一种胶原基软骨支架的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医用生物材料技术，尤其涉及一种胶原基软骨支架。
【背景技术】
[0002]关节软骨损伤是临床常见疾病，由运动创伤、交通事故及各种关节炎疾病等引起。软骨一旦损伤很难修复。目前临床上用于治疗软骨缺损的常用方法有微骨折术、自体非负重区软骨移植或异体软骨移植、自体软骨细胞移植技术，但是各有其缺陷，比如微骨折术形成的多为纤维软骨组织，长期修复效果不理想；自体非负重区软骨移植造成二次损伤，异体软骨移植具有免疫排斥和传播疾病风险；自体软骨细胞移植需二次手术，而且费用昂贵。
[0003]组织工程技术的运用和医用生物材料的发展为关节软骨损伤的修复带来新的希望。其中以生物支架材料为细胞载体的基质诱导自体软骨细胞移植(MACI)技术为代表，进一步解决了临床治疗中存在的问题。此类技术均以生物支架材料为基础，再复合组织工程其他要素(种子细胞、生长因子)构成组织工程与再生治疗技术用于临床治疗。
[0004]当今应用的多是高分子材料或是胶原海绵等支架传递软骨细胞修复软骨缺损，但医用高分子材料生物相容性差且其降解产物对组织有破坏性，而单层胶原海绵力学性能差，而且修复的软骨缺损可能会导致软骨骨化，目前多层结构的制备方法存在结构形态不稳定的缺陷，容易造成其植入体内后层与层之间分离。
【发明内容】
[0005]有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种胶原基软骨支架，具有稳定的结构形态，力学性能优异，植入体内后层与层之间不易分离，且生物相容性良好。
[0006]为实现上述目的，本发明提供了一种胶原基软骨支架，其特征在于，其制备方法包括以下步骤:
[0007](a)将平铺的胶原溶液冷冻成型后经高渗缓冲溶液浸泡脱水，挤压成膜；
[0008](b)在该膜表面再平铺一层胶原溶液，冷冻干燥；
[0009](c)用交联剂整体交联，水洗并冷冻干燥，即得所述胶原基软骨支架。
[0010]优选地，所述胶原溶液的浓度为5?40mg/ml。
[0011]优选地，所述步骤(a)和所述步骤(b)中胶原溶液的平铺厚度为2?8mm。
[0012]胶原pH偏酸性，为了调节胶原中残留的酸性物质而获得结构更优的胶原基软骨支架，一般可选用弱碱性的缓冲溶液，再加入中性盐以提高离子强度，形成高渗缓冲溶液；优选地，所述高渗缓冲溶液为含质量浓度为50?340g/L的氯化钠或氯化钾，pH为7?8的缓冲溶液；进一步地，所述缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液、巴比妥钠-盐酸缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液。需要说明的是，在上述缓冲范围内存在多种类型且可行的缓冲试剂，本发明在此不再穷举。
[0013]根据胶原中水分的含量，需要调节浸泡脱水时间，优选地，浸泡脱水时间为12?24小时。
[0014]为了快速排出胶原中的水分和盐分，又有利于得到均匀的胶原膜，优选地，所述步骤(a)中挤压成膜步骤使用梯度压力；进一步地，所述梯度压力为:50?lOOKg压力维持30?60秒、100?150Kg压力维持30?60秒、150?200Kg压力维持30?60秒、200?500Kg压力维持30?60秒。
[0015]优选地，所述交联剂为戊二醛、京尼平、1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺或1，4- 丁二醇二缩水甘油醚。
[0016]相比于现有技术的致密层采用常规的冷冻干燥再压紧方式，本发明利用蛋白在高浓度盐溶液中物理变性和盐析的原理，使胶原在高渗溶液作用下从溶液中析出，然后在压力的作用下排出其中的水分，可以制备出致密的胶原膜，再通过一体化构建技术，在致密层上形成一疏松多孔层，该技术下，两层之间能实现自然过渡、无缝连接，使其双层结构更加完整，两层之间连接更加紧密，不仅增加了支架的力学性能，更能有效地防止支架在植入到体内后两层产生分离。
【附图说明】
[0017]图1为胶原基软骨支架示意图，其中101为致密层，102为多孔疏松层；
[0018]图2为实施例1的切开面扫描电镜图；
[0019]图3为胶原基软骨支架植入到经关节软骨缺损造模的新西兰大白兔的膝关节软骨缺损处6周、12周后的组织学HE、S0染色照片，a、c为6周时间点染色照片，b、d为12周时间点染色照片，a、b为组织学HE染色照片，c、d为组织学S0染色照片，放大倍数均为40倍(标尺为20 μ m) ο
【具体实施方式】
[0020]以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
[0021]实施例1
[0022](1)将浓度为20mg/ml的胶原溶液平铺至尺寸为100mmX 100mmX 5mm的聚四氟乙烯凹槽模具中，放-20°C下16小时冷冻成型。
[0023](2)将冷冻后的胶原浸入含NaCl浓度为232g/L的磷酸盐缓冲溶液(磷酸氢二钠(Na2HP04) 2.436g/L 和磷酸二氢钾(ΚΗ2Ρ04) 0.8g/L，pH 调至 7.4)中 24 小时。
[0024](3)将脱水后的胶原整体用梯度压力(70?80Kg 30秒、100?llOKg 30秒、140?150Kg 30秒、200?210Kg 60秒)挤压成膜，再在致密膜上平铺浓度为5mg/ml的胶原溶液至5_厚度。
[0025](4)将双层胶原整体在_30°C冷冻16小时，再在冷冻干燥机中抽干48小时。
[0026](5)将冻干后的双层胶原用EDC-NHS (EDC和NHS浓度分别为20mg/ml和5mg/ml)交联3小时。
[0027](6)将交联后的双层支架水洗3天，每天换水4次，再次在_30°C冷冻16小时，再在冷冻干燥机中抽干60小时。
[0028](7)将冻干后的支架剪切成所需的尺寸，密封包装，经20KGy的辐照剂量(γ射线)灭菌，即获得所述的胶原基软骨支架。
[0029]实施例2
[0030](1)将浓度为5mg/ml的胶原溶液平铺至尺寸为lOOmmX 100mmX 3mm的聚四氟乙稀凹槽模具中，放-80°C下12小时冷冻成型。
[0031 ] (2)将冷冻后的胶原浸入含NaCl浓度50g/L的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(含枸橼酸1.92g/L和磷酸氢二钠25.8g/L，pH调至8.0)中12小时。
[0032](3)将脱水后的胶原整体用梯度压力(50?70Kg 30秒、100?llOKg 30秒、150?170Kg 30秒、200?250Kg 30秒)挤压成膜，再在致密膜上平铺浓度为5mg/ml的胶原溶液至3_厚度。
[0033](4)将双层胶原整体在_20°C冷冻8小时，再在冷冻干燥机中抽干12小时。
[0034](5)将冻干后的双层胶原用浓度为0.05% (w/v)的戊二醛交联8小时。
[0035](6)将交联后的双层支架水洗2天，每天换水3次，再次在_20°C冷冻12小时，再在冷冻干燥机中抽干24小时。
[0036](7)将冻干后的支架剪切成所需的尺寸，密封包装，经lOKGy的辐照剂量(γ射线)灭菌，即获得所述的胶原基软骨