柴胡总皂苷及其单体皂苷在制药中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于药物技术领域。具体的说，本发明涉及从中药柴胡中提取分离获得柴 胡总皂苷及其单体皂苷，它们在制备预防和治疗肥胖症的药物中的应用。
【背景技术】：
[0002] 肥胖症（obesity)是指身体中含有过多的脂肪组织，一般在成年女子身体中脂肪 含量超过30 %，成年男子超过20 %~25 %，即可确认为肥胖症。肥胖症与高血压、高血脂、 糖尿病等多种疾病的发生具有密切的关系，它对健康的影响使得很多国家将其列为可预防 性死亡的病症。现在市场上销售的减肥药物主要通过食欲抑制、增加能量消耗和抑制肠道 消化吸收等方面来发挥作用，比如西布曲明（sibutramine)、奥利斯他（orlistat)等。然 而，这些药物的毒副作用限制了它们的应用。天然产物由于结构复杂多样，从中寻找高效 低毒、作用靶点新颖的先导化合物已经成为新型减肥药物研发的重要组成部分并已取得了 一定成果（RayalamS?等，J.Nutr.Biochem.，2008, 19:717-726;YunJ.W.Phytochemist ry,2010, 71:1625-1641.) 〇
[0003] 5-轻色胺（5-Hydroxytryptamine5-HT)是一种对多种生理活动具有重要调节 作用的中枢神经系统递质，其受体根据结构不同分为14种亚型，其中分布在大脑海马区 的5-HT2e受体对食欲具有明显的调节作用。广泛的动物实验和基因分析表明5-肌1受 体可作为药物减肥作用的靶点。现有文献报道了一系列具有5-HT2e受体激动作用和减 肥作用的合成化合物，其中locarserin在2012年已经进入临床研究（Smith，B.M.等， J.Med.Chem.，2008, 51，305-313;WackerD.A?等，J.Med.Chem.，2007, 50:365-1379;Fevig J.M?等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，2013, 330-335)。现尚未有以 5-HT2C受体为作用靶点的 天然减肥药物的报道。
[0004] 柴胡（Bupleurumchinense)是伞形科柴胡属植物，根作为柴胡入药，其性味苦凉， 入肝胆经，具有和表解里、疏肝、升阳的作用。研究表明三萜皂苷、黄酮、木脂素、聚乙炔等是 主要化学成分。现在药理研究表明柴胡具有抗炎、免疫调节、抗病毒、保肝等多种药理活性 (Ashour,M.L?等?J.Pharm.Pharmacol.，2011，63:305-321)。但对于柴胡总阜昔或柴胡阜 苷单体类化合物对5-111^受体激动作用和食欲抑制作用方面尚未有文献报道，也没有它们 在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用的报道。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于提供柴胡总皂苷以及各类柴胡皂苷单体化合物在制备预防或 治疗肥胖症的药物中的应用，以它们为活性成分的预防和治疗肥胖症的药物组合物。
[0006] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0007] 柴胡总皂苷在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用。
[0008] 如所述的柴胡总皂苷在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用，其中所述的柴胡 总阜苷由下述方法制备而得：取柴胡BupleurumchinenseDC，粉碎，70 %EtOH回流提取 三次，合并提取液，浓缩至小体积，D101大孔树脂柱层析，依次用水、70%EtOH、EtOH洗脱； 70%EtOH洗脱部分Rp-18反相柱层析，1:9 - 10:0的Me0H-H20洗脱得柴胡总皂苷。
[0009] 如所述的柴胡总皂苷在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用，其中所述的应用 是柴胡总皂苷通过对5-HT2e受体激动作用和食欲抑制作用达到预防或治疗肥胖症。
[0010] 如所述的柴胡总皂苷在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用，其中所述的柴胡 提取液中柴胡总皂苷含量为20-70%重量，所述的应用是柴胡总皂苷通过对5-HT2e受体激 动作用和食欲抑制作用达到预防或治疗肥胖症。
[0011] 如所述的柴胡总皂苷在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用，其中所述的柴胡 总阜苷包括不低于〇? 1%重量的阜苷类化合物3-0-0 -D-fucopyranosylsaikogeninf(1)、 柴胡阜苷a(saikosaponina, 2)、6" -〇-乙酰化柴胡阜苷a(6" -〇-acetylsaikosaponin a, 3)、3"，6" -二-〇_ 柴胡阜昔a(3"，6" -di-〇_acetylsaikosaponina, 4)、柴胡阜昔 d(saikosaponind，5)、柴古月阜苷e(saikosaponine，6)、柴古月阜苷h(saikosaponinh，7)、 柴柴胡阜苷g(saikosaponing，8)，
[0012]
[0013] 如所述的柴胡总皂苷在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用，其中所述的柴胡 总皂苷包括不低于〇. 1 %重量的柴胡皂苷a。
[0014] 柴胡皂苷a在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用。
