r>[0096]
[0097] 注：CCCP(羰基氰化氯苯腙），为阳性对照品。
[0098] 实验结果：
[0099] 人肝原代肝细胞ΜΤΤ、线粒体膜电位、LDH释放实验结果分别如图1、图2和图3所 示，结果表明，与来氟米特相比，泰瑞米特钠和泰瑞米特对人肝原代细胞活性抑制有显著性 差异。其中来氟米特IC50 = 769. 6μM，而泰瑞米特钠和泰瑞米特对人肝原代细胞活性抑制 作用极低，无法计算IC50。泰瑞米特钠和泰瑞米特对人肝细胞线粒体膜电位几乎没有作用， 在最高药物浓度（500μM)下对探针化合物TMRE摄取仍然没有影响，而来氟米特在500μΜ 以上即可明显影响探针物TMRE摄取。泰瑞米特钠、泰瑞米特和来氟米特在较低浓度均可以 促使人原代肝细胞释放LDH，三者的作用强度相近；在药物浓度>300μΜ时，泰瑞米特和来 氟米特导致的LDH释放随着药物浓度的增加而增加，但泰瑞米特钠导致的LDH释放并未随 着药物浓度的增加而增加。
[0100] 以大鼠肝细胞为实验系统，ΜΤΤ试验结果表明，泰瑞米特钠、泰瑞米特和来氟米 特对大鼠肝原代细胞活性抑制率（IC50)相近，其中来氟米特略高（316.8μΜ，335.ΙμΜ 和354. 7μΜ)。线粒体膜电位试验结果表明，泰瑞米特钠对该细胞线粒体影响与泰瑞米特 相近，在最高给药剂量（500μΜ)仅仅使探针化合物TMRE的摄取略有下降；而来氟米特在 300μΜ即可使探针物TMRE摄取降至对照的50%以下，说明泰瑞米特钠对于线粒体的损伤 作用明显低于来氟米特。泰瑞米特钠、泰瑞米特和来氟米特在较低浓度均可以促使大鼠原 代肝细胞释放LDH，随着药物浓度增加，LDH的释放增加也相近。
[0101] 上述研究结果提示，泰瑞米特钠、泰瑞米特和来氟米特的肝细胞毒性存在物种差 异。三种药物对大鼠肝细胞的毒性相近，与来氟米特相比，泰瑞米特钠和泰瑞米特对大鼠肝 细胞线粒体的损伤作用相对较轻。就人肝细胞而言，泰瑞米特钠和泰瑞米特的毒性显著低 于来氟米特，与来氟米特和泰瑞米特相比，泰瑞米特钠在药物浓度>300μΜ时导致的LDH释 放不会随着药物浓度的增加而增加。
[0102] 实施例3
[0103] 泰瑞米特钠在雌性MRL/lpr小鼠自发性红斑狼疮模型中的疗效作用观察
[0104] 本研究的目的是观察不同剂量受试化合物泰瑞米特钠对狼疮模型动物的治疗作 用，并与糖皮质激素和来氟米特进行比较。本研究所用动物模型为MRL/lpr小鼠，该模型小 鼠由于Fas基因缺失，导致自身反应性⑶4+T细胞不能通过凋亡途径清除，进而产生类似人 类SLE的自身免疫疾病症状，在国际药理学研究领域被广泛应用于SLE发病机制的研究，以 及药物药效学的研究。考虑到雌性MRL/lpr小鼠通常在8周龄至12周龄之间开始出现SLE 的疾病症状，本研究自模型小鼠10-11周龄起给予药物干预，连续给药8周。
[0105] 试验设计：
[0106] 分组：
[0107] 10-11周龄模型小鼠，根据体重及蛋白尿水平随机分为6组：
[0108] 模型对照组（Vehicle) :12 只 *
[0109] PNS给药组 2mg/kg:12 只 *
[0110] 来氟米特给药组30mg/kg:13只
[0111] 泰瑞米特钠给药组40mg/kg:13只
[0112] 泰瑞米特钠给药组30mg/kg:13只
[0113] 泰瑞米特钠给药组20mg/kg:13只
[0114] 正常对照组：相同周龄BALB/c林小鼠11只
