性(均为约69%)。
[0101] 所有其他研究的金属离子在10Pg/mlACE2的浓度时均具有显著更低的活性：补 充Fe2+和Μη2+的ACE2的活性在13%的范围内，并且Cu2+为9%。Fe3+、Mg2+以及金属离子耗 尽的ACE2是实际上失活的。
[0102] 有趣的是，均为lOPg/ml的Fe3+和Μη2+比含有Zn2+的ACE2活性明显更低，显示在 0. 625和1. 25Pg/ml的更低ACE2浓度时，当与Zn2+相比较时，实际上相同的比活性。
[0103] 实施例5 :ACE2活性的金属离子依赖性 rhACE2原液(如上文实施例1和2中制备）用细胞培养级别水稀释至1μΜ溶液。由 10mM原液制备具有1μΜ浓度的CuCl2、ZnCl2、NiCl2、MnCljPCaCl2的金属离子溶液。为 了达到酶与可溶性金属离子的等摩尔比，与1μΜ金属离子溶液的温育进行15分钟和80分 钟。对于酶促活性测试，将样品用相应的金属离子溶液稀释1:10,并且用MES-NaCl缓冲液 进一步稀释1:10。通过将在具有0.5μΜEDTA补充物的活性缓冲液中的50μL200μΜ底 物溶液加入50μL样品稀释物中，进行活性测试，并且立即通过荧光检测器AnthosZenyth 3100,系列号26001070进行测量，其中波长滤波器320nm用于激发和430nm用于发射。对 于每种rACE2样品，每个循环（1分钟)标绘测量的相对荧光单位（RFU)(参见图3和4)。为 了计算斜率值，每个曲线通过二阶多项式曲线（Y=BO+B1*X+B2*X~2)进行拟合。B1值 显示于下文。
[0104]表3: 1μΜ金属离子浓度，15分钟淵育：
[0105]表4: 1μΜ金属离子浓度，80分钟淵育：
[0106] 作为阴性对照，Ζη2+耗尽的ACE2是酶促失活的。Ζη2+温育的样品的比活性设为 100%。在80分钟温育后，用Cu2+ (112%)和Ni2+ (92%)达到可比较的活性。与Μη2+或Ca2+ 离子的温育导致显著更低的活性(至多40%)。
【主权项】
1. 一种血管紧张素转换酶2 (ACE2)多肽群体，其在活性位点中具有耗尽水平的Zn2+。2. 根据权利要求1的ACE2多肽群体，其中所述Zn2+:ACE2多肽的比小于1: 1，优选小于 彡 0· 99:1、彡 0· 98:1、彡 0· 95:1、彡 0· 92:1 或彡 0· 90:1。3. 根据权利要求2的ACE2多肽群体，其中所述Zn2+:ACE2多肽的比为< 0. 50:1、 < 0· 45:1、< 0· 40:1、< 0· 35:1、< 0· 30:1、< 0· 25:1、< 0· 20:1、< 0· 15:1、< 0· 10:1、 彡 0· 05:1、彡 0· 02:1 或彡 0· 01:1。4. 根据权利要求2或3的群体，其中所述比根据实施例4中所示的方法通过ICP-MS进 行测量。5. 根据前述权利要求中任一项的ACE2多肽群体，其中所述ACE2多肽是人ACE2多肽。6. 根据权利要求5的ACE2多肽群体，其中所述ACE2多肽的氨基酸序列由SEQIDNo: 1的氨基酸1至740、或SEQIDNo: 1的氨基酸18至740、或SEQIDNo: 1的氨基酸18至 615组成。7. 根据前述权利要求中任一项的ACE2多肽群体，其中所述ACE2多肽以二聚体形式存 在。8. 根据前述权利要求中任一项的ACE2多肽群体，其中所述ACE2多肽在独立地选自 下述的一个或多个位点处是糖基化的：SEQIDNO: 1的Asn53、Asn90、Asnl03、Asn322、 Asn432、Asn546、Asn690。9. 根据权利要求8的ACE2多肽群体，其中所述ACE2多肽具有按重量计大于20%的总 糖含量。10. 根据前述权利要求中任一项的ACE2多肽群体，其中所述活性位点基本上不含Zn2+。11. 根据前述权利要求中任一项的ACE2多肽群体，其中所述活性位点基本上不含任何 金属离子。12. 根据前述权利要求中任一项的ACE2多肽群体切割包含至少一种金属离子的溶液 中的ACE2底物的用途。13. 