病毒RNA合成的影响。将EV71-MZ201405感染畑细胞(M0I = 5)后立 即加入100μΜ螺旋霉素，W未加药物的细胞作为对照，分别于感染后化、地、化及化提取总 RNA，通过反转录-定量PCR(RT-QPCR)测定病毒RNA水平。WGAPDH mRNA水平为内参，将化时 对照细胞的病毒RNA相对丰度设定为1。实验重复Ξ次。
[0018] 图5通过EV71-GFP RNA转染分析螺旋霉素病毒蛋白翻译的影响。将体外转录的病 毒EV71-GFP基因组RNA转染293A细胞，分别用20ιχΜ和lOOiiM螺旋霉素处理细胞，W未经药物 处理的细胞为对照，于转染后1化用巧光显微镜观察GFP的表达情况，每种细胞计数100个视 野，计算平均每个视野中的GFP阳性(GFP+)细胞数。
[0019] 图6螺旋霉素对EV715'UTR发挥翻译功能的影响。(A)双报告基因载体结构示意图， 上游报告基因 firefly lucif erase (F-luc)由宿主细胞帽结合蛋白复合物介导翻译；下游 报告基因 Renilla luciferase(R-luc)由EV71-5'UTR介导翻译。（B)将双报告基因质粒转染 293A细胞，分别加入100μΜ螺旋霉素和四环素作用36h后测定F-luc和R-luc的活性并计算相 对比值，对照细胞中的R-luc/F-luc设定为1。药物处理组的比值为Ξ次独立重复实验的平 均值±SD。
【具体实施方式】
[0020] 为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领 域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应W此限制本 发明的保护范围。
[0021] 药品与试剂
[0022] 本发明所测试的大环内醋类药物均为标准品，购自大连美仑生物技术有限公司； 用DMSO配制成浓度为25.6mM的药物胆存液;使用时分别用含1 ο %血清的DMEM培养基依次进 行2倍稀释，使用终浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.2扣M。试剂包括：1X PBS(化C18g/L，KC10.2g/L，Na2HP042.72g/L，化肥P0424g/L，pH7.2)，DMEM(Gibco)，胎牛 血清(Sigma)，0.05 %TYypsin-EDTA(GIbco)，多聚甲醒(生工生物），结晶紫(珠海贝索生物 技术有限公司），MTT(Sigma)，DMSO(Sigma)，Xba I(Takara)，T7I?iboMAX? Large Scale RNA Production System (Promega), Plasmid Midi Kit(QIAGEN),Trizol reagent (invitrogen)，PrimeScript RT reagent Kit(Takara)，TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金），Lipo2000(Invitrogen)，Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega)。
[0023] 本发明使用的大环内醋类抗生素结构如下：
[0024]
[00巧]细胞及病毒株
[00%] 293A-SCARB2细胞稳定组成型表达EV71的天然受体SCARB2化uman scavenger receptor class B,member 2,清道夫受体B2);横纹肌肉瘤畑细胞和非洲绿猴肾Vero细胞 对EV71高度敏感，广泛用来分离、扩增EV71和CVA16dEV71-GFP为携带报告基因 GFP的从北京 地区分离的毒株;EV71-MZ210405是从广东地区重症手足口病患儿分离得到的高致病性肠 病毒EV71毒株;CVA16-MZ210509是从广东地区重症手足口病患儿分离得到的高致病性柯萨 奇病毒A16毒株;293A细胞用于细胞转染。
[0027]仪器
