Peg原位共价接枝的海藻酸盐微胶囊及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及了一种海藻酸盐/聚阳离子微胶囊产品，具体地说是一种新型PEG原 位共价接枝改性海藻酸盐/聚阳离子微胶囊。
【背景技术】
[0002] 自20世纪60年代，Chang报道了半透膜微胶囊，指出用其包埋蛋白质、酶等生 物活性物质和细胞，可保持生物物质活性[ChangTMS.SemipermeabIemicrocapsules,Sc ience，1964, 146:524-525]。20世纪80年代初，Lim和Sun针对组织/细胞功能缺损性疾 病（如糖尿病），成功制备了海藻酸钠/a-聚赖氨酸（alginate/a-polylysine)半透膜 微胶囊（简称ct-APA微胶囊），包封Wistar大鼠胰岛细胞并移植入糖尿病WistarLewis 大鼠体内，分泌释放胰岛素以调控血糖量[LimF,SunAM.Microencapsulatedislets bioartificialendocrinepancreas,Science, 1980,210:908-910]。由此推动了 微囊化 技术相关材料和制备方法研究的快速发展，在细胞移植、药物释放和基因治疗等生物医 学领域的临床前研究中得到广泛应用[WangW,LiuXD,MaXJ,etal.Microencapsulation usingnaturalpolysaccharidesfordrugdeliveryandcellimplantation,J.Mater. Chem.，2006, 16:3252-3267]。随后，取自天然的多糖材料--壳聚糖由于成本低，成膜性能 好，膜机械强度高，而被研究者看好用于聚赖氨酸替代品，越来越多的用于细胞包埋用微胶 囊的制备[L.Baruch,M.Machluf,Alginate-chitosancomplexcoacervationforcellenc apsulation:Effectonmechanicalpropertiesandonlong-termviability,Biopolymer s82 (2006) :570-579]。但现有用于细胞包埋的海藻酸盐/聚阳离子微胶囊因其具有很大的 表面粗糙度和表面电荷，导致移植体内后易引起蛋白吸附，进一步激发机体纤维化反应，致 使移植体功能丧失。PEG(聚乙二醇英文名polyethyleneglycol的简称）由于具有良好的 亲水性、链段柔韧性、稳定的空间结构等优点，被广泛应用于生物材料的抗蛋白修饰领域。 目前通常采用的静电吸附、掺杂共混的方法实现PEG修饰微胶囊却存在稳定性差、排阻体 积小、无法形成PEG刷状结构等缺陷。
【发明内容】
[0003] 针对上述问题，本发明提出将PEG用于生物微胶囊的制备，发明了一种新型PEG原 位共价接枝的海藻酸盐-聚阳离子微胶囊产品，能够在保证微胶囊强度和免疫隔离性能的 前提下，利用点击化学的方法将高密度梳状结构的PEG通过共价键接枝到海藻酸盐-聚阳 离子微胶囊表面，从而起到抗蛋白吸附的效果，解决微胶囊体内移植后蛋白吸附及纤维化 问题。
[0004] 技术方案
[0005] 本发明的一种新型PEG原位接枝改性海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，其特征在于：微 胶囊内为含有活细胞的经叠氮化物接枝改性的海藻酸盐的液体或水凝胶环境；微胶囊表面 是由PEG原位共价接枝改性，表面海藻酸盐与PEG的质量比为10:1-1:100 ;微胶囊表面也 可以通过聚阳离子和海藻酸盐形成的聚电解质复合水凝胶膜后，再由PEG原位共价接枝改 性，表面海藻酸盐：聚阳离子：PEG的质量比为：10:1:1-1:10:100。
[0006] 其中，修饰后微胶囊产品为粒径100-1000微米的球形微胶囊；修饰后微胶 囊膜厚度在1-100微米；海藻酸盐接枝叠氮化物的分子量为IOkDa- 2000kDa(例 如：50kDa-200kDa;200kDa-500kDa;600kDa-1000kDa;1000kDa-2000kDa);海藻酸盐 接枝叠氮化物的接枝率为0.01 % -99.99 %。微胶囊膜中聚阳离子材料包括：壳聚 糖，其脱乙酰度为 80-98 %，分子量为lkDa-800kDa(例如：lkDa-5kDa; 10kDa-20kDa; 50kDa-100kDa;100kDa-800kDa) ;a-聚赖氨酸，分子量为 2kDa-500kDa(例如： 2kDa-10kDa;70kDa-150kDa;150kDa-300kDa;300kDa-500kDa) ;e-聚赖氨酸，分子量为 21^&-5001^^(例如：21^^-501^^ ;501^^-1001^^;1001^^-3501^^;3501^^-5001^^) ;聚 精氨酸，分子量为IkDa-500kDa(例如：lkDa-100kDa;100kDa-350kDa;350kDa-500kDa); 聚鸟氨酸，分子量为lkDa-500kDa(例如：lkDa-50kDa;50kDa-100kDa; 100kDa-350kDa; 350kDa-500kDa);聚组氨酸，分子量为lkDa-500kDa(例如：lkDa-50kDa;50kDa-100kDa; 100kDa-350kDa;350kDa-500kDa)。