根据权利要求12的用途，其中所述金属离子选自Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、 Fe2+、Pb2+Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、Bi和Po,优选Co2+、Zn2+、Ni2+、Pb2+、Al3+、Al2+WSn2+，例如 Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2mAl3+。14. 根据权利要求12或权利要求13的用途，其中所述ACE2底物选自AngII和 Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-〇H〇15. 用于制备根据权利要求1-11中任一项的ACE2多肽群体的方法，其包括下述步骤： a. 在细胞系统中表达ACE2多肽； b. 分离所表达的多肽； c. 通过添加金属螯合剂去除在所述活性位点中结合的金属离子中的一些或全部。16. 根据权利要求15的方法，其中所述金属螯合剂选自EDTA、EGTA、8-羟基喹啉、菲咯 琳和/或^?疏基丙醇。17. 根据权利要求16的方法，其中所述金属螯合剂以10至1000过量(与多肽相比较） 存在。18. -种包含根据权利要求1-11中任一项的ACE2多肽群体的组合物，其中所述组合 物包含的总锌或其他金属离子与ACE2的摩尔比小于1:1，小于95:1、彡0. 50:1、彡0. 45:1、 < 0· 40:K0· 35:K0· 30:K0· 25:K0· 20:K0· 15:K0· 10:K0· 05:1、 彡 0· 02:1 或彡 0· 01:1。19. 一种包含根据权利要求1-11中任一项的ACE2多肽群体的组合物，其中所述组合物 包含与所述组合物中的锌摩尔量相比较10至1000摩尔过量的金属螯合剂。20. 根据权利要求10的ACE2多肽群体，其中所述活性位点由选自下述的过渡金属离子 或后过渡金属离子占据：Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、Pb2+Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、Bi 和P〇,优选Co2+、Zn2+、Ni2+、Pb2+、Al3+、Al2+和Sn2+，例如Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+和A1 3+。21. 根据权利要求1-9中任一项的ACE2多肽群体，其中未被锌占据的所述活性位点 由选自下述的一种或多种过渡金属离子或后过渡金属离子占据：Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、 卩〇3+、卩62+、卩132+厶1、63、111、511、1'1、？13、81和？〇，优选(：〇2+、2112+、附2+、？132+、厶13+、厶12+和5112+，例 如Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+和Al3+。22. 根据权利要求20或21的ACE2多肽群体，其中所述金属离子：ACE2多肽的摩尔比 为多 0· 10:1、多 0· 15:1、多 0· 20:1、多 0· 25:1、多 0· 30:1、多 0· 35:1、多 0· 40:1、多 0· 45:1、 多 0· 50:1、多 0· 55:1、多 0· 60:1、多 0· 65:1、多 0· 75:1、多 0· 80:1、多 0· 85:1、多 0· 90:1、 彡 0· 92:1、彡 0· 95:1、彡 0· 98:1、彡 0· 99:1 或约 1. 00:1。23. 根据权利要求20-22中任一项的ACE2多肽群体，其中所述ACE2多肽是人ACE2多 肽。24. 根据权利要求20-23中任一项的ACE2多肽群体，其中所述ACE2多肽的氨基酸序列 由SEQIDNo: 1的氨基酸1至740、或SEQIDNo: 1的氨基酸18至740、或SEQIDNo: 1 的氨基酸18至615组成。25. 根据权利要求20-24中任一项的ACE2多肽群体，其中所述ACE2多肽以二聚体形式 存在。26. 根据权利要求20-25中任一项的ACE2多肽群体，其中所述ACE2多肽在独立地选 自下述的一个或多个位点处是糖基化的：SEQIDNO: 1的Asn53、Asn90、Asnl03、Asn322、 Asn432、Asn546、Asn690。