) ;13CNMR(100MHz，CD30D) δ :123.7(C-l)，132.6(C-2，C-6) ，114. 8(C-3，C-5)，165.2(04)，130.1(01，），131.0(02，，6，），116.3(03' ,05，），157.1 (C-f ),167. 9(C-1" )，66. 9(C-2" ),35.4(C-3" )，56. O(-OMe)。
[0028] 实施例2 :茴香酸对羟基苯乙酯对顺铂致HK-2细胞肾损伤模型的保护作用
[0029] 1.材料与方法
[0030] 1. 1细胞人肾小管上皮细胞HK-2,购自中国典型培养物保藏中心。
[0031] 1.2主要试剂及仪器
[0032] 顺钼购自sigma公司；达尔伯克必需基本培养液（Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)/F12培养液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS)、膜蛋白酶购自美国Gibco 公司；MTT购自碧云天公司。
[0033] 1· 3HK-2细胞的培养
[0034] HK-2细胞在含10% FBS的DMEM/F12培养液中进行常规培养，5% C02, 37°C培养至 融合期的细胞用0. 25%胰酶消化，传代，取对数生长的细胞进行实验。
[0035] 1. 4茴香酸对羟基苯乙酯对HK-2细胞生长的影响：
[0036] 取对数生长期HK-2细胞，以IX 104cells/100 μ 1/孔接种于96孔培养板中，待细 胞生长至80%以上，换为无血清培养基培养12h使处于同步状态，分别加入6. 25,12. 5, 25， 50,100,150 μ g/ml各种浓度茴香酸对羟基苯乙酯于常规条件下培养，对照组：在正常培养 基中培养，24h后置于倒置显微镜下观察细胞形态变化，每孔加入MTT溶液10 μ 1，在细胞培 养箱中继续孵育4h，吸弃上清，加入150 μ 1 DMS0溶解甲瓒，使用酶标仪以570nm为检测波 长，630nm为参比波长，读取吸光度值，每组设6个复孔，各组取平均值，实验重复3次，实验 结果见表1。
[0037] 表1茴香酸对羟基苯乙酯对正常HK-2细胞生长的影响0D值x±s
[0039] 与正常组比较* :P < 0· 05
[0040] 由表1结果可知，茴香酸对羟基苯乙酯对正常HK-2细胞的生长与对照组相比没有 明显的影响，安全性高。
[0041] 1.5药物保护作用
[0042] 取对数生长期HK-2细胞，以1 X 104cells/100 μ 1/孔接种于96孔培养板 中，待细胞生长至80 %以上，换为无血清培养基培养12h使处于同步状态，分别加人 80 μ mol .L-1DDP，同时分别加入0,6. 25,12. 5, 25, 50,100,150 μ g/ml各种浓度茴香酸对羟 基苯乙酯常规条件培养，对照组：在正常培养基中培养，24h后置于倒置显微镜下观察细胞 形态变化，每孔加入MTT溶液10 μ 1，在细胞培养箱中继续孵育4h，吸弃上清，加入150 μ 1 DMS0溶解甲瓒，使用酶标仪以570nm为检测波长，630nm为参比波长，读取吸光度值，每组设 6个复孔，各组取平均值，实验重复3次，实验结果见表2。
[0043] 表2茴香酸对羟基苯乙酯对肾损伤细胞的保护作用
[0045] 与正常组比较## :P < 0· 01 ;与模型组比较* :ρ〈0· 05 :P < 0· 01
[0046] 由表2结果可知，模型组相比对照组具有显著差异，表明顺铂致HK-2细胞肾损伤 模型构建成功。而在茴香酸对羟基苯乙酯药物浓度为50、100 μ g/ml时，其对肾损伤细胞具 有显著的保护作用，表明茴香酸对羟基苯乙酯能够应用于肾损伤保护药物的制备中。
[0047] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 茴香酸对羟基苯乙酯在制备肾损伤保护药物中的应用。2. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肾损伤为顺铂所致肾损伤。3. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述茴香酸对羟基苯乙酯从羌活中提取获 得。4. 根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述茴香酸对羟基苯乙酯由以下方法提取 分离获得： 步骤1、粉碎羌活根茎，加入乙醇溶液提取，提取液过滤、浓缩后加盐酸调节pH为2,加 热回流并浓缩蒸干获得粗提物； 步骤2、粗提物加入乙醇溶液复溶，通过大孔树脂柱吸附，依次水洗脱4个柱体积，40% 乙醇洗脱3个柱体积，60%乙醇洗脱6个柱体积，收集60%乙醇洗脱液，除去溶剂，浓缩至浸 膏，然后加入乙酸乙酯溶解、过滤，滤液除去溶剂，浓缩、干燥，获得羌活提取物； 步骤3、羌活提取物加甲醇溶解后，加入等量的粗硅胶中搅拌均匀，烘干后倒入到含 4~5倍量的200-300目硅胶柱中；石油醚平衡D-101柱子以后，利用石油醚-乙酸乙酯 50:1、20:1、10:1各洗脱4个柱体积，收集10:1洗脱部位浓缩蒸干，加甲醇溶解后，离心，取 上清液，利用高压制备液相色谱进行制备分离，获得茴香酸对羟基苯乙酯。5. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤1所述羌活根茎与乙醇溶液的体积 质量比为lg:6-10mL。6. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤1所述乙醇溶液的体积百分浓度优 选为70%。7. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述高压制备液相色谱条件如下： 安捷伦1260型制备色谱仪，色谱柱为FujiC18(250X50mm);流动相为乙腈-水；检 测波长为310nm;洗脱程序为0~60min，乙腈30%，水70% ;流速为30mL·minS柱温为 3(TC〇8. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤2所述粗提物加入乙醇溶液复溶为 粗提物加入羌活根茎总重1倍量的40%乙醇溶液溶解。9. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述大孔树脂柱为D-101型大孔树脂 柱。10. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述大孔树脂柱重量为羌活根茎总重 的2倍。
【专利摘要】本发明涉及中药技术领域，本发明公开茴香酸对羟基苯乙酯在保护肾损伤细胞中的应用，从而为临床上防止肾损伤提供多一种安全有效的用药选择。茴香酸对羟基苯乙酯在安全剂量内能够有效地保护肾损伤细胞，可进一步开发为肾损伤保护药物，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】A61K31/216, A61P13/12
【公开号】CN105287474
【申请号】CN201510770791
【发明人】萧伟, 罗鑫, 王雪晶, 王红梅, 赵祎武, 黄文哲, 王振中, 周习
【申请人】江苏康缘药业股份有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月12日