[002引细胞培养箱(Thermo)，倒置显微镜化eica)，倒置巧光显微镜化eica)，流式细胞仪 (抓Ac州ri? C6)，定量PCR仪（BioRad)，化学发光检测仪(Promega)
[00巧]实施例1
[0030] 将EV71-MZ201405和CVA16-MZ201509分别感染Vero或畑细胞，在不同药物浓度下， 发明人通过流式分析病毒基因组携带的报告基因 GFP的表达情况、观察病毒感染引起的细 胞病变效应(CPE)、W及空斑分析子代病毒的产生情况，评价了上述六种大环内醋类抗生素 对病毒EV71和CAV16的复制是否具有抑制作用、对宿主细胞是否具有保护作用。
[0031] 1.1药物的细胞毒效应:将293A-SCARB、畑W及Vero细胞按1別0^/每孔分别接种于 96孔中，在5%C02、37°C条件下培养过夜，经一系列倍比稀释的大环内醋类药物处理细胞 4化后，用MTT法检测药物对细胞的毒性；W相同条件下培养、未经药物处理的细胞为对照； 每组细胞Ξ个重复孔，计算各组细胞的生长抑制率。生长抑制率=[(对照组平均0D值-实验 组平均0D值)/对照组平均0D值]X 100%。结果显示，所测的六种大环内醋类药物对293A-SCARB2、畑和Vero细胞的CC50均大于256μΜ，而且细胞浓度为256μΜ时未检测到细胞毒性。
[0032] 1.2通过显微镜观察细胞病变效应(巧topathic effect，C阳），检测大环内醋类药 物抗EV71和CVA16、保护细胞的效果:病毒介导的CPE指病毒在细胞内增殖引起的细胞退形 性病变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落等，是判断病毒增殖的最常用指标之 一。将RD细胞接种于96孔中，在5%C02、37°C条件下培养18-2化后，分别将1000TCID50的 EV71-MZ201405和CVA16-MZ201509病毒感染化，更换含有不同浓度和不同种类大环内醋类 抗生素的培养基，置于37°C，5%C02培养箱中培养，每天在显微镜下观察细胞病变状态，当 未加药物的对照细胞出现75% W上病变时，终止实验，观察并记录加药组的C阳程度，C阳的 记录方法为:无0?6为"-"，25%细胞出现病变为"+";25%~50%细胞病变为"++";50%~ 75 %细胞病变为"+++"; 75 %~100 %的细胞病变为"++++"，结果见表1和表2。螺旋霉素、阿 奇霉素、交沙霉素和克拉霉素具有CPE抑制效应，随着药物浓度升高CPE效应逐步减轻、细胞 状态变好，尤其是螺旋霉素效果显著;红霉素和麦迪霉素仅在高药物浓度时出现弱的C阳抑 制效应。
[0033] 表1.大环内醋类药物对EV71(MZ201405)引起的CPE的括抗作用
[0034]
[0037] 1.3流式分析GFP检测大环内醋类药物对EV71-GFP的抗病毒效果:将Vero细胞接种 于96孔板中过夜培养，按M0I = 1P即/cell接种EV71-GFP病毒，感染化后更换为含有高（100μ Μ)、中（40或50μΜ)、低（ΙμΜ)Ξ种浓度的不同大环内醋类抗生素培养基，在5%C02、37°C培养 18-2化后，经膜酶消化、PBS清洗、多聚甲醒固定，用流式细胞仪分析细胞的GFP巧光表达情 况，W未加药物的GFP阳性细胞率作为100%，计算药物处理后的GFP阳性细胞相对百分比， 数值为Ξ次重复实验的平均值±SD。螺旋霉素抑制EV71-GFP表达的效果最显著，其次为阿 奇霉素和交沙霉素，结果见图1。
[003引1.4产毒量减少分析大环内醋类药物对6￥71和(：￥416的抗病毒活性：将6￥71-MZ201405和CVA16-MZ201509(M0I=0.01PFU/cell)分别与畑细胞解育化后去除病毒上清， 分别添加含有不同浓度和不同种类大环内醋类抗生素的培养基，药物浓度呈倍比稀释，分 别为0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128和25641;^未加药物的感染细胞为对照。感染后4她 后收集上清，采用空斑法测定病毒滴度。将对照细胞上清测得的病毒滴度设定为100%，经 药物处理的细胞上清中的相对病毒滴度（％ )=(对照组病毒滴度-药物