27. 根据权利要求20-26的ACE2多肽群体，其中所述ACE2多肽具有按重量计大于20% 的总糖含量。28. 用于制备根据权利要求20-27中任一项的ACE2多肽群体的方法，其包括下述步 骤： a. 在细胞系统中表达ACE2多肽； b. 分离所表达的多肽； c. 通过添加金属螯合剂去除在所述活性位点中结合的金属离子中的一些或全部 d. 使所得到的ACE2多肽与包含选自下述的过渡金属离子或后过渡金属离子的溶液 接触：Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、Pb2+Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、Bi和Po,优选Co2+、 Zn2+、Ni2+、Pb2+、Al3+、Al2+WSn2+，例如Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+和Al3+。29. 根据权利要求20-27中任一项的ACE2多肽群体切割底物的用途。30. 药物组合物，其包含如权利要求1-11或权利要求20-27中任一项中定义的ACE2多 肽群体和药学可接受的载体或赋形剂。31. 用于疗法中的如权利要求1-11或权利要求20-27中任一项中定义的ACE2多肽群 体。32. 用于治疗或预防选自下述的疾病的如权利要求1-11或权利要求20-27中任一项中 定义的ACE2多肽群体：高血压(包括血压升高)、充血性心脏衰竭、慢性心脏衰竭、急性心脏 衰竭、收缩性心脏衰竭、心肌梗塞、动脉硬化、肾衰竭、肾功能衰竭、以及肺疾病例如成人呼 吸窘迫综合征（ARDS)、急性肺损伤（ALI)、慢性阻塞性肺疾病（COPD)、肺动脉高血压、肾纤 维化、慢性肾功能衰竭、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、急性肾损伤和多器官功能障碍 综合征。33. 如权利要求1-11或权利要求20-27中任一项中定义的ACE2多肽群体在制造用于 治疗或预防选自下述的疾病的药剂中的用途：高血压(包括血压升高)、充血性心脏衰竭、慢 性心脏衰竭、急性心脏衰竭、收缩性心脏衰竭、心肌梗塞、动脉硬化、肾衰竭、肾功能衰竭、以 及肺疾病例如成人呼吸窘迫综合征（ARDS)、急性肺损伤（ALI)、慢性阻塞性肺疾病（COPD)、 肺动脉高血压、肾纤维化、慢性肾功能衰竭、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、急性肾损伤 和多器官功能障碍综合征。34. -种治疗或预防选自下述的疾病的方法：高血压(包括血压升高)、充血性心脏衰 竭、慢性心脏衰竭、急性心脏衰竭、收缩性心脏衰竭、心肌梗塞、动脉硬化、肾衰竭、肾功能 衰竭、以及肺疾病例如成人呼吸窘迫综合征（ARDS)、急性肺损伤（ALI)、慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、肺动脉高血压、肾纤维化、慢性肾功能衰竭、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、急 性肾损伤和多器官功能障碍综合征，其包括给有此需要的患者施用有效量的如权利要求 1-11或权利要求20-27中任一项中定义的ACE2多肽群体。
【专利摘要】本发明涉及经修饰的血管紧张素转换酶2（ACE2）多肽及其药物和分析用途。特别地，本发明涉及Zn2+耗尽、不含Zn2+、混合金属和金属离子取代的ACE2，以及用于制造这些变体的方法及其用途，例如这些ACE2变体的治疗和分析用途。
【IPC分类】C12N9/48, A61K38/48
【公开号】CN105263512
【申请号】CN201480012988
【发明人】H.洛伊布纳, B.佩巴尔, M.舒斯特, S.施特兰纳
【申请人】阿派隆生物制剂股份公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年1月13日
【公告号】CA2897251A1, EP2943216A1, US20150353910, WO2014108530A1