PEG-NH2 分子量为IOODa-1000 kDa(例如：100-5kDa; 5kDa-50kDa;50kDa-500kDa;500kDa-1000kDa) ,PEG-NH2 末端氨基的取代度为 10% -100%。 内核中海藻酸盐接枝叠氮化物的浓度在l-50g/L;内核中细胞含量IO2-IO9个细胞/ml内核 体积，活性保持90 %以上。
[0007] 微胶囊的内核中海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌，或者三价金属钆的叠氮化 物接枝海藻酸盐水凝胶，海藻酸盐溶液为叠氮化物接枝海藻酸的钾盐或钠盐溶液。
[0008] 所用的叠氮化物包括：1，2, 3, 4-四嗪、1，2, 4, 5-四嗪、1，2, 3, 5-四嗪以及 1，2,3,4_四嗪、1，2, 4, 5-四嗪、1，2, 3, 5-四嗪中任意一种在6-位取代有苯环基、氨基、酰 基、磺酰基等任意一种基团的四嗪衍生物。微胶囊中PEG原位共价接枝改性到微胶囊表面 海藻酸盐分子链上的产物反应式为：
[0009]
[0010]其中，PEG-NH2 的聚合度n为 2-2500,PEG-NH2 分子量为IOODa-1000 kDa,PEG-NH2 末端氨基的取代度为10% -100%。PEG-NH2利用酰胺化反应与含羧基的烯烃化合物反应得 到PEG-C=C，PEG-C=C的烯烃基修饰率为10% -100%。改性后的PEG-C=C通过烯烃 基与海藻酸盐上的叠氮基（Alg-N3)发生点击化学反应生成共价键，将PEG原位共价接枝到 微胶囊上，PEG的接枝率（每100个海藻酸盐羧基接枝的PEG百分数）为0. 01-99. 99%。
[0011] 其中，烯烃化合物修饰PEG中所使用的烯烃化合物包括：含有碳碳双键（-C= C-)、碳碳三键（-C=C-)的C2~C18的直链脂肪烯烃或炔烃，或含有碳碳双键（-C=C-)、 碳碳三键（-C=C-)的C4~C18的闭合环状脂肪烯烃或炔烃，以及上述任意一种脂肪烯烃 或炔烃中在脂肪碳链上有苯环基、酰氯基、氨基等任意一种基团取代的衍生物。
[0012] 微胶囊膜中聚阳离子材料包括：壳聚糖，其脱乙酰度为80-98 %，分子量 为lkDa_800kDa;a-聚赖氨酸，分子量为2kDa_500kDa;e-聚赖氨酸，分子量为 2kDa_500kDa;聚精氨酸，分子量为lkDa_500kDa;聚鸟氨酸，分子量为lkDa_500kDa;聚组氨 酸，分子量为lkDa-500kDa。微胶囊产品的膜成分中的海藻酸盐为叠氮化物接枝海藻酸的钾 盐或钠盐，接枝率〇. 01% -99. 99%;或者为海藻酸的钾盐或钠盐。
[0013] 上述的微胶囊可以是直接由经叠氮化物修饰后的海藻酸盐经螯合制备得到三维 凝胶珠，或者是外层再由海藻酸盐和聚阳离子两种高分子材料通过层层自组装形成聚电解 质复合水凝胶膜，再通过共价键将烯烃化合物修饰的PEG原位接枝到微胶囊表面暴露出的 叠氮基基团上。
[0014] 广品的具体制备步骤为：
[0015] 1)制备叠氮化物修饰海藻酸盐材料，其中，海藻酸盐接枝叠氮化物的分子量为 10kDa-2000kDa;海藻酸盐接枝叠氮化物的接枝率为0. 01% -99. 99%;
[0016] 2)制备海藻酸盐凝胶微球，即将步骤1)制备的材料配制成l_50g/L的海藻酸盐溶 液，然后通过锐孔挤出法、静电液滴法、乳化法等制备成海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球； 其中海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌，或者三价金属钆的经叠氮化物修饰后海藻酸盐 的水凝胶。
[0017] 3)将步骤2)中的A微球浸入到烯烃化合物修饰的PEG的溶液中，微球与PEG溶液 体积比的范围为1:1-1:40,反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37°C，此时得到微胶囊，称 之为B微球，即为表面由PEG原位共价接枝改性的海藻酸盐的水凝胶珠产品；取出用生理盐 水洗涤；
[0018] 烯烃化合物修饰PEG的配制方法是：烯烃化合物修饰PEG溶于生理盐水中、或pH 为5. 5-7. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液中、或PBS溶液中，烯烃化合物修饰PEG浓度为0.l-500g/ L；
[0019] 4)将步骤2)中的A微球浸入聚阳离子溶液中，A微