检测病毒的复制水平。结果显示，细胞经牛磺酸处理后，这两种病毒的复制水平极显著降低，说明牛磺酸具有抑制鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒等水生病毒的作用。细胞毒性实验显示所使用浓度的牛磺酸对FHM和CCO细胞均没有毒副作用，可以作为鲤春病毒血症病毒病和斑点叉尾鮰病毒病的治疗剂和预防剂。
【IPC分类】A61P31/14, A61K31/185, A61P31/20
【公开号】CN105055387
【申请号】CN201510422970
【发明人】袁军法, 邵军辉
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月18日