-GO-HA抗肿瘤药物组合物的制备及表征
[0044] 将Ti-GO-HA复合材料5mg，溶解于5ml水中搅拌30min，冰浴条件下探头超声 30min。5mg吲哚青绿溶解在水中，然后二者混合，冰浴条件下探头超声30min，室温搅拌过 夜，超纯水透析ld，离心（5000rpm)lOmin，冷冻干燥。
[0045] Ti-GO-HA抗肿瘤药物组合物中吲哚青绿含量的测定
[0046] 采用紫外分光光度法，于777nm波长处测定吲哚青绿的含量。以公式（1)计算样 品的载药量。载药量达到75%。
[0047]
[0048] 4、负载吲哚青绿的Ti-GO-HA抗肿瘤药物组合物的光疗活性测定
[0049] 体外抗肿瘤活性：将MCF-7乳腺癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细 胞。将MCF-7细胞培养在含胎牛血清（FBS) 10 %，青链霉素混合液1 %的RPMI1640培养基 中，培养箱条件为37°C、5%CO2，每2~3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓 度，96孔板每孔加入200y1，铺板使待测细胞调密度至5XIO3个/孔，（边缘孔用无菌PBS 填充）。置于5%C02, 37°C孵育24h，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度为 0、0. 1、0. 2、0. 5、1、2yg/ml的负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物，游离吲哚青绿为对照 组，设置复孔为4~6个，共分为6组，具体分组如下：（1)吲哚青绿组；（2)吲哚青绿-808nm 激光组；（3)Ti-GO-HA组；（4)Ti-G0-HA-808nm激光组；（5)负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物 组合物组；(6)负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物-808nm激光组；其中激光组放置在 808nm激光I. 5W中2min，保持光照过程中温度在37°C，光照结束后用铝箱包裹细胞版置于 CO2培养箱中孵育24h，对于不光照组而言，则直接用铝箱包裹细胞版置于CO2培养箱中孵育 24h，终止培养，SRB法测定抑制率。
[0050] 实验证明本发明中的Ti-GO-HA作为药物载体时能介导药物进入肿瘤细胞内部， 本身对肿瘤细胞的生长影响不大，但在近红外激光的照射下能够较好的抑制肿瘤细胞的增 殖；其负载吲哚青绿后，联合808nm激光，有协同抗肿瘤效果出现。
[0051] 体内抗肿瘤活性：取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后， 每只小鼠于腹腔注射0. 3ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用 生理盐水稀释成浓度为2X106个/ml的细胞悬液，皮下接种于小鼠右前肢上部。小鼠接种 肿瘤7d后，取其中36只肿瘤体积彡IOOmm3昆明小鼠，随机分为7组，每组6只。具体分组 如下：（1)对照组（NS组）：生理盐水；（2)吲哚青绿组；（3)吲哚青绿-808nm激光组；（4) Ti-GO-HA组；（5)Ti-G0-HA-808nm激光组；（6)负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物组； (7)负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物-808nm激光组。各组中吲哚青绿及Ti-GO-HA给 药剂量相等，吲哚青绿为5mg/kg，Ti-GO-HA为10mg/kg。7组均采用静脉给药的方式，其中 激光组功率均为I. 5W，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为2min。每2d给药一 次，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2d称其体重并使用游标卡尺 测量小鼠肉瘤的长径（A)与短径（B)，按公式肿瘤体积V=计算肿瘤体积。
[0052] 当给药Ti-GO-HA时，肿瘤体积与生理盐水对照组相比无显著性差异，但结合近红 外激光后，肿瘤体积的增长明显变慢；负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物结合激光照射 时，小鼠的肿瘤体积的增加比起吲哚青绿注射液加激光照射得到了明显的抑制；所有组中 负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物-808nm激光组抑制肿瘤生长的效果最明显。
[0053] 5、负载吲哚青绿的Ti-GO-HA抗肿瘤药物组合物的近红外成像试验
[0054] 当小鼠的肿瘤体积达到IOOmm3时，将吲哚青绿溶液以及负载吲哚青绿的Ti-GO-HA 药物组合物水溶液200yL分别尾静脉注射进入荷瘤小鼠体内（每组3个小鼠），使小鼠 体内的吲哚青绿计量为2mg/kg。用同样的操作将200yL的PBS注射到另外三只小鼠体 内作为对照组。吲哚青绿的生物分布分析可在注射后的特定时间用小动物活体成像系统 (Maestro,美国）获得，在704nm激发波长和735nm过滤器中收集焚光，进行近红外成像试 验。
