支架。
[0037]实施例3
[0038](1)将浓度为40mg/ml的胶原溶液平铺至尺寸为lOOmmX lOOmmX 8mm的聚四氟乙烯凹槽模具中，放-30°C下18小时冷冻成型。
[0039](2)将冷冻后的胶原浸入含KC1浓度340g/L的Tri s_盐酸缓冲液(含Tri s
6.057g/L 和 0.042mol/L 盐酸，pH 调至 7.0)中 24 小时。
[0040](3)将脱水后的胶原整体用梯度压力(80?lOOKg 30秒、120?150Kg30秒、180?200Kg 30秒、400?500Kg 30秒)挤压成膜，再在致密膜上平铺浓度为20mg/ml的胶原溶液至8mm厚度。
[0041](4)将双层胶原整体在_80°C冷冻20小时，再在冷冻干燥机中抽干48小时。
[0042](5)将冻干后的双层胶原用浓度为lmmol/L的京尼平进行交联6小时。
[0043](6)将交联后的双层支架水洗4天，每天换水6次，再次在_80°C冷冻24小时，再在冷冻干燥机中抽干96小时。
[0044](7)将冻干后的支架剪切成所需的尺寸，密封包装，经25KGy的辐照剂量(γ射线)灭菌，即获得所述的胶原基软骨支架。
[0045]实施例4
[0046](1)将浓度为30mg/ml的胶原溶液平铺至尺寸为lOOmmX lOOmmX 4mm的聚四氟乙烯凹槽模具中，放-30°C下20小时冷冻成型。
[0047](2)将冷冻后的胶原浸入含NaCl浓度108g/L的巴比妥钠-盐酸缓冲液(含巴比妥钠7.16g/L和0.027mol/L盐酸，pH调至7.2)中20小时。
[0048](3)将脱水后的胶原整体用梯度压力(50?80Kg 45秒、110?130Kg 45秒、150?170Kg 60秒、250?350Kg 60秒)挤压成膜，再在致密膜上平铺浓度为15mg/ml的胶原溶液至4_厚度。
[0049](4)将双层胶原整体冷冻干燥48小时。
[0050](5)将冻干后的双层胶原用浓度为2% (wt% )、pH为8.5-10.5的BDDGE进行交联3小时。
[0051](6)将交联后的双层支架水洗4天，每天换水6次，再次冷冻干燥96小时。
[0052](7)将冻干后的支架剪切成所需的尺寸，密封包装，经20KGy的辐照剂量(γ射线)灭菌，即获得所述的胶原基软骨支架。
[0053]实施例5
[0054]如图1所示，本发明提供的胶原基软骨支架分为致密层101与多孔疏松层102，两者复合而成，致密层101与多孔疏松层相连通，双层结构既具有良好生物学性能、足够相通的细胞容纳空间，又具有阻挡作用；多孔疏松层102可以让细胞自由生长和黏附，致密层101可以阻挡其他细胞的进入，同时不妨碍营养物质的自由进出。
[0055]选取实施例1制备的胶原基软骨支架对其切开面进行电镜扫描，如图2所示。由图2中可以看出，致密层和多孔疏松层均匀过度且连通，实现了无缝连接，两层的连接非常自然，且一体化结构完整。另外还可以看出，多孔疏松层中含较高的孔隙率，孔孔连通，孔径为50?600微米，以利于营养物质的运输，可供细胞黏附和生长。
[0056]实施例6
[0057]胶原基软骨支架动物实验:
[0058]将实施例1中制备的胶原基软骨支修剪成直径为4_、高度为3mm的圆柱状，经γ射线灭菌。将新西兰大白兔按完全随机方法分为两组，用10%的水合氯醛以4mL/kg剂量一半经耳缘静脉注射，一半腹腔注射。麻醉成功后，于后腿股骨滑车部位剔毛备皮，以仰卧姿势固定于手术台上；内侧髌骨旁入路法打开后退膝关节，膑骨横向脱位，露出股骨滑车，用不锈钢打孔器在股骨滑车上打出直径为4mm的环形孔，孔深2.5_3_。将修剪好的胶原基软骨支架样品植入到缺损区域(致密层朝向关节面)。手术后，立即将其放回笼中，分笼饲养。术后三天内每天肌肉注射400，000U青霉素钠。所有试验兔均常规饲养。术后6周、12周分别对动物进行安乐死，取出经过手术的股骨滑车关节，进行组织学HE染色和S0染色。
[0059]结果如图3中所示，6周时缺损区被软骨样组织填充，有软骨基质(GAG)和软骨下骨形成；12周时有大量的软骨基质形成，并且伴随着软骨下骨和潮线基本恢复，新生组织与周围正常软骨连接良好。
[0060]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1.一种胶原基软骨支架，其特征在于，其制备方法包括以下步骤: (a)将平铺的胶原溶液冷冻成型后经高渗缓冲溶液浸泡脱水，挤压成膜； (b)在该膜表面再平铺一层胶原溶液，冷冻干燥； (c)用交联剂整体交联，水洗并冷冻干燥，即得所述胶原基软骨支架。2.如权利要求1所述的胶原基软骨支架，其特征在于，所述胶原溶液的浓度为5?40mg/ml。3.如权利要求1所述的胶原基软骨支架，其特征在于，所述步骤(a)和所述步骤(b)中胶原溶液的平铺厚度为2?8mm。4.如权利要求1所述的胶原基软骨支架，其特征在于，所述高渗缓冲溶液为含质量浓度为50?340g/L的氯化钠或氯化钾，pH为7?8的缓冲溶液。5.如权利要求4所述的胶原基软骨支架，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液、巴比妥钠-盐酸缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液。6.如权利要求1所述的胶原基软骨支架，其特征在于，浸泡脱水时间为12?24小时。7.如权利要求1所述的胶原基软骨支架，其特征在于，所述步骤(a)中挤压成膜步骤使用梯度压力。8.如权利要求7所述的胶原基软骨支架，其特征在于，所述梯度压力为:50?lOOKg压力维持30?60秒、100?150Kg压力维持30?60秒、150?200Kg压力维持30?60秒、200?500Kg压力维持30?60秒。9.如权利要求1所述的胶原基软骨支架，其特征在于，所述交联剂为戊二醛、京尼平、1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺或1，4- 丁二醇二缩水甘油醚。
【专利摘要】本发明公开了一种胶原基软骨支架，其制备方法包括以下步骤：(a)将平铺的胶原溶液冷冻成型后经高渗缓冲溶液浸泡脱水，挤压成膜；(b)在该膜表面再平铺一层胶原溶液，冷冻干燥；(c)用交联剂整体交联，水洗并冷冻干燥，即得所述胶原基软骨支架。本发明提供的胶原基软骨支架，致密层和多孔疏松层两层之间能实现自然过渡、无缝连接，使其双层结构更加完整，两层之间连接更加紧密，不仅增加了支架的力学性能，更能有效地防止支架在植入到体内后两层产生分离。
【IPC分类】A61L27/40, A61L27/56
【公开号】CN105381504
【申请号】CN201510789943
【发明人】徐国伟, 赵洪石, 马南
【申请人】浙江星月生物科技股份有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月17日