[0115] *模型对照组与PNS给药组最初随机分组为每组13只MRL/lpr小鼠，但在实验 开始给药的第二周由于灌胃给药的操作失误，致使上述每组各有1只小鼠发生意外死亡减 员，该死亡与狼疮疾病或药物性死亡无关，故将模型对照组与PNS给药组的实验小鼠数量 调整为每组12只MRL/lpr小鼠。
[0116] **试验中选用非疾病动物品系BALB/c小鼠，给予溶剂作为对照组，可作为部分指 标（脾脏重量、淋巴结重量、皮肤损伤、肾脏免疫复合物沉积等）阴性对照。
[0117] 给药：灌胃，每天一次，一周给药7次，给药期8周。给药体积为0.lml/10g体重。 每周根据体重调整给药剂量。
[0118] 试验指标检测：
[0119] 常规观察和检杳:
[0120] 死亡和濒死：给药期所有动物每天观察1次。
[0121] 临床观察：给药期所有动物每天观察1次。
[0122] 体重：所有动物分组前称重1次，给药期每周称重1次。
[0123] 尿蛋白检测：
[0124] 采用考马氏亮蓝法检测尿液中蛋白浓度。
[0125] 皮肤损伤评分、淋R结肿大评分:
[0126] 皮肤损伤：0分：无损伤；1分：面部及耳部小面积损伤；2分：直径<2cm的中度损 伤（面部、耳部以及背部）；3分：直径>2cm的严重损伤（面部、耳部以及背部）。
[0127] 淋巴结肿大* :0分：无可见的淋巴结肿大；1分：单一部位，小体积淋巴结肿大；2 分：2处不同部位，中等体积淋巴结肿大；3分：3处或以上不同部位，较大体积淋巴结肿大。
[0128] *存活动物于给药期末颈脱白处死，分离体表淋巴结进行称重和拍照对比。
[0129] 组组疽理堂检查:试验结束时，处死动物，取左侧肾脏固定于10%福尔马林中，之 后进行石蜡包埋，切片厚度），H&E染色后显微镜下观察。委托上海药物研究所安全 评价中心专业病理分析师评价肾脏组织学改变。
[0130] 免疫荧光检测肾肿免疫复合物沉积：试骀终点(试验终点前死亡个体的肾脏也同 时进行评价），取右侧肾脏冻在0CT包埋剂中，-80°c保存。临测前，制备冰冻切片出μm厚 度），冰冷的丙酮中固定15分钟后，晾干，加入含2%BSA的PBS室温湿盒中封闭1小时后， 加FITC-rabbitanti-mIgG(l:50稀释）。4°C避光1小时后，充分洗涤，封片，荧光显微镜 拍照。
[0131]血清anti-dsDNA自身抗体检测:PBS稀释dsDNA(10μg/ml),加入ELISA板， 50μ1/孔，密封后于4°C孵育18小时；洗液洗ELISA板3次，加入封闭液，100μ1/孔，密封 后于室温孵育1小时；洗板3次，加入标准品及样品，50μ1/孔，密封后于室温孵育1小时； 洗板3次，加入HRP酶联兔抗小鼠二抗rabbitanti-mouseIgG(H+L)，50μ1/孔，室温1小 时；洗板3次，加入ΤΜΒ底物，50μ1/孔，室温反应15-30分钟；加入25-30μ1H2S04终止液 终止显色反应。酶标仪450/570nm处读取0D值。
[0132] ELISA法检测培养h清中细朐因子含量:根据ELISA试剂盒中的相关说明进行试 验。过程如下：用包被稀释液将抗体稀释后加入ELISA板，50μ1/孔，密封后于4°C冰箱孵 育过夜；洗液洗ELISA板3次，加入封闭液，100μ1/孔，室温1小时；洗板3次，加入标准品 及样品，50μ1/孔，密封后室温放置2小时；洗板3次，加入二抗，50μ1/孔，室温放置1小 时；洗板3次，加入HRPg每，50μ1/孔，室温放置1小时；洗板3次，加入ΤΜΒ底物，50μ1/ 孔，室温反应15-30分钟；加入25μ1/孔H2S04终止液终止显色反应。酶标仪450/570nm处 读取0D值，根据标准品计算样品中细胞因子的含量。