[0055] 结果显示与吲哚青绿溶液组相比，负载吲哚青绿的Ti-GO-HA抗肿瘤药物组合物 组在肿瘤区域的荧光信号明显增强，说明Ti-GO-HA具有显著的肿瘤靶向性，可实现抗肿瘤 药物的靶向传递。
[0056] 在做上述实验的同时，还采用其它近红外光源以及抗肿瘤药物盐酸阿霉素、紫杉 醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱和米托蒽醌做了相同或相类似的实验，均取得了相同和相类似 的结果，其它实验不再一一列举。实验表明，本发明易操作，方法稳定可靠，具有很强的实用 性，有实在临床意义，与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
[0057] (1)本发明提供的Ti-GO纳米材料，通过将二氧化钛与氧化石墨烯复合，可将二氧 化钛的吸收光谱拓展至可见及近红外光区，而且GO优异的电子传导能力可避免二氧化钛 中电子-空穴复合，同时GO独特的共辄结构及较大的比表面积可实现目标传递物的有效负 载，另外其在近红外光下的光热转换特性使得Ti-GO纳米材料在作为载体的同时，本身又 可作为光敏剂和光热治疗剂发挥多机制协同治疗的作用。
[0058] (2)本发明选择具有良好生物相容性、肿瘤细胞靶向性的天然多糖一一透明质 酸为修饰分子，以亚烷基二胺为连接臂，用一种简单经济和容易实现工业化生产的方法对 Ti-GO复合材料进行化学修饰，条件温和、反应简单、产率高；
[0059] (3)本发明提供的HA修饰的Ti-GO纳米复合材料结构较为简单，具有优良的生物 相容性、水溶性和稳定性，还能够实现肿瘤特异性靶向，并保留了氧化石墨烯的高效光热治 疗活性以及二氧化钛在近红外光区高效的光催化活性，实现了肿瘤靶向光热治疗联合光动 力治疗；
[0060] (4)本发明提供的HA修饰的Ti-GO纳米复合材料，物理负载抗肿瘤药物吲哚青绿 (ICG)，不仅可实现近红外照射下的肿瘤光疗，还可实现体内近红外成像监测模式下的肿瘤 治疗。
[0061] (5)采用近红外光作为光源，不仅组织穿透性强，而且对人体危害小，可用于人体 深部肿瘤的光学治疗，是治疗肿瘤药物上的一大创新，经济和社会效益巨大。
【主权项】
1. 一种有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料制备 方法，其特征在于，通过水热法合成二氧化钛-氧化石墨烯纳米材料，然后透明质酸以亚烷 基二胺为连接臂和二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料通过酰胺键化学连接，在水介质中 形成纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料，具体由以下步骤实现： (1) 合成二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料：称取0.25-0. 75g硫酸钛，溶于 10-30ml水中，加入80-240mg氧化石墨烯，搅拌4h，再加入0. 262-0. 786g十六烷基三甲基 溴化铵，搅拌12h，然后转移至反应釜中，120-150°C水浴反应48-96h，离心分离，除去水分， 得粗产物，将粗产物用去离子水和无水乙醇各洗涤5次，离子交换后抽滤，得滤饼，将滤饼 放入真空干燥箱中60-80°C干燥12-24h，350-450°C煅烧2-4h，得二氧化钛-氧化石墨烯纳 米复合材料； (2)合成氨化透明质酸：称取100_200mg透明质酸加入5-20ml溶剂中，50°C油浴溶 解，冷却至室温，再加入200-500mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、150-310mg 羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min进行羧基活化，得羧基活化的透明质酸溶液；冰浴下将 0. 5-2ml乙二胺缓慢滴入羧基活化的透明质酸溶液中，室温反应2-6h，再加入超过羧基活 化的透明质酸溶液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，析出的沉淀晶体即为氨化的透明质酸， 抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得氨化透明质酸； 所述的溶剂为水或乙醇； (3) 合成透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料，方法是：称取 45-120mg的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料，加入30-50ml溶剂分散成分散液，分别称 取346-841mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、206-610mg羟基琥珀酰亚胺加入 到分散液中，搅拌，室温活化反应l〇-18h，得活化反应液；称取50-150mg的氨化透明质酸， 加入IOml溶剂溶解，滴加到活化反应液中，室温搅拌反应8-24h，成反应液，再加入超过反 应液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，抽滤，得晶体，晶体透析冻干，得透明质酸修饰的二氧 化钛-