[0015] 如所述的柴胡皂苷a在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用，其中所述的柴胡 阜苷a由下述方法制备而得：取柴胡BupleurumchinenseDC，粉碎，70%Et0H回流提取 三次，合并提取液，浓缩至小体积，D101大孔树脂柱层析，依次用水、70%EtOH、EtOH洗脱； 70 %EtOH洗脱部分Rp-18反相柱层析，1:9 - 10:0的Me0H-H20洗脱得柴胡总皂苷；柴胡总 皂苷经硅胶柱层析，9:1的CHC13-MeOH洗脱，得柴胡皂苷a。
[0016] 如所述的柴胡皂苷a在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用，其中所述的应用 是柴胡皂苷a通过对5_HT2e受体激动作用和食欲抑制作用达到预防或治疗肥胖症。
[0017] 如所述的柴胡皂苷a在制备预防或治疗肥胖症的药物中的应用，其中所述的柴胡 皂苷a作为药物中唯一活性成分。
[0018] 预防或治疗肥胖症的药物组合物，其包含由下述方法制备而得的柴胡总皂苷，取 柴胡BupleurumchinenseDC，粉碎，70%EtOH回流提取三次，合并提取液，浓缩至小体积， D101大孔树脂柱层析，依次用水、70%EtOH、EtOH洗脱；70%EtOH洗脱部分Rp-18反相柱 层析，1:9 - 10:0的Me0H-H20洗脱得柴胡总皂苷，以及药学上可接受的载体，
[0019] 所述的柴胡总皂苷包括不低于0.1 %重量的皂苷类化合物 3-〇-0-D-fucopyranosylsaikogeninf(1)、 柴古月阜苷a(saikosaponina, 2)、 6" -〇_ 乙酰化柴胡阜苷a(6" -〇-acetylsaikosaponina, 3)、3"，6" -二-〇_ 柴胡阜苷 a(3"，6" -di-〇-acetylsaikosaponina, 4)、柴胡阜苷d(saikosaponind，5)、柴胡阜苷 e(saikosaponine, 6)、柴古月阜苷bi(saikosaponinbu7)、柴柴古月阜苷g(saikosaponin g，8)，
[0020]
[0021] 或，所述的柴胡总阜苷包括不低于0? 1 %重量的柴胡阜苷a(saikosaponina, 2)。
[0022] 或，包含以柴胡皂苷a作为唯一活性成分，以及药学上可接受的载体的预防或治 疗肥胖症的药物组合物。
[0023] 本发明柴胡总皂苷以及各类柴胡皂苷单体化合物用作药物时，可以直接使用，或 者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有〇. 1-99%，优选为0. 5-90%的本发明化合 物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0024] 所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药 物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注 射（静注、肌注）和口服两种形式给药。
[0025] 本发明采用各种方法，从柴胡根中分离得到柴胡总皂苷以及各类柴胡皂苷单体化 合物。经药理实验证明柴胡总皂苷以及各类单体化合物均具有5_HT2C受体激动活性和对大 鼠的食欲抑制、体重增长抑制活性。本发明从中药中提取有效成分，经药理实验证明可显著 抑制肥胖症的发生和发展。
【附图说明】：
[0026] 图1.柴胡中分离得到的部分化合物；
[0027] 图2.柴胡总皂苷对大鼠的食欲（A)和体重增长⑶抑制作用（n= 6)*与空白组 相比P〈0. 05 ;
[0028] 图3.saikosaponina(2)对大鼠的食欲（A)和体重增长（B)抑制作用（n= 6)* 与空白组相比P〈〇. 05 ;林与空白组相比P〈0. 01。
【具体实施方式】：
[0029] 下面将结合附图，用本发明的用本发明的试验例来说明柴胡总皂苷及单体皂苷对 5-111^受体的激动活性，以及柴胡总皂苷和主要成分saikosaponina(2)对大鼠的食欲抑 制、体重增长抑制活性作用结果，但不以此来限定本发明。
[0030] 试验例1 :
[0031] 1 ?材料和方法
[0032]1. 1材料：柴胡总皂苷和柴胡皂苷单体化合物；5-羟色胺（购于AlfaAesar)， HEK293 细胞（HDBiosciencesCo.Ltd，Shanghai，China),胎牛血清（GIBCO)，96 孔板 (GIBC0) ;|丐流检测试剂盒（HDBiosciencesCo.Ltd,Shanghai,China) ;Sprague_Dawley 大鼠（昆明医科大学实验动物中心）。
[0033] 1. 2 仪器：酶标仪Bio-RAD680 (美国）；C02培养箱ThermoForma3310 (美国）；倒 置生物显微镜)(D-101型（南京）。
[0034] 1. 3实验流程
[0035] 1. 3. 15_HT2C受体激动活性测试
[0036] 细胞培养：转染有受体的HEK293细胞接种在含10%胎牛血清的DuEM培养基中， 此操作在超净工作台上完成；接种完毕后放置于含5%C02，温度为37°C培养箱中培养至细 胞长满培养瓶内壁。铺板：吸去培养瓶内的培养基，用胰蛋白酶将细胞从培养瓶内壁上解尚 下来，后加入l〇ml培养基将细胞悬浮，接种在Matrigel包被的96孔黑壁透底细胞板上，每 孔100y1，控制其密度约为4X104/孔，此操作在超净工作台上完成；接种完毕后放置于含 5%C02，温度为37 °C培养箱中培养至细胞长满细胞板底部。
[0037] 细胞染色：弃去培养液，加入配置好的染色液（钙8免洗试剂盒：HBSS缓冲液 9680y1、丙磺舒100y1、化合物A20y1、化合物B200y1在避光条件下混合均匀），每孔 100y1，放置于37°C培养箱中lh。阳性药及供试药的配置：5-HT以HBSS缓冲液溶解稀释 至不同浓度作为阳性药；HBSS缓冲液作为空白对照；990y1的HBSS缓冲液和10y1DMS0 溶解的不同浓度样品作为供试药。吸取阳性药、空白组及供试药至96孔板上，每孔100y1， 每个样品重复3孔。
[0038]I丐流激动活性的测试：样品的激动活性在仪器FlexStation3Benchtop Multi-ModeMicroplateReader上检测完成（激发波长：485nm，发射波长：525nm，参比波 长：515nm，样品加样量：50y1/孔）。结