[0133]血清牛化指标检测:试验终点血清用双蒸水按比例稀释后，采用HITACHI-7020全 自动生化分析仪检测白蛋白（ALB)、尿素氮（BUN)和肌酐（CREA)水平。
[0134]流式细朐术检测细朐表面标志：脾细朐用FACS洗液洗1次。5X105细胞使用 2. 4G2anti_Fcreceptor抗体（anti-〇)16/a)32)阻断非特异性结合。加入突光标记抗体于 冰上避光作用20分钟；细胞用FACS洗液洗1次，重悬于0. 5mlFACS洗液中，流式细胞仪检 测，Flowjo软件（TreeStar，Ashland，0R)分析。
[0135]流式细朐术检测朐内细朐因子及转录因子：1X106个细朐俅用2.4G2anti_Fc receptor抗体阻断非特异性结合。加入anti-〇)4、anti-a)3、anti-a)25突光抗体，冰上避 光作用20分钟后用FACS洗液洗2次，重悬于0. 5ml固定液中，固定1小时（或固定过夜）后 加入穿膜缓冲液洗2遍后划散细胞，加入FoxP3、IL-17及IFN-γ的荧光标记抗体及各自相 应的同型对照（isotypecontrol)，继续染色1小时。随后用FACS洗液洗1次，离心收集细 胞，重悬于FACS洗液中，流式细胞仪检测，Flowjo软件（TreeStar,Ashland,0R)分析。对 于胞内细胞因子染色，细胞需于收集染色前4小时加入50ng/mlPMA、750ng/mlionomycin 及GolgiStop共培养，以产生足量可被检测的细胞因子。
[0136] 实验结果：
[0137] 研究结果显示，试验药物泰瑞米特钠20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg均能够有效改 善模型小鼠的皮损、淋巴结肿大和脾脏肿大等狼疮症状，降低尿蛋白，降低血清抗双链 DNA(dsDNA)抗体及IL-17水平，并有明显的量效关系；血清生化检查显示，治疗终点时泰 瑞米特钠给药组的小鼠血清白蛋白含量明显高于空白对照组，血清肌酐和尿素氮存在下降 的趋势。进一步研究发现，经泰瑞米特钠干预治疗后，模型小鼠脾脏淋巴细胞中DNT细胞 (⑶3+⑶4⑶8_)比例明显降低，调节性T细胞（⑶3+⑶4+⑶25+FoxP3+)比例明显提高，泰瑞米 特钠40mg/kg组小鼠脾脏淋巴细胞中分泌IL-17的DNT细胞（CD3+CD4CD8IL-17+)比例 较模型对照组也显著下降。在给药8周的试验结束时，空白对照组12只小鼠中有3只发病 严重导致死亡，而给药组只有泰瑞米特钠40mg/kg组与20mg/kg组发生小鼠死亡各一只， 30mg/kg组小鼠给药8周内全部存活。狼疮肾炎是系统性红斑狼疮主要且突出的内脏损害， 通过对各组实验小鼠的肾脏进行HE切片染色、经病理学评估发现泰瑞米特钠给药能够显 著减轻MRL/lpr小鼠肾小球肾炎和间质性肾炎的病变程度；而来氟米特（30mg/kg)对MRL/ lpr小鼠肾小球肾炎、间质性肾炎的病理进程无明显的改善作用。
[0138] 具体实验结果如表4和图4-8所示。
[0139] 表4.MRL/lpr小鼠在给药期